糸状藍藻Oscillatoria agardhiiの生理活性ペプチドに関する研究

様 式

6

報 告

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3

表 可 氏 名 佐 野 友 春 学位論文題目￨糸状藍藻 Oscillatoriaagardhiiの生理活性ペプチドに関する研究 公刊論文

(1) "Oscillamide，YA Chymotrypsin Inhibitor from Toxic Oscillatoria agardhii"， ~ano， T. and Kaya， K. TetrahedronLett.， (1995) 36， 5933-5936.

(2) "A 2-Amino-2-Butenoic Acid (Dhb)-ContainingMicrocystin Isolated from Oscillatoria αgardhii，"~ano ， T:. and Kaya， K. TetrahedronLe江，(1995) 36， 8603-8606.

(3) "Oscillapeptin G， a Tyrosinase Inhibitor from Toxic Oscillaotonaαgardhii "， ~ano， T. and Kaya， K. J

.

Nat. Prod.， (1996) 59， 90-92.

(4) "Oscillatorin， A Chymotηpsin Inhibitor from Toxic Oscillatona Agardhii"，包旦.J.and Kaya， K. TetrahedronLett.， (1996) 37， 6873-6876.

(5) "A 3-amino-lO-chloro-2-hydroxydecanoic acid-containing tetrapeptide from Oscillatoria αgGrdhiiH，邑旦よ.and Kaya， K. Ph)附

公刊参考論文

(1) "Synthesisof carbon-bridged pyrimidine cyclonucleosides"， Ueda， T.; Shuto， S;.Sa旦 よ ; Usui， H. and Inoue， H. Nucleic Acid Res. Symposium Series， (1982) 11， 5-9.

(2) "Structure of 2'，3'-O-isopropylidene-6-cyanouridine"， Yamagata， Y; Kobayashi， Y; Okaba， N.; Tomita， K.; Sano， T:.; Inoue， H. and Ueda， T. Nucleosides & Nucleotides， (1983) 2， 335-343.

(3) "Nucleosides and Nucleotides. LIV Synthesis of 6，6'ーcyclo-5'，6'-dideoxyhexofuranosy 1 -uracilsνia radical cyclization of a 6-cyanouridine"， ~ano ， T~; Inoue， H. and Ueda， T. Chem. Pharm. Bull.， (1985) 33， 1856-1860.

(4) "Synthesis of 2'-deoxy-6，2'ィnethano-cyclouridine( Nucleosides and Nucleotides LIX )"， Sano，T.; Inoue， H. and Ueda， T. Chem. Pharm. Bull.， (1985) 33， 3595-3598.

(5) "Synthesis of 6，2'-methano-cyclouridine， a uridine fixed in high-anti conformation( Nucleo -sides and Nucleotides LX)"， ~ano， T.;Shuto， S.; Inoue， H.and Ueda， T. Chem. Pharm. Bull.， (1985) 33， 3617-3622.

(6) "Synthesis of2'-deoxy-6，3'-methano-cyclo-pyrimidine nucleosides"， Yoshimura， Y; Sano，

工

;

Matsuda， A. and Ueda， T. Nucleic Acid Res. Sympo. Series， (1986) 1 7， 53-55.

(7) "Synthesisof6，3'-methanocytidine， 6，3'-methanouridine， andtheir 2'-deoxyribonucleosides (Nucleosides and Nucleotides LXXVII)"， Yoshimura， Y; Sa旦斗_I.;Matsuda， A. and Ueda， T. Chem. Pharm. Bull.， (1988) 36， 162-167.

(8)

I

二 酸 化 窒 素 の 肺 腫 蕩 発 生 促 進 作 用 に 関 す る 実 験 的 研 究 」 嵯 峨 井 勝、市瀬 孝 道、 佐 野 友 春 、 村 上 正 孝 、 藤 井 敬 二 、 大 気 汚 染 学 会 誌 (1990)25，324-333.

(9) "Definitionof total biosynthesis pathway of taurolipids inTetrαhymena ceIls"， Kaya， K. and sano， T:.Biochim. Biophys.Acta， (1991) 1084， 101-104.

(10) "Tetrahydropyranring-containingfatty acid-combined taurine (tetrathermoyltaurine) in the taurolipid fraction ofηtrahymenathermophila，"Kaya， K;.Sa盟

J.

and Shiraishi， F. Biochim. Biophys. Acta， (1992) 1127， 22-27.

(11) "A Method forMicro-Dete口ninationof TotalMicrocystin Content in Waterblooms of

Cyanobacteria(Blue-GreenA1gae)川，Sa旦色エ.;Nohara， K.; Shiraishi， F.and Kaya， K. Intem.1.Environ. Ana.lChem.， (1992) 49， 163-170.

(12) "A Novel Disialoganglioside in Rat Spleen Lymphocytes" ， Nohara， K.; Suzuki， M.; Inagaki， F.;Sano， T:. and Kaya， K.J. Biol. Chem.， (1992) 267， 14982-14986

(13) "Thioic O-acid ester in sulfolipid isolated仕omfreshwater picoplankton cyanobacterium， Synechococcussp."， Kaya， K.; aano， T.;Watanabe， M. M.; Shiraishi， F.and Ito， H. Biochim. Biophys. Acta， (1993) 1169， 39-45.

(14) "An Activation-associated Ganglioside in Rat Thymocytes"， Nohara， K.; a旦旦主主.and Shiraishi， F.よ Bio.lChem.， (1993) 268， 24997-25000.

(15) "Astasin， a novel cytotoxic carbohydrate-conjugated ergosterol from the colorless euglenoid， Astαsia longα"， Kaya， K.; aano， T:. and Shiraishi， F. Biochim. Biophys. Acta， (1995) 1255， 201-204.

(16) "Synthesis ofN -(1-Nitropyren-6-yl and 8-yl)-2'-deoxyribonucleosides"，星空旦己主.and Kaya， K.Chem. Res. Toxico，.l(1995) 8， 699-702.

(17) "Nostocyclin， A Novel 3-Arnino-6-hydroxy-2-piperidone-containing Cyclic Depsipeptide from the CyanobacteriumNostocsp."， Kaya， K.;主主旦0，T.; Beattie， K. A. andCodd， G. A. Tetrahedron Lett.， (1996) 37， 6725-6728. (18)

I

エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ る 新 し い 細 胞毒 性 ス ク リ ー ニ ン グ 法 の 開 発 一培養 株 ヒ ト 白 血 病 細 胞

HL60

へ の 適 用 -

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， 白 石 不 二 雄 、 佐 野 友 春 、 彼 谷 邦 光 ， 環 境 化学， (1996) 6，551-557. その他(総説・単行木等)

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環 境 変 異 源 物 質

1

-ニトロビ レンおよびその代謝物とDNAとの小J'

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物の柿泣」、 佐町'友春，化学と工業，(1991)，44，2152-2153.

様 式 7 論 文 内 容 要 旨 報告番号 乙 薬 第 す 氏 名 佐 野 友 春 学位論文題目 ￨糸状藍藻

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の生理活性ペプチドに関する研究 藍藻類は光合成を行う原核生物で、淡水湖沼、汽水域、海洋、土壌など様々な環境下 で生育しており、生育環境によってユニークな化学構造や生理活性を示す物質を生産す ることが知られている。特に、海洋生物に共生する藍藻から有用な化合物が単離されて いる。藍藻は培養も比較的容易なため、医薬品リード化合物の新たな天然物資源として 注目されている。 淡水産藍藻の有毒物質については精力的な研究が行われ、肝臓毒や神経毒が構造決定 されている。しかし、淡水産藍藻の毒物以外の生理活性物質についてはあまり研究が行 われておらず、特に、有毒種が多い糸状藍藻

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に注目し、その生理活性物質の検索を行うことを計画した。その結果、 糸状藍藻

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は化学構造的に非常に興味深い生理活性ペプチドを生産し ていることを見出した。これらの生理活性ペプチドについて詳細に研究を行い、以下の ような知見を得た。 1) O.

