病原性放線菌の分類学的研究と新たな研究展開
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(2) 180. 真菌誌. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Table 1. Distribution of actinomycete genera in clinical samples which were isolated from patients who were suspected to be infections with Nocardia and related actinomycetes from 1999 to 2008 Pathogenic actinomycetes classified in our laboratory from 1999 to 2008 Nocardia Actinomyces Propionibacterium. 536 5 4. Actinomadura. 28. Corynebacterium. 18. Gordonia. 29. Mycobacterium. 41. Nocardiopsis. 4. Rhodococcus. 3. Rothia. 15. Streptomyces. 22. Tsukamullera. 13. Total. あった菌種数が，ここ数年で 68 種の菌種となるなど，分 類に関する解析技術の進歩に伴い新しい菌種が数年で多 く報告されるなど，放線菌，特に Nocardia の分類学に おいて革命的な変化が起きている．基礎的な研究におい ても Nocardia を中心とした病原菌のもつ多彩な生物活 性研究において，多くの興味ある知見が続々と発表され るようになってきた．本総説では，筆者らが行った研究 を中心に病原性放線菌，特に Nocardia とその関連菌に ついて，最近の分類学的研究と新しい展開がみられる Nocardia のもつ多様な生物活性研究を紹介する． Ⅰ．日本での放線菌による感染症は？ 本邦で放線菌による感染症はどのくらいあるだろう か．多くの成書を調べても納得できる数値が得られない ので，独断的に筆者らのデータから類推してみた．千葉 大学真菌医学研究センターで 1999 年から 2008 年に同定 依頼を受けた菌株は，Table 1 に示した通りである．依 頼を受けた 718 株の内訳をみると，Nocardia が 536 株 と大多数で 74.7％を占めている．さらに同定依頼の年 代を少しさかのぼって詳しく調べると，年間 50 から 70 例の報告があることになる．文献的に報告されているノ カルジア症について，千葉大が同定に関与した割合を数 年間調べてみた結果，30％近くあることが分った．そこ で，その数字から全体の症例数を推定してみると，本邦 におけるノカルジア症は約 150 から 200 例あることにな る．なお，年々増加傾向にあることから，現実にはもう 少し症例が多いと思われるが詳細な検討が必要である． 放線菌が起因菌として同定依頼を受けた臨床材料で Nocardia に続いて多い菌属としては Mycobacterium が ある．分類学的には Mycobacterium は放線菌に属する ことになるが，依頼する関係者は Nocardia を中心とす る菌糸状の放線菌，特に Nocardia を想定していると思 われる．主に迅速発育菌群の Myobacterium は，検査室. 718. で 用 い ら れ て い る 血 液 培 地 な ど で は，そ の 形 態 は Nocardia に類似しているので，多くの Mycobacterium が 含 ま れ る の は 理 解 で き る．さ ら に 最 近，非 結 核 性 Mycobacterium 属菌の新菌種が多く報告されるように なっており，それらの新菌種は通常の検査室における同 定法では種が決定できないことも，本センターに多く集 まる理由になっていると考えられる．その他の放線菌と しては Gordonia 属の菌種が多いが，その理由は本菌に よる呼吸器系の疾患を有する患者が本邦で最近多くなっ ていることによると考えられる．Actinomadura 属の放 線菌も次に多いが，本菌は元来熱帯地域での放線菌性の 菌腫の原因菌であるが，本邦では呼吸器系の疾患の患者 から多く分離されている．嫌気性の Actinomyces 属の 菌種がその次に多いが，その中でも最も多い菌種は A. israelli であった．しかし，臨床的に放線菌症が疑われ る症例においても，純培養的に原因菌を分離培養するこ とは難しく，正確に菌種の同定ができない例が多いこと から，実際には本菌種による放線菌症はさらに多いと考 えられる． 真菌医学研究センターが同定依頼を受けた 536 株の Nocardia 属の菌種についてその内訳をみると，N. farcinica が約 30％と最も多く，続いて N. nova が 15％で，N. brasiliensis が 13％である（Table 2） ．また比較的最近 に新菌種として報告された N. cyriacigeorgica が 11％で あった．これまでノカルジア症はその基準菌種である N. asteroides に よ る 感 染 症 が 多 か っ た が，当 時 の N. asteroides の菌種はヘテロジーナスな菌種であることが 明らかになり，それらのまとまりに対して総称として N. asteroides complex（group） （分類学的には意味がない） が用いられてきたことから，分類学的に広義の N. asteroides に対して N. asteroides sensu lato が用いられてい る．従って，N. asteroides sensu lato とは幾つかの菌種.
