博士論文
動脈硬化治療薬の開発を目的とした
Liver X Receptor β 選択 的アゴ ニストの創 薬研 究
東京薬科大学
Structure-activity relationship and synthetic studies on
Liver X Receptor β-selective agonists
for the treatment of atherosclerosis
Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
i
目 次
緒 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1
第 一 章 Liver X Receptor 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト の 創 製 ～ Hit to Lead～ ・・・・・・・ 13 第 一 節 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 の 創 製 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 13 第 一 項 ド ラ ッ グ デ ザ イ ン ① ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 13 第 二 項 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 20 第 三 項 構 造 活 性 相 関 ① ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 23 第 四 項 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 2 の 薬 理 評 価 ・・・・・・・・・・27 第 五 項 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 2 の 薬 物 動 態 評 価 ・・・・・・・・31 第 六 項 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 32 第 二 節 1,3-ジ ヒ ド ロ イ ソ ベ ン ゾ フ ラ ン 誘 導 体 の 創 製 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 33 第 一 項 ド ラ ッ グ デ ザ イ ン ② ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 33 第 二 項 ク ロ マ ン お よ び 1,3- ジ ヒ ド ロ イ ソ ベ ン ゾ フ ラ ン 誘 導 体 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 35 第 三 項 構 造 活 性 相 関 ② ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 39 第 四 項 2- オ キ ソ ク ロ マ ン お よ び 1,3- ジ ヒ ド ロ イ ソ ベ ン ゾ フ ラ ン 誘 導 体 の 薬 物 動 態 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 44 第 五 項 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 44 第 三 節 1,1-ビ ス (ト リ フ ル オ ロ メ チ ル )カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の 創 製 ・・・・・・ 45 第 一 項 ド ラ ッ グ デ ザ イ ン ③ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 45 第 二 項 1,1- ビ ス ( ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ) カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 46 第 三 項 構 造 活 性 相 関 ③ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 50 第 四 項 1,1- ビ ス ( ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ) カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の 薬 物 動 態 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 56 第 五 項 1,1- ビ ス ( ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ) カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の 薬 理 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 57 第 六 項 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 59 第 二 章 リ ー ド 化 合 物 4 の 検 証 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 60 第 一 節 リ ー ド 化 合 物 4 の 合 成 法 検 討 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 60 第 一 項 研 究 方 針 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 60 第 二 項 化 合 物 4 の 光 学 分 割 お よ び 鏡 像 異 性 体 の in vitro 活 性 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 60
ii 第 三 項 鍵 中 間 体 5 の 光 学 分 割 お よ び 鏡 像 異 性 体 (+)-4 と (−)-4 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 62 第 四 項 化 合 物 4 の 絶 対 立 体 配 置 の 決 定 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 63 第 五 項 化 合 物 (S)-(+)-5 の 合 成 法 検 討 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 64 第 二 節 リ ー ド 化 合 物 4 の 血 中 濃 度 推 移 の 検 証 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 65 第 三 節 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 66