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が生産する肝臓毒microcystinを単離し、その構造を解析した結果、 MS とアミノ酸分析では既存の 3-desmethylmicrocystinと区別がつかない Dhb-microcystin -RR， HtyR，およびLRの構造を NMRを用いて明らかにした。この Dhb-microcystinの 構造を決定する際に、 HMBC法よりも微弱な結合を測定可能な decoupled-HMBC法 が有効であった。 Dhb-microcystinの細胞毒性は microcystin-LRよりやや強い値を示 した。

2

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トリプトファンの分子内環化反応とイソプレンユニ ットの付加反応によ って生合成 されたと考えられる新規異常アミノ酸 (3a-cis)-1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-3a-(3-methyl-2 -butenyl)-pyrrolo[2，3-b]indol-2-carboxylic acid(oscillatoric acid)ユニットを含む環状ペプ チド Oscillatorinを単離し、その構造を決定した。Oscillatorinはキモトリプシンを強 力に阻害し、その

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は8X 10-7 M であった。 3) 3-Amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp)後五与を合む新規環状ペプチド OscillapeptinA...，_C、

および G の構造を決定した。 OscillapeptinBはトリプシンの活性を強力に阻害し、 その ICsoは 7x 10・9M であった。OscillapeptinA、

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、および G はキモトリプシンを 強力に阻害し、その ICsoはそれぞれ 3x 10・9M， 7 x 10・8M， 4x10・9 Mであった。ま た、その構造と阻害酵素特異性に関して新たな知見を得た。

4

)ウレイド結合を有し、 homotyrosineおよび N-Meアミノ酸を含む環状ペプチド Oscil -lamide A --C， H，および Y を単離した。 OscillamideBおよび Y はキモトリプシンを 阻害した。 5 )淡水産の藍藻から塩素で置換された 3-amino-10-chloro-2-hydroxydecanoicacid (CIAhda) を含む新規鎖状ペプチド OscillagininA およびその脱塩素体 OscillagininBを単離し、 その構造を決定した。 Osc出agininAおよび B はキモトリプシンを阻害した。 本研究で Oscillatoriaagardhiiから得られたペプチドは、環状となったものが多く、さ らに、Ahpや oscillatoricacidなどの環状アミノ酸や

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アミノ酸などの異常アミノ酸を多 く含んで、いた。これら環状ペプチドは、デプシペプチドとなったものやウレイド結合を 含むものもあり、構造的に興味深い。さらに、これら環状ペプチドはアミノ酸組成も多 様性に富み、医薬品のリード化合物となることが期待される。 本研究で用いた Oscillatonaagardhiiは環状ペプチドの宝庫ともいえるもので、 Dhb-microcystin以外は同じ構造の化合物が見つからないほど、株によって生産しているペプ チドの構造がそれぞれ異なり、医薬品リ ード化合物の資源としても有用であることが確 認された。

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命 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 報告番号 乙 薬 第 之

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佐 野 友 春

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学位論文題目

糸状藍藻

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の生理活性ペプチドに関する研究

審査結果の要旨

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生 理 活 性 ペ プ チ ド に 関 す る 研 究

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生理活性ペプチドに関する研究

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目次 第

1

章 序 論 1 第2章 2・Amino-2-butenoicacid (Dhb)を含む新規 microcystin類 Dhb・microcystin-RR， HtyR，および LR 第 l節 Dhb-microcystin類の単離 5 第2節 Dhb-microcystin-RRの構造解析 第3節 Dhb-microcystin-Hty Rお よ び LRの構造解析 第4節 Dhb-microcystin類の生理活性 第

5

節 考 察 ζU ウ I 弓 ， h

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3

章 異 常 ア ミ ノ 酸 (3a-cis)ーl

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3，3a，8，8a-hexahydro-3a-(3-methyl-2-buteny1)ーpy汀010 -[2，3・b]indol・2-carboxylicacidユ ニ ッ ト を 含 む 新 規 環 状 ペ プ チ ド Oscillatorin

第

l節 Oscillatorinの単離 24 第 2節 Oscillatorinの構造解析 25 第

3

節 Oscillatorinの生理活性 35

第

4

節 考 察 36 第4章 3-A mino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp)を含む新規環状ペプチド Oscillapeptin A'"'-C，および G 第

l

節 Oscillapeptin類の単離 37 第2節 Oscillapeptin

G

の構造解析 38 第

3

節 Oscillapeptin A'"'-Cの構造解析 47 第4節 Oscillapeptin類の生理活性 第 5節 考 察 勺 I 0 0 戸 、 } ︽ J 第5章 分 子 内 ウ レ イ ド 結 合 を 含 む 新 規 環 状 ペ プ チ ド OscillamideA'"'-C.H お よ びY 第

l

節 Oscillamide類の単離 59 第 2節 Oscillamide

Y

の構造解析 61 第

3

節 Oscillamide A'"'-C，および Hの構造解析 70 第 4節 Oscillamide類の生理活性 第 5節 考 察 82 83 第6章 3-Amino-2-hydroxydecanoic acidを含む新規鎖状ペプチド OscillagininA お よ びB

第 l節 Oscillaginin Aおよび Bの単離 第

2

節 Oscillaginin Aの傍造解析 第

3

節 Oscillaginin Bの構造解析 第 4節 Oscillaginin類の生理活性 第 5節 考 察 A 斗 戸 、 J A ﹃ ぷ U 司_f oon6 0 J n y Q J 第 1章 序 論 第

7

章 土士号五 小口口口 ₉₈ 藍藻は細菌と同様、原核生物でありながら、植物と同じように水を分解して電子 を得て

C02

を還元し、酸素を放出する光合成生物である。藍藻は、淡水湖沼、汽水 域、海洋あるいは土壌などあらゆるところで生育している。大部分の藍藻は水中で、 浮遊あるいは付着して生育しており、生活環境が陸上とはかなり異なっているため、 多種多様な二次代謝産物を生産することが予想される。また、藍藻は海綿、ホヤ、 ヒラムシなどの水中生物に共生していることが知られており、これらの生物から単 離構造決定された生理活性物質の中には、 共生藍藻によって生産されていると考え られている化合物がある。藍藻は渦鞭毛藻などと比較すると培養がしやすいことも あり、医薬品リード化合物の新たな資源として注目されている1， 2))。 藍藻の生理活性物質については、海水浴中の皮膚傷害や食中毒の原因物質究明の ために行われた海産藍藻について多くの報告があり、現在までに、細胞毒性、抗カ ピ、酵素阻害、発ガンプロモーションなどの作用を示す化合物が単離構造決定され 実験の部 一般的方法 第

2

章の実験の部 第

3

章の実験の部 第

4

章の実験の部 第

5

章の実験の部 第6章の実験の部 100 101 103 104 107 110 ている。

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属から単離されたマクロライド debromoap1ysiatoxin3)や oscillatoxin A 4)は細胞毒性を示す化合物である。これらは 1974年にハワイ産のアメ フラシの中腸腺から単離された ap1ysiatoxinと類似の構造をしており5)、プロテイン キナーゼ Cの活性化と発ガン促進をする。 参考文献 ₁₁₃ 謝 辞 ₁₁₆