(3) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. 181. Table 2. Nocardia species identified in Medical Mycology Research Center（MMRC） , Chiba University, Chiba, Japan （from 1999-2008） Nocardia species identified in our laboratory (from 1999-2008) Nocardia abscessus. 22. aobensis. 5. araoensis. 1. arthritidis. 4. asiatica. 21. asteroides. 2. asteroides sensu stricto. 2. beijingensis. 24. brasiliensis. 71. carnea concava. 3 3. cyriacigeorgica. 60. elegans. 12. exalbida. 4. farcinica. 160. higoensis. 1. inohanensis. 1. niigatensis. 4. nova. 81. otitidiscaviarum. 14. paucivorans. 1. pseudobrasiliensis. 2. puris. 4. sienata. 1. terpenica. 1. testacea. 2. thailandica. 1. transvalensis. 13. veterana. 3. vinacea. 3. wallacei. 10. Total number. のまとまりを意味している．実際にその後にその分類群 の中の N. cyriacigeorgica などが新菌種として N. asteroides sensu lato から独立し，残った N. asteroides 株は， 現時点では狭義の意味であることから，N. asteroides sensu stricto となり，実際にはこの狭義の N. asteroides に分類される臨床材料からの菌株数は極めて少なくなっ ている．. 536. Ⅱ．放線菌の分類研究の背景 Waksman によるストレプトマイシンの発見を契機と して，続々と多くの抗生物質が発見され，放線菌は医薬 資源として人類の福祉に，特に感染症の治療薬として広 2） く貢献してきた ．その結果，新物質の特許における権 利が関係して多くの新種が提案され，分類が混乱状態と な っ た．そ れ ら を ま と め る 流 れ と し て，1964 年 に Streptomyces の分類学的な混乱を国際レベルで収拾す.
(4) 182. 真菌誌. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Fig. 1. Phylogenetic tree derived from gyrB gene sequences. The tree was created by the neighbor-joining method. Knuc value is 0.02. Only values above 50% significance for bootstrap are indicated.. るために International Streptomyces Project（ISP）が 立ち上がり，標準化された種の記載とそれに基づいて 4） ISP 基準株が指定された ．このプロジェクトにおいて 採用された分類基準は現在でも用いられており，胞子連 鎖の形態，胞子の表面構造，気菌糸の色調，基生（栄養） 菌系（vegetative mycelium）の色調，メラニン色素や他 の可溶性色素の生産，10 種類の糖の利用能などである． 1970 年代になると，抗生物質の探索が，Streptomyces か ら，いわゆる稀少放線菌（rare actinomycetes）に向かっ たことから，分類学としては，化学分類が重要視された 2） 分 類 体 系 が 確 立 し て き た ．特 に Lechevalier & 5） Lechevalier によって確立された細胞壁の化学型は，そ の後の放線菌の分類の基本指標となり，新たに GC 含量， メナキノン，リン脂質，ミコール酸，脂肪酸などの化学 組成の差異が分類学的な指標として加わった．1980 年 代になると遺伝子解析技術が飛躍的に進歩して，リボ ゾーム RNA 遺伝子の塩基配列の比較が可能となり， 1990 年代になると PCR 法が導入され，16S rDNA 塩基 情報に基づく系統学的な類縁関係による分類や同定法が 6,7） 確立されて現在に至っている ．病原放線菌について. も，これらの分類体系に従うことになるが，生理生化学 的な性状については，さらなる追加的な性状検査が必要 である．放線菌を含めて細菌の新分類群の提案は，基本 的には「International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology；IJSEM」に投稿発表することと， 基準となる菌株を公的な２つ以上の微生物保存機関 （culture collection）に寄託することが国際ルールとして 2） 提案された ．現在の分類体系において，放線菌の新種 は近縁種と DNA-DNA 相同値が 70％未満であること， 16S rDNA 塩基情報に基づく系統学的な位置が納得性を 有すること，さらにそれらを支持する化学分類学的な特 性を有することが重要である．分類の現場で混乱を防ぐ 目的で形態や生理生化学的な表現型で区別できることが 必要で，遺伝子情報だけによる新しい分類群の乱立を防 ぐことも考慮されているが，その通りになっていない Nocardia や Gordonia 菌種も存在する． 細菌の分類に普遍的に用いられている 16S rDNA の 塩 基 配 列 に 基 づ く Nocardia の 菌 種 間 の 違 い は，94100％（約 1,400 塩基配列では最大約 75 塩基に相当）の 範囲である．一方，筆者らが新たに報告した gyrB 遺伝.