第 三 章 Liver X Receptor 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト の 創 製 ～ Lead Optimization～ ・ ・ ・ 67 第 一 節 ド ラ ッ グ デ ザ イ ン ④ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 67 第 二 節 合 成 お よ び 薬 理 ・ 薬 物 動 態 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 70 第 一 項 不 飽 和 炭 化 水 素 鎖 リ ン カ ー を 有 す る 1,1-ビ ス (ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ) カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 70 第 二 項 構 造 活 性 相 関 ④：不 飽 和 炭 化 水 素 鎖 リ ン カ ー を 有 す る 1,1-ビ ス (ト リ フ ル オ ロ メ チ ル )カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の in vitro 活 性 評 価 ・・・・ 72 第 三 項 芳 香 環 リ ン カ ー を 有 す る 1,1- ビ ス ( ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ) カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 73 第 四 項 構 造 活 性 相 関 ⑤ ： 芳 香 環 リ ン カ ー を 有 す る 1,1-ビ ス (ト リ フ ル オ ロ メ チ ル )カ ル ビ ノ ー ル 誘 導 体 の in vitro 活 性 評 価・・・・・・・ 81 第 五 項 ピ リ ジ ル ヒ ダ ン ト イ ン 誘 導 体 の 合 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 85 第 六 項 2- ヒ ド ロ キ シ ア セ ト フ ェ ノ ン 誘 導 体 246d お よ び 10 の in vitro 活 性 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 86 第 七 項 化 合 物 10 の ド ッ キ ン グ モ デ ル で の 検 証・・・・・・・・・・・ 87 第 八 項 2-ヒ ド ロ キ シ ア セ ト フ ェ ノ ン 誘 導 体 246d お よ び 10 の 薬 物 動 態 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 89 第 九 項 光 学 活 性 ピ リ ジ ル ヒ ダ ン ト イ ン 誘 導 体 10 の in vitro 活 性 評 価 ・ 89 第 十 項 光 学 活 性 ピ リ ジ ル ヒ ダ ン ト イ ン 誘 導 体 (−)-10 の 薬 物 動 態 評 価 ・91 第 十 一 項 光 学 活 性 ピ リ ジ ル ヒ ダ ン ト イ ン 誘 導 体 (−)-10 の 薬 理 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 91 第 三 節 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 95 第 四 章 候 補 化 合 物 (−)-10 の 合 成 法 検 討 ・・・・ ・・・・ ・・・・・・ ・・・・ 96 第 一 節 研 究 方 針 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 96 第 二 節 化 合 物 (−)-10 の 絶 対 立 体 配 置 の 決 定 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 96 第 三 節 光 学 活 性 ピ リ ジ ル ヒ ダ ン ト イ ン 11 の 大 量 合 成 法 ・・・・・・・・・98 第 四 節 化 合 物 (S)-(−)-10 の 効 率 的 合 成 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 102 第 五 節 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 104
iii 結 語 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 105 実 験 の 部 第 一 章 に 関 す る 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 108 第 二 章 に 関 す る 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 172 第 三 章 に 関 す る 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 180 第 四 章 に 関 す る 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 213 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・・・・・・・・・・223 引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 224
iv
略 語 表
ABCA1: ATP-binding cassette transporter A1 ABCG5: ATP-binding cassette transporter G5 ABCG8: ATP-binding cassette transporter G8 AF-1: activation function -1
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid Compd: compound
DBD: DNA binding domain DEA: diethylamine
DEAD: diethyl azodicarboxylate DHP: dihydropyrane
DMF: N, N-dimethylformamide (EtO)2P(O)H: diethyl phosphonate
FAS: Fatty acid synthase
HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol
HPLC: high performance liquid chromatography HTS: high-throughput screening
KI: Potassium iodide
LBD: ligand binding domain LDL: low-density lipoprotein LiAlH4: lithium aluminum hydride
LXR: liver X receptor