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R 1 =Me， R2=Br: Aplysiatoxin R1 =Me， R2=H : Debromoap1ysiatoxin R 1 =R2=H : Oscillatoxin A OH また、

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から 1977年に単離されたマクロライド to1ytoxinは強 い細胞毒性と抗カビ活性を示す6)。類似のマクロライド scytophycinsが

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年に単離したアルカロイドの anatoxin-a(s)15)がある。 ん1atoxin-aはアセチルコリンのレセプターに結合し、後シナプスの脱分極を阻害する。 Anatoxin-a(s)はコリンエステラーゼを強力に阻害し、その LDsO値は 20μ g/kgである。 また、 Aphanizomenon属が生産する aphantoxinと呼ばれるアルカロイドは麻痔性貝毒 のsaxitoxinとneosaxitoxinの9: 1混合物であった。 e M ニ O

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Tolytoxin Lyngbya majusculaから発ガンプロモーターでプロテインキナーゼCを活性化する アルカロイドとして lyngbyatoxinAが

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泊n) 一方、淡水産の藍藻の場合は、富栄養化の進んだ湖沼などで有毒藍藻が異常増殖 し、家畜や人に健康被害を及ぼす事故が世界各地で発生した。そのため、淡水産藍 藻の有毒物質について精力的な研究が行われ、肝臓毒や神経毒が構造決定されてき た11。) 肝臓毒としては microcystinと呼ばれるアミノ酸 7残基からなる環状ペプチドが、

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年に Botesらにより Microcystisaeruginosaから単離された12)0 Microcystinは肝 臓に特異的に取り込まれることが知られており、蛋白質脱燐酸化酵素の阻害作用を 示し、オカダ酸と同様に発ガン促進作用がある。Microcystinは現在までに 50種類以 上の類縁体が知られている 13。) このように、淡水産藍藻の有毒物質については良く研究されてきたが、藍藻が生 産する他の生理活性物質についてはあまり研究が行われてこなかった。最近になり、 アオコを形成する主要藍藻の一つである Microcystis属が生産する生理活性物質とし て、アンジオテンシン変換酵素阻害物質 microginin16)や蛋白質分解酵素阻害物質な どが報告されている17)。 OH

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-しかしながら、湖沼の富栄養化の進展に伴い Microcystis属に代わり優占種となる 第 2章 2-A mino-2-butenoicacid (Dhb)を含む新規 microcystin類 Dhb-microcystin-RR， HtyR，および、 LR ことが多くなってきた糸状藍藻 Oscillatoria属についてはほとんと令研究が行われてい ない。 そこで、本研究では、 Oscillatoria属 の 中 で も 優 占 種 と な る こ と が 多 い Oscil1atoria agardhiiに注目し、その生理活性物質の検索を行うことを計画した。 OscilJatona属が生産する microcystinの構造を確認するために、 Oscillatoriaagardhii が生産する microcystinについて解析を行ったところ、 MSとアミノ酸分析で、は既存の microcystinと区別することができない Dhb-microcystin-RR，HtyR， LRを発見した。こ の Dhb-microcystinの発見は microcystinの分析法に重大な影響を与えている。 その他の生理活性物質としては、 (3a-cis)-1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-3a-(3-methyl-2 -butenyl)-pyrrolo[2，3・b]indol-2-carboxylicacid (oscillatoricacid， Osc)ユニットを含むアミノ 酸 10残基からなる環状ペプチド oscillatorinを単離した。 Oscillatorinはキモトリプシ ンを阻害した。 また、グルタミン酸 γーセミアルデヒドが分子内でアセタール様構造をとった 3・ amino-6-hydroxy-2-piperidone(Ahp)ユニットを含む新規環状ペプチド oscillapeptinA， B， C，G を単離した。 Oscillapeptinはキモトリプシンおよびトリプシンを強力に阻害した。 更に、 homotyrosineを含みウレイド結合を有するアミノ酸 6残 基 か ら な る 新 規 環 状 ペ プ チ ド osci1lamideA， B， C， H， Yを単離した。 淡水産藍藻であるOscillatoriaagardhiiから塩素化された

s-

アミノ酸 3・ amino-10-chloro-2-hydroxydecanoicacid (CIAhda)を含むアミノ酸 4残基からなる新規鎖状ペプチ ド oscillagininA および脱塩素化された oscillagininBを単離したO 本研究では医薬品のリード化合物や生命科学解明の道具となりうる化合物の発見 をめざして、淡水産藍藻 Oscillatoriaagardhiiの成分研究を行い、肝臓毒 microcystinと 異常アミノ酸を含むペプチドについて新たな知見を得た。本論文においては、

第 2章 2-Amino-2七utenoicacid

の

hb)を含む新規 microcystin類 Dhb-microcystin-RR，

HtyR，および LR 第 3章 異 常 ア ミ ノ 酸 (3a-cis)-1，2，3，3a，8，8a司hexahydro-3a-(3-methy 1-2-buteny 1)ーpy汀010 -[2，3-b]indoI-2-carboxylic acidユニットを含む新規環状ペプチド Oscillatorin 第4章 子Amino-ふhydroxy-2-piperidone(Ahp)を含む新規環状ペプチド Oscillapeptin A---C，および G 第 5章 分 子 内 ウ レ イ ド 結 合 を 含 む 新 規 環 状 ペ プ チ ド OscillamideA ---C， H，および Y 第 6章 子Amino-2-hydroxydecanoicacidを含む新規鎖状ペプチド OscillagininA お よ び

B

の}II買で詳述する。 第 1節 Dhb-microcystin類 の 単 離 ( 1) Dhb-microcystin-RRの単離

Oscillatoriaagardhii小 田S-610= CCAP 1459/22 = NIV A CYA 18)を 10Lの培養瓶を

用 い て CT培地中で通気培養を行い、 1120Lの培地から凍結乾燥藻体 99.1gを得た。 凍 結 乾 燥 し た Oscillatoriaagardhii (NIES-610) 99.1 gから 8Lの CHCI₃:MeOH: H

2

0

=

1 : 3 : 1を用いて可溶性成分を抽出した。抽出液を減圧乾国後、抽出物を 5 %酢 酸 水

溶液に懸濁し、不溶物を遠心分離で、除いた後、 SepPak ODSカートリッジに吸着させ

た。カートリッジを 20% MeOHで洗浄した後、 90% MeOHで溶出した。この分画を 逆相の HPLCで分析したところ 3・-desmethylmicrocystin-RRとほぼ同じ保持時間のとこ ろに microcystin様 の

u

v

吸収を示すピークが見られた。そこで、この分画を減圧乾 回した後、溶出物を 20%MeOHに溶解し逆相 HPLC( Ultron ODS 20 x 250 m m ; 55 % MeOH、50mMリン酸緩衝液 pH3.0)お よ び}II買相 HPTLC( Silica gel 60 F254， 0.25 m m， CHC1_3: MeOH: H₂