(5) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. Fig. 2. plate.. Macrocolony of Nocardia brasiliensis on BHI agar. Fig. 4. Scanning electron micrograph of aerial mycelia of Nocardia asteroides.. 子を用いた系統樹の場合には，その菌種間の塩基配列の 違いは 82-100％（最大約 270 塩基の相当）であることか ら，系統分類におけるその解析度（discriminatory power）は約 3.6 倍高まり（Fig. 1） ，gyrB の塩基配列情報が Nocardia の系統分類においては優れており，今後の更 8） なる利用が期待されている ． Ⅲ．病原性放線菌の形態学的及び化学分類学的な特徴 寒天培地上に生育した Nocardia のコロニーは極めて 特徴的で一般に硬くて，またコロニーの周囲が寒天中に 食い込むような生育を示す（Fig. 2） ．多くの Nocardia の菌種は，菌糸状の生育を示し（Fig. 3） ，他の細菌との 区別が可能な場合が多い．コロニーは気菌糸と基生菌糸 に区別でき（Fig. 4） ，気菌糸の光学顕微鏡下での形態は 先端が直線状であったり，螺旋系やループ状であったり と多様である．また菌属によっては特徴的な高度に進化 したと思われる胞子形態を示し，真菌の胞子形成器官に も類似する場合も多い．気菌糸が胞子になっている場 合，胞子の表面は成熟するにつれて刺状であったり，イ ボ状であったりと菌種に特異的な構造を示す．Nocardia の基生菌糸は培養の初期は菌糸状での生育を示す が，培養時間の経過に伴い断裂して桿菌状の形態に変化. 183. Fig. 3. Scanning electron micrograph of vegetative growth of Nocardia farcinica.. する場合が多い．コロニーは黄色から橙色の色調が多 く，巨大コロニーになると，隆起したり，皺状であった りで，時間の経過に伴い寒天の表面から剥離することも ある． 放線菌は微生物の中で最も化学分類が早く導入された 菌群であり，そのために解析する化学技術が確立されて いる．Nocardia の分類・同定において重要な化学的な 指標となる成分としては，全菌体成分としてのアラビ ノースやガラクトース及びジアミノピメリン酸（diaminopimelic acid, A2pm）の 構 成 成 分（病 原 性 放 線 菌 は A2pm の異性体，meso-体であるか）があり，いずれの 構成成分を有するかの確認が必要である．A2pm の解 析は液体培養や寒天培養上の菌体を集菌して，ホルマリ ンで殺菌後，凍結乾燥した菌体を 1N 塩酸中で加水分解 用のチューブに入れて，オートクレーブで加水分解をし て行う．それらの試料についてセルロース TLC（thin layer chromatography，薄層クロマトグラフィー）上で の移動度や発色試薬で発現する色調の違いで，異性体が 区別できる（Fig. 5）．基生菌糸が分断しやすく，寒天培 地上で菌糸がジグザク状を示す放線菌のグループを nocardioform 放線菌としてまとめて扱っているが，これ ら は Nocardia-Rhodococcus-Gordonia-TsukamurellaMycobacterium 群としても知られている． これらの菌群はミコール酸の有無で他の一般病原細菌 か ら区 別す る こ と が で き る が，さ ら にミ コー ル 酸 の TLC 上での移動パターンの違いで，Nocardia, Mycobacterium 及び Gordonia との鑑別が可能である（Fig. 6）． 染色性では，Mycobacterium は強い抗酸性の染色性を示 すが，Nocardia は弱く部分的な抗酸性を示すことが特 徴である．この染色性を利用して，組織での Nocardia の感染の有無を知ることができる．抗酸菌の多くが病原 菌であることから，抗酸菌の細胞構成成分としてのミ コール酸の化学構造研究も一段と進み，その炭素数の違 いが重要な指標として分類基準に用いられている．新た 9） に Nocardia 関連の放線菌で病原性の Dietzia や Segni10） liparus 属菌 がミコール酸含有放線菌として報告され.