0

= 60: 40: 10)で精製することにより Dhb-microcystirトRR(l、7.5 mg、乾燥重量の 0.008%)を単離した。 ( 2) Dhb-microcystin-HtyRお よ び LRの 単 離 Oscillatoria agardhii (CCAP 1459/14)を CT培地中で、通気培養を行った。 80Lの培養 液 か ら 得 ら れ た 乾 燥 藻 体 7.7gを 400mLの MeOHに懸濁させ、可溶性成分を抽出し た。抽出液を減圧下で濃縮した後、 5 %酢酸水溶液に抽出物を懸濁させた。遠心分 離により不溶物を除いた後、遠心上清を SepPak ODSカートリ ッジに吸着させた。 カートリッジから 20% MeOHで溶出される分画を除いた後、 90% MeOHで溶出した。 90 % MeOH溶出面分を減圧乾回した後、溶出物を 20% MeOHに溶解し、 microcystin 様 の

u

v

吸 収 を 示 す 分 画 を 逆 相 HPLC( MightysiIODS， 20 x 250 m m ; 65 % MeOH、 50mMリン酸緩衝液 pH3.0)お よ び}II真相 HPTLC( Silica gel 60 F254， 0.25 m m， CHC1₃ : MeOH : H₂0 = 60 : 40 : 10)で精製することにより Dhb-microcystin-HtyR( 2、 12.1mg、 乾 燥 重 量 の 0.2%)および Dhb-microcystin・LR(3、9.4mg、乾燥重量の 0.1%)をそれ ぞれ単離した。

第2節 Dhb-microcystinn-RRの構造解析 Dhb-microcystin-RR (1)は無色の固体で、 HPLCでの保持時間は 3-desmethylmicro -cystin-RRとほぼ一致していた。また、

uv

スペクトルも microcystin様の吸収を持ち、 239 nmに極大吸収を示した。 正イオンモードの FABMSスペクトルでは、 m/zl024に疑似分子イオンピークが観 察された(Fig. 2-5.)。高分解能FABMSスペクトルで疑似分子イオンピークがm j乞 1024.5608に観察されたことから、 1の分子式は C48H73012N13 (calcdfor M:+H: 1 024.5580， ~ +2.8 mmu)であることが明らかとなった。この分子式は desmethylmicro -cystin-RRの分子式と一致していた。 1は lH_および 13C-NMRスペクトルのデータ(Table 2-1.)からペプチドであるこ とが推定されたので、 1を酸加水分解(6 MHCl， 110oC， 20 hr)した後、 GC爪1Sおよ

びMarfey法によりアミノ酸組成を分析したところ、 D-Ala、D-Asp、D-Glu、L-Argが

確認された。このアミノ酸組成も 3-desmethylmicrocystin-RRと一致していた18)。 しかしながら、 1の lH-NMRスペクトル(Fig. 2-6.)を 3-desmethylmicrocystin-RR と比較したところ、両スペクトルは明らかに異なることが明らかとなった。すなわ ち、 Fig.2-1.(B)に示すように、 3-desmethylmicrocystin-RRでは 5-6ppmにN-methyl -dehydroalanine(!vIDha)に由来する 2本の singlet(peaks b， c )が観察されるが、 1( Fig. 2-1.(A))では 2本の singletが消失し、かわりに 5.70ppmにquartetが

l

組観察された。 1H-1H COSYスペクトル(Fig. 2-8. )から、この quartetに由来する水素は 1.87ppmの doubletのメチル基に隣接していることが明らかとなった。更に HMBCスペクトル ( Fig.2・10.)において、この 5.70ppmのquartetは166.8および 132.1ppmの炭素と、 また1.87ppmのdoubletは 123.5および 132.1ppmの炭素との間に相関ピークが観察 された。これらの結果から、このユニットは 2-amino-2-butenoicacid (dehydrobutyrine， Dhb)であることが明らかとなった(Fig. 2-2.(A)。) 5.70 1.87 ₁₄ 11

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LH.ACHO q 内L.-ammo角2-butenoicacid OCH3

H3C"" ，~

(Dhb) OH H2~~::

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O H ~司、 :HMBC 4 CH3 CH3 13 12 (A) (B) Fig. 2-2. Structures of 2-amino-2-butenoic acid(Dhb) (A)and 3・amino-9-methoxy-2，6，8・ trimethyl-lO-phenyldeca4-，6-dienoic acid(Adda)(B). (A) a 更に、 lH_1HCOSYおよびHMBCスペクトルを詳細に検討したところ、 microcystin に共通に存在する 3-amino-9-methox)叫 6，8・trimethyl-l0・phenyldeca-4，6-dienoicacid (Adda)の存在を確認した(Fig. 2-2.(B))0 Addaの立体配置については、その lH_およ び 13C-N恥伎のデータが他の microcystinの値と良く一致していることから (2S，3S，8S， 9S)であることが示された。 1のアミノ酸の配列は、主にHMBCスペクトル (Fig.2-10.)において、 α位の水 素とカルボニル炭素との相関ピークにより解析した(Fig. 2-3')0 Addaの

p

位の水 素はArg-2のカルボニル炭素との間に相関ピークが観察されたことから、その結合 を確認した。 戸 口 5 (B) b C ppm H Fig.2-1.Partsofthe 1 H-NMR spectra of1 (A) and 3-desmethylmicrocystin-RR(B).

/ー~

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HMBC correlation ， ， ， ，

、

:

decoupled-HMBCcorrelation Fig. 2-3. HMBC and decoupled司HMBCcorrelations of 1. -6- -7噌

DhbとGluとの結合は通常の HMBCスペク トル HMBCスペクトルが2結合あるいは 3結合離れた DMSO-d₆等の溶媒を用 Dhbはα位に水素がないために、 では確認できなかった。 水素一炭素聞の相関しか測定できないためである。そこで、 これは、 ~ ~ 、 ε 輔 、 E B A U 凶 いて HMBCスペクトルの測定を行ったが、 NHがbroadとなったために、その結合 Furihataらはこの HMBCのパルスを改良して、結合定数の小 四 @ 門 由 n m は確認できなかった。 e n N s g 由 さい4結合以上離れた相関ピークをも観測できる方法(decoupled-H孔1BC)を報告し g Dhbの1.87ppmのメチル基 この decoupled-HMBCを1に試みたところ、 ている19)。 e g N @ 別 的 の水素と Gluの

5

位のカルボニル炭素との聞に相関ピークが観察された(Fig. 2-11. )0 @凹由 . 三 ﹄ 百 E 伺 切 符 一 。 ﹄

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L - ₂₈ h 一 叫 ヰ 一 + 2 -開 u ﹂ 1の構造を [D-Asp3，Dhb7]microcystin-RR (Dhb-microcystin-RR)と 決定した(Fig. 2-4.)20)。 以上の結果から、 g g m 国 . f N e + 一 ヱ + 豆 一 @ 仰 す SST 図 的 門 g 、 N . h h N Dhb D-Glu H3C H Adda "OCH3 H H g a 国 g n n g s n @ n N L-Arg・2 図 的 国 e e N N. 明白 Fig. 2-4. Structure of Dhb-microcystin-RR (1). g @ 明 門 @ m f @ g -w @ 伺 v、 ' ; - l g -v_， t 山 v m - w ず 守 山 e e 由 @ @ 九 @ 明 九 s θ u、 ﹄ -ー 袋 三 v_， l m u 明マママ肝 @ V可 @ v、 図

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-_・ 色 " 1 22 180 160 140 120 1α3 80 60 40 20 :-r -QO 門 QU 日 間 ﹄ 。 EE ち ω_去

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Dhb-microcystin-HtyRおよびLRの構造解析 Dhb-microcystin-HtyR (2)およびDhb-microcystin-LR(3)はその

uv

スペクトルから microcystinであることが示唆された。また、高分解能FABMSの結果より 2および3 第

3

節 それぞれ C_S2H₇₂N10013およびC₄₈H₇₂N10012であることが示された。 3は L-Arg、 それぞれ3-desmethylmicrocystin-HtyRおよび 3-desmeth y lmicro -これらの分子式およ L-Htyを、 L-Arg