(6) 184. 真菌誌. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Fig. 6. Mycolic acid patterns of Nocardia and related actinomycetes. 1：Turicella otitidis, 2：Corynebacterium xerosis, 3： Williamsia deligens, 4：Williamsia muralis, 5：Dietzia cinnamea, 6：Dietzia maris, 7：Rhodococcus equi, 8：Gordonia bronchialis, 9：Nocardia asteroides, 10：Nocardia asiatica, 11：Mycobacterium smegmatis, 12：Tsukamurella tyrosinosolvens, 13：Segniliparus rotundus. Fig. 5. Comparison of diaminopimelic acid（A2pm）in Nocardia and related actinomycetes. 1：Nocardia, 2：Streptomyces, 3：Mycobacterium, 4：Gordonia, 5：Rhodococcus, 6：Rothia. ている．まだ病原性が確認されていないミコール酸含有 放線菌として，Smaragdicoccus, Millisia, Hoyosella 属の 11,12,13） 放線菌も報告 されているが，これらの放線菌は， 廃棄物処理場から分離されており，ミコール酸含有放線 菌の環境分野での新たな役割も明らかになってきた． 真菌では細胞構成成分として，ユビキノンの分子種の 解析が分類や同定に必要であるが，放線菌ではユビキノ ンの代わりにメナキノン分子種の解析が行われている． 病原放線菌の同定を目的とした場合に，その解析は必ず しも必要ではないが，新種の記載などには必要である． 一般に真菌はステロイド系の化合物をメバロン酸経路を 通して生合成できるが，細菌はこの生合成の経路を持っ ていないとされていた．しかし，最近の研究で Nocardia を含めた放線菌がメバロン酸と非メバロン酸経路の いずれも有していることが証明されたことから真菌との 14） 類似性もより強くなり ，放線菌が境界微生物であると いわれたこともあり，放線菌は高度に進化し，真菌にも より相同性をもつ細菌であることを系統学的にも示唆し ているとも思われる． Ⅳ．病原性放線菌の遺伝子的な特性 病原性放線菌の分類や同定も 16S rRNA 遺伝子の塩基 配列の類似性に基づいて行われている．病原性放線菌の 代表である Nocardia のように高度に形態分化が進んだ 放線菌では，DNA の GC 含量が高いという分類学的な 2） 特徴がある ．GC 含量の高いことが遺伝子の配列情報 の解析を困難にしていたが，解析技術の進歩により解析 が容易となり，その特徴が分類学にも重要な性状として 利用されるようになっている．筆者らは日本の患者から 分離した Nocardia farcinica IFM 10152 株を選定して，. 全ゲノム解析を進めて世界で初めてその情報を公開し 15） た ． 全ゲノム解析の結果，N. farcinica は予想とは異なっ て，雑菌性の Streptomyces avermitilis や Corynebacterium glutamicum な ど よ り，む し ろ 結 核 菌（M. tuberculosis）に近縁であることが明らかになった．N. farcinica の遺伝子情報は土壌中での生育に適した遺伝 子を結核菌と同様に多く有していることから，土壌での 生育に適した遺伝子背景を示す細菌であることも示唆さ れた．さらに，雑菌性の Streptomyces と同様に抗生物 質などの二次代謝産物を生産する遺伝子を多くもってい ることも証明され，病原放線菌である Nocardia は優れ た医薬の資源でもあることを示す解析データも得られ た．また Nocardia の病原因子の一つとして考えられて いる siderophore（シデロフォア）の生合成遺伝子も発 見することができた，その後のゲノム比較で，Nocardia の siderophore は，結核菌のものと同じ機能とほぼ同じ 遺伝子配列をもつことが確認され，共通の病原因子をも つことが明らかとなっている． Ⅴ．薬剤感受性を用いた Nocardia 属放線菌の簡易同定 法の開発 Nocardia は菌種によって薬剤感受性が異なることが 知られているが，筆者らは，収集された臨床分離株を用 いて，imipenem, kanamycin, tobramycin 及び抗癌剤で ある 5-fluorouracil（5-FU）に対する薬剤感受性を調べ た．それらの薬剤感受性のパターンに基づいた Nocar16） dia の簡易同定法を提案した ．その方法によれば，本 邦で臨床的に問題となる５菌種の Nocardia である N. asteroides，N. brasiliensis，N. farcinica，N. nova 及び N. otitidiscaviarum は，薬剤感受性パターンの比較だけで 同定できることが明らかになった．毎年真菌医学研究セ ンターにおける講習会での実習にこの方法を含めること により，本邦での臨床検査室でも使われるようになって いる．さらに erythromycin やニューキノロン剤である ciprofloxacin への薬剤感受性のパターンの違いを追加す.