、

D-Glu、 L-Leuを含むことが確認された。 D-Asp、 2はD-Ala、 アミノ酸組成の分析から、 D-Asp、 びアミノ酸組成は、 cystin-LRと一致した。 D-Glu、 の分子式は、 更に、 D-Ala

、

- 守 一 一 I - ・- 》園、 ・・ .:. ・ー ￨ 二₁ 1 3 8 2， 主 主 会U主 主 ; ' 主 : < 1<16 :(Iミ 5 1 .< 1、 I I ， - 、 圏 、 、 ， V D旬 間 可 抗..-'V"-"'111"~. 'vV可 、'ur . "tJ""i.Jl4l'胃 ...~vv ' 珂" W " ，戸 y，.J"'-Y Y'i'可曹『明可v、J可W可 l " " 173 174 175 176 177 178 179 2および もdehydroヰlanine(Dha)残基の代わりに Dhb残基を持っていることが示唆されたo E品 偲Cスペクトルにより 2および3のアミノ酸の配列を解析したところ、 2およ び3は1のL-Arg-1がそれぞれL-HtyおよびL-Leuと置き換わったものであることを 2および3の lH-NMRスペクトル (Fig.2-13， 14)から、 しかしながら、 3 Dhb OH L-Hty D-Asp Dhb-microcystin-HtyR (2) Dhb D-Glu . 0 0 門︹ H U E

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確認した(Fig. 2-12.。) Adda ， 一-=::d三三三宝〉 。 ∞ . ト ばヲ ト∞ 守 ・ ﹄ SQ

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れJ D-Asp L-Arg Dhb-microcystin-LR (3) Fig. 2-12. Structures of Dhb-microcystin-Hty (2) and LR (3).

Table 2・2.1 H-and 13C-NMR data for Dhb-microcystin-HtyR in CD30D. 13C 175.5 49.7 17.4 174.4 56.0 34.1 J些j IH Position Ala

。

EQ 巳 (q， 7.0) (d， 7.0) 4.61 1.34 32.6 133.2 130.7 116.2 156.6 176.8 53.2 39.8 (dd， 3.7， 11.3 ) (m) (m) (m) (m) 4.14 2.24 2.10 2.73 2.52 Hty (d， 8.5) (d， 8.5) 7.01 6.66 (t， 4.6) (m) (m) 4.57 2.77 2.34 4 5 6， 10 7，9 8 2 3 Asp れ』 175.1 172.4 52.9 28.8 26.3 41.7 158.6 176.4 45.0 56.4 127.0 138.2 134.0 136.8 37.7 88.4 39.

。

16.2 13.0 16.6 58.7 140.6 130.5 129.2 127.0 179.2 56.1 29.9 34.2 175.3 166.7 132.0 123.8 13.5 (dd， 4.0， 8.5 ) (m) (m) (m) (m) (m) (m) (dd， 8.6， 9.2 ) (dd， 8.6， 15.6 ) (d， 15.6 ) (d， 8.8 ) (m) (m) (dd，4.9， 14.0 ) (dd， 7.3， 14.0 ) (d， 7.0 ) (s ) (d， 7.0 ) (s) 5.37 2.57 3.24 2.80 2.65 1.06 1.60 0.99 3.22 (d， 7.0 ) (t， 7.0 ) (t， 7.0 ) (dd， 5.8， 9.2 ) (m) (m) (m) (m) (q， 7.3)

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4.44 2.03 1.53 1.58 1.54 3.12 2.98 4.52 5.51 6.17 7.16 7.23 7.15 4.24 2.03 1.95 2.47 2.26 5.73 1.87 A ﹃ 1i 司 ， h 司 3 4 ハ U ， コ バ U1A4L 勺 3 A ﹃ ， コ バ U づ ' o o Q ノ 1 ・ a 11 12 13 14 15 16，20 17， 19 18 2 3 ︽ Jtt4443A 斗 Arg A出a <.0

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6'L-正lH 4 Glu Dhb αコ 01 01'9・正lH -19 --18

-13C 175.3 49.5 17.5 174.7 55.1 29.9 26.0 23.8 21.3 176.7 53.3 39.8 Table 2-3. lH-and 13C-NMR data for Dhb-microcystin-LR in CD30D. ~ lH (q， 7.0 ) (d，7.0) 4.61 l.31 (dd， 3.9， 11.6 ) (m) (m) (m) (d， 6.7 ) (d， 6.4 ) 4.28 2.03 1.92 1.78 0.93 0.89 (t， 4.8 ) (m) (m) 4.56 2.79 2.33 -勺 -1 d 1 A つ -司 J A H 寸 q JH ﹁ J ' i 司 4 1 J Position Ala Cコ EOQ Leu Asp 代」 175.0 172.4 52.7 28.7 26.0 41.4 158.7 176.4 45.0 56.5 127.1 138.2 134.1 136.7 37.7 88.4 39.

。

(dd， 4.3， 9.0) (m) (m) (m) (m) (m) (m) (t， 9.5 ) (dd， 9，.5 15.6 ) (d， 15.6 ) 16.1 13.0 16.6 58.7 140.6 130.5 129.2 127.0 179.3 56.0 40.6 34.4 175.3 166.5 132.0 123.8 13.5 (d， 9.8 ) (m) (m) (m) (dd， 7.2， 13.9 ) (d， 7.0) (s ) d，6.7 (s ) 5.37 2.58 3.24 2.82 2.67 1.08 1.62 0.99 3.23 A U 寸 ' i 内 J U 弓 3 4 ハ U ， 、 J F h u ' i つ 担 今 コ バ 品 マ ベ d r O 四_/OOQJ1A (d， 6.7 ) (dd， 6.7， 7.6 ) (t， 7.6 ) 7.18 7.24 7.16 (dd， 5.8， 9.2 ) (m) (m) (m) (m) (q， 7.3 )

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N ・ 凶 広 vl・官PP'f ぱヲ 4.27 1.99 1.59 2.47 2.23 5.69 1.86 4.48 2.07 1.52 1.60 1.49 3.15 3.00 4.52 5.37 6.18 11 12 13 14 15 16，20 17， 19 18 2 3 ¥0

二コ

三〉

二

三

〉

[1屯PP'f f:-I?('f .C・n71 5・nJI ([-epP'f jr-GqG < :1-叩P'f Arg A出a c-epp'f 4 5 1 2 3 4 Glu Dhb ロ コ

。

、

第4節 Dhb-microcystinの生理活性 Microcystinは肝臓毒であり、急性の致死毒性をも示すことが知られている。 Dhb-microcystin-RRについて、急性毒性を調べたところ、 400μg/kgを6週令の雄マウス の腹腔内に投与したところ、 5時間以内に全てのマウスが死亡した。 また、 Dhb-microcystin-RRのHL-60細胞に対する細胞毒性を調べたところ、 Dhb -microcystin-RRを培養液に加えただけでは 100μg加Lでも増殖限害を起こさなかった が、エレクトロポレーション処理を行うことにより増殖阻害が見られた21)0 Dhb-micro-cystin-RR， HtyR， LRおよび microcystin-LRのID50値は、それぞれ1.2、2.1、 1.7および2.5x 10・5Mであった。 -22 -第5節 考 察 Dhb-microcystin-RR， HtyR， LRは microcystinのN-methyldehydroalanineC:MDha)残基 が2・amino-2・butenoicacid

の

hb)残基に置き代わった化合物である。 Microcystinは、現 在までに50種類以上の構造類似体が知られている 12)，22)・27)。これらの microcystinの 分析において、 特に試料が微量の場合には、HPLCによる分離後、 MSおよびアミノ 酸組成の分析により解析されることが多かった。その中でも、 HPLC