(7) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. Fig. 7.. 185. Possible ribosylation route of rifampicin by Mycobacterium smegmatis.. ると，上記の５菌種以外にも，N. beijingensis などにつ いても種の確定ができるようになった．これらの薬剤感 受性パターンの違いに基づく簡易同定法は，菌種が 10 程度の場合には有効であったが，現在 Nocardia の菌種 は 68 種を超えており，薬剤感受性パターンは菌種の同 定よりもグループ化するための指標の一つとして使われ ている． Ⅵ．病原性放線菌の特異的な薬剤耐性機構 Nocardia は菌種に特異的な薬剤感受性パターンに基 づいて菌種の簡便な同定法が有効であることを明らかに なり，さらに Nocardia の薬剤感受性はそれぞれの菌種 に本来備わっている性質に基づくことを証明した．そこ で，他の薬剤耐性機構について詳細に検討した． アミノグリコシド系の抗生物質に対しては，多くの Nocardia の 菌 種 は 耐 性（非 感 受 性）で あ る が，特 に kanamycin に対する耐性機構の研究で，リン酸化酵素 （amioglycoside phosphotransferase, APH［3'］ ）の存在 17） を見いだした ．また全ゲノム解析から，N. farcinica IFM 10152 株では gentamicin と streptomycin に対し て，そ れ ぞ れ 遺 伝 子 的 に は APH（2''） （Nfa31340）と APH（6） （Nfa38620）に属するリン酸化による耐性機構 の存在も確認され，Nocardia のアミノグリコシド系の 抗生物質に対する主な耐性機構は，リン酸化による不活 化であることが明らかになった．放線菌におけるアミノ グリコシド系のリン酸化は，抗生物質が産生されるとき に，放線菌自身が生産する抗生物質への自己耐性にも関 与することから，生合成に関係する遺伝子であることも 示唆されており，耐性に関与する遺伝子の起源としても 考えられている． マクロライド系の薬剤に対しては，N. nova 関連菌種 は感受性であり，治療においても有効であったとの報告 もある．しかし，N. brasiliensis，N. asteroides，N. far-. cinica では多くは耐性であり，rokitamycin, midecamycin, erythromycin の 18-フォルミル基の還元，さらにそ れぞれの構成糖の 2'-OH 基のリン酸化，4''-O-acyl 基の 加水分解等により不活化することにより耐性となること が明らかになった．Erythromycin においては，構成糖 （desosamine）の 2'-OH 基のグルコシル化を N. asteroides IFM 0399 株が行うことを初めて明らかにすること 18-20） ができた ．これらの結果から Nocardia のアミノグ リコシドやマクロライド系の抗生物質の耐性機構は主に 不活化であることから，薬剤の耐性遺伝子が抗生物質の 生合成に関与する遺伝子の起源であることがさらに強く 示唆された． 著者らは抗結核剤である rifampicin が何ゆえに結核 菌と同じ抗酸菌である Nocardia に活性を示さないかに 興味をもって研究を進めた．その結果，その耐性機構は これまでに報告のない rifampicin の不活化によること 21） を明らかにした ．Rifampicin の不活化による耐性機構 の発見は初めてであり，このことも放線菌が抗生物質の 耐性に関与する遺伝子の起源であることを示唆する結果 となった．Rifampicin に対する Nocardia の不活化によ る耐性機構は，rifampicin のリン酸化やグルコシル化で 22,23） あることを報告した ． これらの研究中に，ドイツのマックスプラン研究所の Dabbs 博士（現在，南アフリカ Witwatersand 大学教授） らは，迅速発育性の Mycobacterium がリン酸化やグル コシル化とは異なった耐性機構をもつことを明らかにし ていたことから共同研究の依頼があった．その分子遺伝 学 的 な 研 究 や 不 活 化 物 の 構 造 解 析 の 共 同 研 究 か ら， Mycobacterium 属菌の耐性機構は，これまで全く報告の ない rifampicin のリボシル化による不活化機構である 24） ことが明らかになった （Fig. 7）．特に，不活化に関与 するリボースが多くの生命体に普遍的に存在する NAD.