!M

Sを用いる方 法はmicrocystinの分析法として優れていると考えられていた28)。しかしながら、今 回発見したDhb-microcistinはmicrocystinのdesmethyl体と同ーの分子式を持ち、 HPLCの保持時間もほぼ同一、ア ミノ酸組成も3-desmethyl体とは同一である という 特徴を持っている。今回、 Dhb-microcystinが発見されたことにより、NMRによる構 造解析なしには、 microcystinの構造、特に 3-desmethyl体の構造は決定でき ない場合 が多いことが明らかとなった。本論文には記載していないが、著者らは Adda残基の メトキシ基がアセトキシ基に置換されたDhb-microcystinを藍藻 Nostoc属から単離し ており、 microcystinの分析には NMRによる構造解析が不可欠、である ことが示唆され た。 前節までに示した様にmicrocystinには HPLC

ル

1Sを用いても構造が解析できない 誘導体が多数存在することから、 microcystinを定量しようとする場合、それぞれの 誘導体を分離するのではなく microcystinの総量を測定する方法が考えられているo ELISAもそのひとつである29)が、 ELISAには抗体の抗原特異性という問題があり、 全ての microcystin誘導体を同じ感度では測定できないという欠点がある。我々は、 microcystinに共通に存在する Adda残基をKMn0₄/KI0₄を用いて酸化し、 2-methylふ methoxy-4-phenylbutanoic acid (MMPB)誘導体とした後、 GCあるいは HPLCで定量す る方法を開発している30)。本方法では ngレベルの microcystinを定量することができ る。 マウスを用いた

i

n

vivoでのmicrocystinの急性毒性試験では、 microcystirトLRの毒 性が最も強いとされてお り(LD50

=

5

0

μ

g

!

k

g)、RR誘導体は毒性が数倍弱いと報告 されている。また、 desmethyl誘導体も毒性が弱いと報告されている28)。しかしなが ら、今回、 HL-60細胞を用いて細胞毒性試験を行ったところ、 Dhb-microcystin-RR はmicrocystin-LRよりも細胞毒性が強いことが確認された。このことから、動物に対 する致死毒性と細胞毒性とでは毒性発現メカニズムに違いがあることが考えられる。 -23

-第 3章 異 常 ア ミ ノ 酸 (3a-cis)-1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-3a-(3-methyl-2-butenyl)-pyrrolo -[2，3-b ]indol-2-carboxylic acidユ ニ ッ ト を 含 む 新 規 環 状 ペ プ チ ド Oscillatorin

第 l節 Oscillatorinの単離

Oscillatolゴaagardhii (NIES-610二 CCAP1459/22

=

NIV A CYA 18)を1120L

の

c

r

培

地を用いて通気培養し、 99.1gの凍結乾燥藻体を得た。得られた乾燥 試 料99.1gに 8Lの CHC1_3: MeOH : H₂0

=

1 : 3 : 1を加えて撹祥し、遠心分離により抽 出 液 を 得 た。 得られた抽出液を減圧下濃縮後、 5 %酢 酸 水 溶 液 に 懸 濁 し、不溶物 を 遠 心 分 離 で 除 いた。遠心上清を SepPak ODSカートリッジに吸着させ、20% MeOHで 洗 浄 し た。 カートリッジから 90% MeOHで 溶 出 さ れ る 画 分 を 減 圧 乾 回 し た後、 20% MeOHに 溶 解 し 逆 相HPLC(Purosphare ODS， 20 x 250 m m ; 75 % MeOH、 50mMリン酸緩衝液 pH 3.0)で精製することにより oscillatorin( 4、8.5mg、 乾燥 重量の0.009%)を単離 した。 第

2

節 Oscillatorinの 構 造 解 析 Oscillatorin(4)は無色の固体で、 UVス ペ ク ト ル は 283nmに 極 大 吸 収 (logε3.4)を 示 したO 正イオンモードの FABMSス ペ ク ト ル (Fig. 3-4. )では、

m

/

z

1240に 疑 似 分 子 イ オ ン ピークが観察された。高分解能FABMSスペクトル (m/包1240.6456

，

[M+H]+) によ り 、 分 子式はC60H85014N15 (calcd for M+H: 1240.6478， d.-2.2 m mu)と決定した。 lH-お よ び 13C-N11Rスペクトル デ ー タ (Table3・1.)から 4はペプチ ドであること が 示 唆 き れ た。また、 4は ニ ン ヒ ドリン試薬には陰性であったことから、環状にな って い る か

N

末 端 が修飾 さ れ ていることが示唆された。 4を 酸 加 水 分 解 後 (6 M HCI， 110 oC， 20 hr)、N-trifluoroacetylisopropyl ester誘 導 体 に 誘 導 し、GC

!M

Sにより構 成アミノ酸を分析したところ、 valine(Val)， glutamic acid (Glu)， proline(Pro)， glycine (Gly)， aspartic acid (Asp)， leucine (Leu)， tyrosine (Tyr)， arginine(Arg)が確認された。 また、 HPLCお よ び ch廿及lな GCカラムを用いた分析からこれらのアミノ酸は、 全てL型で あ る こ と を 確 認 し た。

4

の

NMR

スペクトルから、一般的なアミノ酸の他に、 一個 の 異 常 ア ミ ノ 酸 が 含 ま れ て い る こ と が 示 唆 さ れ た。lH-NMRスペクトルにおいて1.56お よ び 1.64ppmに singletの メ チ ル 基 水 素 が 観 察 さ れ た。これらは、 HMBCス ペ ク ト ル (Fig.3・9.)にお いて 120.1お よ び 135.1ppmの 炭 素 と 相 関 ピ ー ク が 観 察 さ れ た。 HSQCス ペ ク ト ル ( Fig. 3-7. )において、 120.1ppmの炭素には 5.05ppmの オ レ フ イ ン 水 素 が 結 合 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 こ の 水 素 は 2.49お よ び 2.42ppmの水素と lH-lHCOSYス ペ ク ト ル (Fig. 3-8. )において相関ピークが観察された。以上の結果から、イソプレン ユニットの存在を確認した。 lH_lHCOSYスペクトルと E品1BCス ペ ク ト ル を 詳 細 に 6 :COSY

/一¥、

:HMBC 1.64 ト56 Fig. 3-1. Structure of oscillatorIc acid unit.

検討したところ、このイソプレンユニットは 1，2，3，3a，8，8a-hexahydro-3a-pyπ010[2，3 -b]ーindol-2・carboxylicacidに 3a位で結合していることが明らかとなった (Fig.3・1.。) この異常アミノ酸残基は tryptophaneの分子内環化反応とイソプレンユニットの付加 により生合成されていると思われる。また、その ROESYスペクトルから、 H-8aと 3・methyl-2-butenylの立体配置は physostigmine31)と同様に

c

i

s

であることが示唆され た。以上の結果より、この異常アミノ酸は

(

3

a

-

c

i

s

)

ーし2

ム

3a，8，8a-hexahydro-3a-(3 -methyl-2-butenyl)-pyrrolo[2，3-b]indol-2・carboxylicacid (oscillatoric acid， Osc)であることが 明らかとなった。 Oscillatoricacidの立体構造については現在検討中である。 4のアミノ酸配列は主に、 HMBCスペクトルにおいて、 α-NHとカルボニル炭素

との相関ピークにより確認した。 Oscと Leuとの結合は Oscの 8a位水素と Leuのカ

ルボニル炭素との相関ピークにより確認した(Fig. 3-2.)0 Proと Valとの結合は、

Proの 5位水素と Valのカルボニル炭素との相関ピークにより確認した。 Argと Glu

および Gluと Asnとの結合は ROESYスペクトルにより確認した(Fig. 3-2. )0

N

二

M λ M

匂 ー

o

J

oNUO)~

芙

記

出侶C:~

ROESY

:

~

O H Fig. 3-2. H加

m

c

and ROESY correlations of4. また、 4はその分子式からアミノ酸分析で確認された AspとGluのうち、どちら かの b カルボン酸がアミドとなっていることが示唆されたので、 diphen)匂hosphonic azide (DPPA) 32)及 び[bis(trifluoroacetox y)ーiodo]benzene33)との反応を試みたが、確認 には至らなかった。そこで、 pHを変化させ N MRスペクトルを測定するこ とにより、 -26 -アミドの確認を試みた。中性あるいは塩基性では、 Gluの H-4の化学シフトは 2.3 ppmであったが酸性条件下では 2.5ppmにシフトした。同一条件下で Asnの H-3の 化学シフトは全く変化が見られなかった。このことから、アミノ酸分析で Aspとし て検出されたアミノ酸残基は 4分子内では Asnとなっていることを確認した。 以上の結果より、 oscillatorin(4)の構造を Fig.3-3.のように決定した34)。

H

₂ Asn Hυ H2 Tyr Arg OH Glu Val Fig. 3-3. Structure of oscillatorin(4). -27 -Leu

。

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o E E υ ω 含出 E Z I Z -m i 門 ・ 凶 広 の ω σ、 Z :1-コSO El-コSO (") てT 01つ50 "1:8-コSO L -:J宮O 9-コ

s

o

8・:JSO v・:JSO z:-z:正10 5・Old 5・:JSO 8'9・1^.L 6‘5・1正i -K C 苫 E 伺切符一 O ﹄ ω υ h E ∞ E m コ 守 ﹄ OEE ち ω 門 目 的 切 H A 伺 ︿ 内 向 ω ﹀ Z 一的。仏寸 1 門 ・ ∞ 日 g g ③回目 ⑤③す @ @ 門 e e N T . g r N + { ヱ + 主 } s g g g s g m g e 国 g @ @ 凶 Gコ s e 目 @ ⑤ 守 仁3 ∞包門 g NE 田 町 HNz-n(0 s e

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、

@ _、 ， ① ぱ 、 g ID S F、 g CD @ σ， g

Table 3-1.1H-and 13C-NMR dataforoscillatorin(4) in dimethylformamide-d7 -つ unMU 寸 f C

一

3 _. 4 . 9 1 d -7 ' q J 1 J J仔-Iz) (m) (dd，4.9， 13.2) (dd， 8.0， 13.2) H 4.77 2.88 2.75 posltlOn Tyr 1 2 3 13C 169.7 55.8 32.8 19.0 19.2 J伺 z) (dd， 8.9， 9.5) (m) (d， 6.4) (d，6.4) (d，9.5) 4.27 1.4 0.78 0.24 7.28 lH

。

EGC 128.5 131.2 115.6 157.0 (d，8.2) (d，8.2) 7.00 6.71 4 5，9 6，8 7 NH 2 168.1 42.1 (d，9.2) 7.38 Gly 1 172.6 49.4 43.5 25.0 21.5 23.8 (dd， 7.2， 17) (dd， 4.9， 17) (dd， 4.9， 7.2) (m) (m) (m) (d，6.4) (d，6.7) (d，8.6) 4.45 3.64 8.56 4.37 1.4 1.57 0.92 0.86 7.65 NH 2 3 4 5 5' NH 2 3 Leu 173.0 59.8 30.2 24.7 48.3 174.0 49.1 36.8 Pro E[・;)50 .V-戸 八 十reA ç-n~ s・n~ (dd， 3.5， 5.2) (m) (m) (m) 4.38 2.0 1.82 3.51 (;[・;)50 175.2 172.8 57.2 27.0 34.5 179.5 (m) (dd， 4.5， 17) (dd， 4.1，17) (d，8.9) (m) (m) (m) 4.59 3.57 2.95 8.05 4.02 2.07 2.35 Osc 62.4 43.0 (dd， 2， 7) (dd，7， 14) (dd，2， 14) 4.48 2.89 2.41 55.6 134.0 123.7 119.3 128.9 109.9 149.8 (d，7.6) (t， 7.6) (t， 7.6) (d，7.6) 7.13 6.65 6.99 6.61 82.6 38.4 (d，3.4) (d， 3.4) (dd， 7.9， 14.4) (dd， 6.1， 14.4) (dd， 6.1， 7.9) 6.92 5.62 2.49 2.42 5.05 9 M L U 9 U 9 U 3 3 4 5 6 7 7 8 8 9 172.8 53.4 28.9 (bs) 10.99 4 NH 2 3 4 5 NH 2 3 Asn G1u Arg 26.6 41.5 158.7 (m) (m) (m) (m) (m) 4.35 2.15 1.96 1.7 3.25 169.2 43.5 (d，9.1) (dd， 7.5， 17.0) (dd， 4.3， 17.0) (dd， 4.3， 7.5) 7.90 4.07 3.33 8.26 120.1 135.1 25.9 18.0 171.1 (s) (s) 1.56 1.64 ハ U 唱 l つ -qd4 ・ a -A---A ・ B ・A ・ - EE--E E A NH -( N Z 2 m N -) f t ω 2 5 2

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一

V 8‘9-1.¥1. V-;)SO 9-コ宮o qE・;)SO [[・;)SO 6'C・1正L BL-コ

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﹁ JJ H 9・ifly (-l正l [-1官八 吋 t'(-コ

1 ・~jy[-nγ1 (-nID [-OJd[-1AJ.[ごusy

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Oscillatorinの生理活性 Oscillatorinはキモトリプシンの活性を強力に阻害し、 第

3

節 その IC50は 8X 10-7 M であ トリプシンの活性は 2x 10-5 Mでもほとんど阻害しなかった。 しかし、 った。 160 140 120 100 80 60 40 -35 -ず ' ω -x E d E ￡ 一 h z E E 弓 E

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-第4節 考 察 Oscillatoricacidユニットは、 トリプトファンの分子内環化反応とそれに伴うイソプ レンユニットとの付加反応により生合成されるものと考えられる。 Oscillatoricacidと 類似した骨格を持つ化合物が海洋のヒラムシ Flustrafoliaceaから単離されているお)。 FlustramineAお よ びBと命名された化合物は、 hexahydro-3a-(3-methyl-2-butenyl)ー pyπolo[2，3-b ]indole骨格を持ち oscillatoricacidの基本骨格と非常に良く似ている。ヒ ラムシの体内には藍藻類が共生していることが知られており、 flus仕amine類 も 共 生 藍 藻類により産生されている可能性が考えられている。最近になって、

M

町 法 制iら36) により藍藻Microcystisaeruginosaから oscillatoricacidユニットを持つ環状ペプチド ka w aguchipeptinが報告されたことから、 oscillatoricacidは藍藻類に広く存在している ことが考えられる。 第4章 子Amino-6-hydroxy-2-piperidone(Ahp)を含む新規環状ペプチド Oscillapeptin