(8) 186. 真菌誌. Fig. 8.. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Scanning electron micrograph of aerial mycelia of Gordonia araii.. から供給されることが証明され，その機構は ADP-リボ 25-27） シル化であることが証明された ． 2001 年，フランスの Nordmann 博士らは，大腸菌に おいても同じような遺伝子があることを見いだし，演者 らとの共同研究を通して，詳細な rifampicin の耐性機構 28） を 明 ら か に し た ．そ の 後，米 国 の 研 究 者 ら に よ り Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa においても同様の不活化によ る耐性機構が存在することが明らかになった．Rifampicin はグラム陰性菌による感染症には使われることはな いが，他の感染症の治療に rifampicin が使われる場合に は，どのような影響があるのか詳細な検討が必要である． 2004 年，世界で初めて病原放線菌として，N. farcinica IFM 10152 株の全ゲノムの解析が完了し，その関連で アミノグリコシド系の抗生物質の耐性機構について前述 したが，それ以外にも多くの耐性に関与する遺伝子を探 し当てることができている．もともと N. farcinica は， 多くの薬剤に非感受性であることから，その非感受性機 構（耐性機構）の遺伝子的な背景が，ペニシリンやセファ ロスポロン系でβ−ラクタマーゼ（Nfa23080, Nfa19770, Nfa48460）に，マクロライド系薬剤が rRNA メチルトラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ（Nfa27210, Nfa47240）に，chloramphenicol がエフラックスポンプ（Nfa18410）に，また rifampicin が RpoB2（Nfa46460）やモノオキシゲナーゼ 15） （Nfa35380）にあることも新たに証明できた （Table 3） ． 米国疾病予防管理センター（CDC, USA）の Brown 博 士は，北米を中心に牛の乳房炎を起こす N. farcinica が， アミノグリコシド系の amikacin に耐性であることを発 見した．筆者らは耐性機構の解明の依頼を受けて，カナ ダで分離された多くの amikacin 耐性 N. farcinica 株の 解析を進めた．N. farcinica の基準種やゲノム解析株も 含めて，50 株以上の臨床分離の N. farcinica 株について も amikacin への耐性状況を調べた結果，全ての N. farcinica 株が amikasin に感受性であり，北米で発見され た amikacin 耐性 N. farcinica は例外的な株であること が確認された．Nocardia の遺伝子の取り扱いは極めて. 難しいことから，感染症研究所の千葉らは，大腸菌と 29） Nocardia とのシャトルベクターを開発 していること か ら，そ れ ら を 用 い て の 解 析 を 進 め て，耐 性 機 構 が rRNA の１塩基の変異によることを明らかにすることが できた（論文投稿中） ． Ⅶ．病原性放線菌の新種の提案 前述したように，真菌医学研究センターには毎年約 50 から 70 株程度の同定依頼がある．受け取った菌株につ いては純培養の確認後，ミコール酸のパターンと細胞構 成成分としての A2pm の異性体の有無を調べて，構成 糖としてのアラビノースとガラクトースの存在の有無を 確認して，最後に生理生化学的な性状を解析して種の同 定を行うが，最終的な確認に 16S rDNA の解析を行って いる．2004 年から 2007 年において，真菌医学研究セン ターから提案されて国際的に認められて Nocardia の新 菌種は 18 種に及びその時点で，Nocardia の菌種の約 30-41） 1/4 が当真菌センター発の菌種となっていた （Table 4）．それらの新菌種の中では N. asiatica，N. arthritidis， N. exalbida などによる感染症が，国内外の研究者により 多 く 報 告 さ れ る よ う に な っ て き た．ま た，３ 菌 種 の Gordonia（G. araii，G. effusa，G. otitidis）についても新 42,43） しく提案した （Fig. 8） ．さらに，日本で呼吸器感染 が疑われる患者からよく分離される Actinomadura（Fig. 44） 9）について，新種として，A. chibensis を提案した ． Ⅷ．病原性放線菌の二次代謝産物とは 抗生物質をはじめ医薬の 30％以上が天然物を資源と していることが知られているが，土壌真菌や放線菌を医 薬資源として探索研究が精力的に進められた結果，新規 な構造をもつ物質の発見はより困難な状況となってい る．さらに資源の探索が海底や火山，南極などの極限に 生息する微生物にも向けられているが，新たな展開はあ まりない．そこで通常の条件では培養が困難な微生物 （難培養性微生物）にも探索が向けられ，遺伝子情報を通 しての新たな活性物質の探索も開始され，新しい資源と して期待されている．2004 年に N. farcinica の全ゲノム が解析された結果，Nocardia は，抗生物質の生産菌とし.