A-C

、 お よ び G 第

l

節 Oscillapeptin類 の 単 離 ( 1) Oscillapeptin Aお よ び G の 単 離

Oscillatoria agardhii(NIES・610

=

CCAP 1459/22

=

NIV A CYA 18)をCT培 地 中 で 通 気

培養を行った。 1120Lの培養液から藻体を集めた後、凍結乾燥を行い、乾燥藻体

99.1 gを得た。この試料に 8LのCHCl_3: MeOH : H₂

0

=

1 : 3 : 1を加えて可溶性成分 を抽出したO 抽出液を減圧乾固し、 5 %酢酸水溶液に男子;濁させた。不溶物を遠心分

離で除いた後、 SepPak ODSカートリッジに吸着させ、 20%MeOHで洗浄した。 90 % MeOHで溶出されてきた面分を減圧乾回した後、溶出物を 20% MeOHに溶解した。 この分画を逆相 HPLC( UltronODS， 20 x 250 m m ; 55% MeOH、50mMリン酸緩衝 液 pH 3.0)で精製することにより oscillapeptinG ( 5、240.2mg、乾燥重量の 0.2%) お よ びoscillapeptinA ( 6、15.7mg、乾燥重量の 0.02%)をそれぞれ単離した。 ( 2) Oscillapeptin

B

の単離 CT培 地 を 用 い て OscilJatoriaagardhii(CCAP 1459/14)の通気培養を行い、 80Lの 培 地 か ら 乾 燥 藻 体7.7gを得た。得られた乾燥藻体を 400mLの MeOHに懸濁した後、 遠心分離により抽出液を得た。抽出液を減圧濃縮後、 5 %酢 酸 水 溶 液 に 抽 出 物 を 懸 濁 し 、 遠 心 分 離 に よ り 不 溶 物 を 除 い た 。 遠 心 上 清 を SepPak ODSカートリッジに吸

着させた後、 20% MeOHでカートリッジを洗浄した。 90% MeOHで溶出後、溶出液 を減圧乾因したo 20 % MeOHに溶出物を溶解し、逆相 HPLC( Mightysil ODS， 20 x 250 m m ; 65 % MeOH、50mMリン酸緩衝液 pH 3.0)お よ び1]慎相HP1LC( Silica gel 60 F254、0.25m m、CHCI_3:MeOH: H₂0 = 60: 40: 10)で精製することにより oscilla -peptin

B

(7、16.6mg、乾燥重量の 0.2%)を単離した。 ( 3) Oscillapeptin Cの単離 10 Lの培養瓶を用いて Oscil1atonaagardhii(CCAP 1459/16)をCT培 地 中 で 通 気 培 養 を 行 っ たo 80 Lの培養を行い、凍結乾燥試料5.5gを得た。 MeOH400mLに乾燥 藻 体 (5.5 g )を懸濁し、 MeOH抽出液を得た。抽出液を減圧乾国後、抽出物を 5 %酢 酸 水 溶 液 に 懸 濁 し 、 不 溶 物 を 遠 心 分 離 で、除いた。上清を SepPak ODSカートリッジ

に吸着させた後、 20% MeOHで洗浄し、 90% MeOHで溶出した。 90% MeOH 溶出 画分を減圧乾国後、溶出物を 20% MeOHに溶解し逆相 HPLC( Mightysil ODS

，

20 x

250 mm ; 65% MeOH、SOmMリン酸緩衝液 pH 3.0)および]11財目 HPTLC( S ilica gel

60 F254、0.25mm、CHCI₃: MeOH : H₂0二 60: 40 : 10)で精製を行い、 oscillapeptinC ( 8、

第2節 OsciUapeptin Gの構造解析 Oscillapeptin G (5)は279nmに

uv

極大吸収を示す無色の固体で、正イオンモード のFABMSスペクトル(Fig. 4-4.)では、 mj乞1134に疑似分子イオンピークが観察さ れた。しかし、負イオンモードの FABMSスペクトル(Fig. 4-5.)では、疑似分子イ オンピークがmj乞1110に観察されたことから、正イオンモードの FABMSスペクト ルで観察された

m

/

z

1134のピークは、 Na+が付加したイオンであることが示唆され た。 5の分子式は、高分解能FABMSスペクトル (mj乞1134.5332，[M+Na]+)の結果か ら、 CS3H77017N9 (calcdfor CS3H77017N9Na :1134.5335， ~・0.3 mmu)と決定した。 lH_および13C-NMRスペクトルデータ(Table 4-1.)から、 5はペプチド性の化合 物であることが示唆され、ニンヒドリン試薬には陰性であったことから、環状ペプ チドであるか、 N末端が修飾されていることが示唆された。 5を酸加水分解後(6 MHCl， 110 oC， 20 hr)、アミノ酸組成を分析したところ、 N-meth旬yl防tyros幻ine(N leucine (仏Leu吋1)，homotyrosine(Hty)， glutamicacid (Glu)， threonine(Thr)およびisoleucine(lle) が確認された。また、 Marfey法 お よ びchiralなGCカラムを用いてアミノ酸の立体 配置を分析したところ、これらのアミノ酸は全てL型であることを確認した。 5のlH-NMR( Fig. 4-6.)において、一般的なアミノ酸残基の他に、5.37ppmに broardsingletが観察された。この水素がついている炭素は 76.5ppmに観察され、 2 個のヘテロ原子で置換されていることが示唆されたO その lH_lHCOSYスペクトル ( Fig. 4-9.)から、 5.37ppmのbroardsingletから 3位の NHまでのつながりが確認さ れた。更に、 HMBCスペクトル (Fig.4-10.)からは、 2位のカルボニル炭素 (170.5 ppm)と3位および6位の水素との聞に相関ピークが観察されたことから、 3-amino -6・hydroxy-2-piperidone(Ahp)残基の存在が明らかとなった(Fig. 4-1.)0 Ahpの立体構 造については、現在検討中である。

HN

Ahp

OH

一

一

一

:COSY

~、

:HMBC

Fig. 4-1. COSY and HMBC correlations of Ahp residue.

さらに、 lH-NMRにおいて、4.13ppmにdoubledoubletのメチン水素が観察され、 この水素と結合している geminalのメチレン水素が3.78および3.73ppmに観察され た。これらの水素は HMBCスペクトルにおいて、 173.2 ppmのカルボニル炭素と相 -38 -関ピークが観察されたことから 5の残りのユニットとして、 glyceric acidを含んでい ることが示唆された。アミノ酸と同様にして chiralなGCカラムを用いた分析を行っ たところ、この glycericacidはD型であることが確認された。百1r-lでは、刀1r-lの3 位の水素が5.70ppmに観察されたことから、百1f-lの3位水酸基はエステルとなっ ていることが示唆された。また、その分子式から、アミノ酸分析で検出された Glu は、 5では glutamine(Gln)となっていることを確認した。

H

0

3

R

A

OH _OH Fig. 4-2. Hl'v岱Ccorrelations of 5 . 5のアミノ酸の配列は主に、アミドの NHからカルボニル炭素への E品1BCスペク トルにより決定した(Fig. 4-2')0 N-Me-Tyrと Thr・2との結合は、 N二Me-Tyrのメチ ル基の水素と百1r-2のカルボニル炭素との聞の相関ピークにより確認した。百1r-2と Ahpとの結合は、 Thr-2の2位の水素とAhpの2位及び6位の炭素との聞の相関ピ ークにより確認した。また、百1r-lとlleとのエステル結合は、 η1r-lの

3

位のプロト ンから lleのカルボニル炭素への相関ピークにより確認したO 以上の結果より、 oscillapeptinG (5)の構造を Fig.4-3.のように決定した37)。

。

Hty OH Fig. 4-3. Structure of oscillapeptin G (5). -39

-N-Me-Tyr

OH

。

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- (

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2 0

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Table 4-l.1 H-and 13C-NMR data for oscillapeptin G in dimethylformamide-d7・

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