(9) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. Table 3.. Drug-resistance profile and putative resistance determinants of Nocardia farcinica IFM 10152 Drug. MIC. ABPC. 32. AZT. ＞ 32. CAZ. ＞ 32. CCL. ＞ 32. CDTR. β-lactam. 187. Resistance determinant. Drug. Aminoglycoside. 4. CEZ. ＞ 32. CMZ. 16. CTM. 8. CTRX. 4. CTX. 4. CZX. ＞ 32. FMOX. 4. FRPM. 16. IPM. 0.25. LMOX. ＞ 32. MEPM. 2. PCG. ＞8. PIPC. ＞ 64. Macrolide β-lactamase (including extended spectrum). Quinolone. Resistance determinant. ABK. ＜ 0.25. AMK. ＜1. GM. ＞ 16. APH(2"). KM. 64. APH(3'). SM. 16. APH(6). CAM. 4. EM. ＞ 16. CLDM. 16. OFLX. ＜ 0.5. TFLX. 0.25. CP FOM Other. MIC. 64. rRNA metyltransferase efflux pump. efflux pump. ＞ 32. MurA. SX. 19. FoIP. TMP. 1. RFP. ＞ 16. MINO. monooxygenase, RpoB2(?). 2. Data were obtained from Dr. J. Ishikawa et al., NIID. て知られている Streptomyces 属放線菌よりも結核菌や コリネバクテリウムに類似点が多いことが明らかになっ た．しかし Nocardia は，ゲノム解析から Streptomyces と同様に二次代謝産物の生産に関係する多くの遺伝子を もつことも明らかになった．筆者らは，毎年 50-70 例近 くの病原放線菌の同定依頼を受けており，正確に菌種の 確立した多くの病原放線菌が保存されている．それらの 放線菌について，生産する二次代謝産物について活性物 質の探索を行った． その結果，臨床分離の Nocardia の菌株の多くが抗微 生物活性や抗がん活性及び免疫抑制活性などの興味ある 生物活性を有し，さらに新規な構造を持つ二次代謝産物 （抗生物質）を生産していることを報告してきた． ⅰ） ．抗細菌物質 臨床材料から分離した Nocardia の生産する抗微生物 活性物質としては，N. brasiliensis IFM 0276 株からのア ルカロイド系抗細菌活性物質で brasilidine A と命名し 45） た新規物質を発見し報告した ．本活性物質は，その後 の研究で，N. brasiliensis の基準株である N. brasiliensis IFM 0236 株 か ら も 生 産 が 確 認 さ れ た．本 物 質 は Corynebacterium や Nocardia などの抗酸菌に対して強 い活性を示した．N. brasiliensis IFM 0677 株から，テル ペン系の新規の抗細菌性抗生物質である nocaracin A,. 46）. B, C を見いだして報告した ．このように多くの抗細 菌性抗生物質が N. brasiliensis から見いだされたことか ら，臨床材料から分離した 76 株の N. brasiliensis 株につ いて， 培養ロ液と培養菌体のメタノール抽出液について， 抗微生物活性作用を指標に検索した．その結果，18 株の 菌体抽出液から brasilidine A として報告した新規のア ルカロイド系の抗細菌活性物質を生産していることが明 らかとなり，N. brasiliensis の多くの株が本抗生物質の 47） 生産源であることが確認できた ．また，N. brasiliensis IFM 0466 株が，臨床的にも広く使われているマクロ ライド系抗生物質である erythromycin A を生産してい 48） た ．本 菌 で は，最 も 大 量 に 生 産 さ れ て い る 成 分 は erythormycin E で あ っ た．病 原 性 Nocardia が erythromycin を生産することはこの報告が最初であっ た．ま た 構 造 の 極 め て ユ ニ ー ク な 新 規 化 合 物 nocar49） diolactone を発見した ．Nocardia の多くが抗酸菌に対 して強い活性物質を生産することから，活性物質の探索 を進め，その結果，rifampicin 耐性結核菌にも強い活性 を示す thiopetide 系の抗生物質（nocardithiocin） （Fig. 50） 10）を N. pseudobrasiliensis IFM 0757 株から発見し ， その作用機構の解明研究が進んでいる． ⅱ）．抗真菌物質 N. brasiliensis IFM 0406 株は，32 員環のマクロライド.
(10) 188. 真菌誌. Table 4.. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Newly proposed Nocardia, Gordonia and Actinomadura species. Nocardia sp.. Isolation from. IFM No.. Year. N. anaemiae. human. 0323. 2005. N. aobensis. human. 0372. 2004. N. araoensis. human. 0575. 2004. N. arthritidis. human. 10035. 2004. N. asiatica. human. 0245. 2004. N. concava. human. 0354. 2005. N. exalbida. human. 0803. 2006. N. higoensis. human. 10084. 2004. N. inohanensis. human. 0092. 2004. N. niigatensis. human. 0330. 2004. N. pneumoniae. human. 0784. 2004. N. shimofusensis. soil. 10311. 2004. N. sienata. human. 10088. 2004. N. terpeniae. human. 0706. 2007. N. thailandica. human. 10145. 2004. N. testacea. human. 0937. 2004. N. vermiculata. human. 0391. 2004. N. yamanashiensis. human. 0265. 2004. human. 10266. 2006. G. otitidis. human. 10032. 2005. G. effusa. human. 10200. 2006. G. araii. human. 10211. 2006. Actinomadura sp. A. chibensis Gordonia sp.. Fig. 9.. Scanning electron micrograph of Actinomadura madurae.. 系 の 抗 真 菌 性 抗 生 物 質 brasilinolide A を 生 産 し て い 51） た ．Brasilinolide A は Aspergillus niger に特異的に活 性を示す抗生物質であるが，免疫抑制活性の指標である MLR アッセイにおいても強い活性を有していた． 長 崎 地 方 の 病 院 で 患 者 か ら 分 離 さ れ た Nocardia. transvalensis IFM 10065 株は transvalencin A と命名し 52,53） た新規抗真菌性抗生物質を生産していた ． ⅲ） ．抗がん性活性物質 病原放線菌は病原因子として，鉄原子と選択的に結合 できるシデロフォアを生産することが知られ，感染部位.
(11) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. 189. Fig. 10. Structure of newly discovered antibacterial antibiotic, nocardithiocin isolated from Nocardia pseudobrasiliensis.. においては，鉄原子の競合的な獲得を通して感染を成立 させると考えられている．シデロフォアのこの作用が結 果的に抗がん活性にも通じているが，最近の研究ではア ポトシス（apoptosis）を引き起こす作用をももつことも 確認され，新しい誘導体の作製などを通して， 医薬のシー ド化合物となることが期待されている．筆者らは病原放 線菌から新たなシデロフォアの探索を進め，N. asteroides IFM 0959 株及び N. brasiliensis IFM 0995 株から， 54） 55） それぞれ asterobactin 及び brasilibactin と命名した 新規シデロフォア化合物を発見した．患者由来の Actinomadura madurae より，新規な抗菌活性をも示すシデ 56） ロフォア madurastatins を発見した ．N. pseudobrasiliensis IFM 0624 株は，アンスラサイクリン系の新規抗 57） がん物質（nocardicyclins）を生産することを発表した ． Nocardicyclins は抗がん活性以外に，抗酸菌である M. smegmatis や N. asteroides などに強い抗細菌活性を示 51） すことも特徴であった ．その他の抗がん剤として， 58） 59） brasiliquinone や demethyl-mutactimycin なども発 見した． ⅳ）．免疫抑制物質 N. brasiliensis IFM0406 株の産生するテルペン系の新 60） 規化合物 brasilicardin は ，マウスでの MLA（mouse mixed lymphocyte）アッセイで，対照薬剤よりも強い活 性を示すことが明らかになった．Brasilicardin は化学構 造的にも極めてユニークで，ベンゼン環，糖，テルペン. 骨格， アミノ酸から構成されている．この生合成研究は， brasilicardin A が非メバロン酸の生合成経路を通して生 14） 産されることを証明した ． おわりに 最近，CDC の Brown 博士らは，Nocardia の新しい菌 種として，筆者の名前をつけた新菌種 Nocardia mikamii を国際的な分類学の雑誌である IJSEM に提案して 受 理 さ れ，現 在 Web（http: //ijs. sgmjournals. org/cgi/ content/abstract/ijs.0.015594-0v1）で公開されている． 学問は継続性が重要であることは先達によって指摘され てきたが，地道な努力を通して集められた貴重な病原性 放線菌である Nocardia を中心とする多くの菌株が真菌 医学研究センターに保存されてきたことが，筆者らのこ れらの一連の研究成果に繋がっている． 文. 献. 1）Kang Y, Takeda K, Yazawa K, Mikami Y: Phylogenetic studies of Gordonia species based on gyrB and secA1 gene analyses. Mycopathol 167: 133-137, 2009. 2）Miyadoh S: Identification procedure at the genus level. In Identification Manual of Actinomycetes（Miyadoh S, et al. ed） , pp. 9-19, Business Center for Academic Societies Japan: Tokyo, 2001. 3）Stackebrandt E, Rainey FA, Ward-Rainey NL: Proposal.
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