LXRE: LXR response element NBS: N-bromosuccinimide NCS: N-chlorosuccinimide (NH4)2CO3: ammonium carbonate
NPC1L1: Neimann-Pick C1 like1 NR: nuclear receptor
PCSK9: Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9 Ts: p-toluenesulfonyl
RCT : reverse cholesterol transport RXR: retinoid X receptor
SREBP-1c: sterol regulatory element -binding protein 1c TC: total cholesterol
v TFA: trifluoroaccetic acid
1
緒 言
近 年 ， 脳 梗 塞 や 脳 卒 中 な ど の 脳 血 管 系 疾 患 や 心 筋 梗 塞 な ど の 心 血 管 系 疾 患 が 悪 性 腫 瘍 に 次 ぐ 死 亡 要 因 と な り ，国 内 は も と よ り 世 界 で 問 題 と な っ て い る 1 )．血 中 総 コ レ ス
テ ロ ー ル (total cholesterol; TC) と 心 血 管 系 疾 患 の 発 症 率 と の 相 関 を 調 査 し た 大 規 模 疫 学 試 験 (Framingham Heart Study) 2 ) の 結 果 ， 血 中 コ レ ス テ ロ ー ル の 高 い 患 者 ほ ど 心 血
管 系 疾 患 の 発 症 率 が 高 い こ と が 明 ら か に さ れ ， 治 療 戦 略 と し て は TC を 低 下 さ せ る こ と が 第 一 と 考 え ら れ て い る ． そ の 具 体 的 な 治 療 法 と し て ， ま ず コ レ ス テ ロ ー ル 産 生 を 阻 害 す る 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) 還 元 酵 素 阻 害 剤 (い わ ゆ る ス タ チ ン 製 剤 ) の 投 与 が 挙 げ ら れ る ． 実 際 ， プ ラ バ ス タ チ ン (メ バ ロ チ ン®) 3 ) を 用
い た West of Scotland Coronary Prevention Study (WOSCOPS) 4 ) や シ ン バ ス タ チ ン (リ
ポ バ ス®
) 5 ) を 用 い た Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S) 6 ) な ど の 大 規 模 臨 床
試 験 の 結 果 ， 心 血 管 イ ベ ン ト の 抑 制 と LDL コ レ ス テ ロ ー ル (low-density lipoprotein cholesterol; LDL-C) 低 下 作 用 に よ る 治 療 法 の 意 義 が 実 証 さ れ た 7 )． し か し な が ら ， ス タ チ ン 製 剤 に よ る 心 血 管 イ ベ ン ト 抑 制 率 は 約 30% 程 度 で あ る 8 )．さ ら に 昨 今 ，ア ト ル バ ス タ チ ン (リ ピ ト ー ル® ) 9 ) ， ピ タ バ ス タ チ ン (リ バ ロ® ) 1 0 ) な ら び に ロ ス バ ス タ チ ン (ク レ ス ト ー ル®) 1 1 ) の い わ ゆ る ス ト ロ ン グ ス タ チ ン に ， よ り 強 力 な LDL-C 低 下 作 用 が あ る こ と が 報 告 さ れ ， 心 血 管 イ ベ ン ト 抑 制 率 は 改 善 し て き た が 未 だ 課 題 は 残 る ． ス タ チ ン 製 剤 以 外 と し て は ， 小 腸 コ レ ス テ ロ ー ル ト ラ ン ス ポ ー タ ー (Neimann-Pick C1 like1; NPC1L1) を 阻 害 す る エ ゼ チ ミ ブ (ゼ チ ー ア®) 1 2 ) が ，小 腸 で の コ レ ス テ ロ ー ル 吸 収 を 阻 害 し ， 脂 質 異 常 症 を 改 善 す る 薬 と し て 投 与 さ れ て い る ． エ ゼ チ ミ ブ は 単 剤 で LDL-C を 20% 以 上 低 下 さ せ ，シ ン バ ス タ チ ン と の 併 用 効 果 が 期 待 さ れ た が ，Effect of Combination Ezetimibe and High-Dose of Simvastatin vs Simvastatin Alone on the Atherosclerotic Process in Patients with Heterozygous Familial Hy percholesterolemia (ENHANCE) 試 験 に お い て は 必 ず し も 有 意 義 な 臨 床 結 果 は 確 認 さ れ な か っ た 1 3 )．一 方 ，
IMProved Reduction of Outcomes: Vytorin Efficacy International Trial (IMPROVE-IT) 試 験 に お い て は シ ン バ ス タ チ ン と の 併 用 効 果 が 確 認 さ れ ， ス タ チ ン 製 剤 以 外 で も 心 血 管 イ ベ ン ト を 抑 制 し う る こ と が 証 明 さ れ た 1 4 )．ま た 近 年 ，ヒ ト プ ロ タ ン パ ク 質 転 換 酵 素
サ ブ チ リ シ ン /ケ キ シ ン 9 型 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9; PCSK9) を 阻 害 す る ヒ ト IgG2 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と し て エ ボ ロ ク マ ブ (レ パ ー サ® ) 1 5 ) お よ び ア リ ロ ク マ ブ (プ ラ ル エ ン ト®) 1 6 ) が ， ス タ チ ン 製 剤 で 効 果 不 十 分 な 患 者 に ス タ チ ン 製 剤 と の 併 用 を 原 則 に 投 与 さ れ る ． ス タ チ ン 製 剤 単 独 投 与 と 比 較 し て 併 用 投 与 で は ， LDL-C が さ ら に 低 下 し ， 心 血 管 イ ベ ン ト の 抑 制 効 果 が あ る こ と が 確 認 さ れ た 1 7 , 1 8 )． こ の よ う に NPC1L1 阻 害 剤 や PCSK9 阻 害 剤 は ，ス タ チ ン 製 剤 に よ る 心 血 管 イ ベ ン ト 抑 制 率 を さ ら に 改 善 し う る ． し か し な が ら ， 心 血 管 イ ベ ン ト の 抑 制 効 果 は ま だ 十 分 と は 言 え ず ， ま た PCSK9 阻 害 剤 は 皮 下 注 射 を 要 す る 抗 体 医 薬 と い う こ と も あ り ， よ り
2
利 便 性 の 高 い 新 規 動 脈 硬 化 治 療 薬 が 求 め ら れ て い る ．
Liver X Receptor (LXR) は ，核 内 受 容 体 の 一 つ と し て 1994 年 に 肝 の cDNA ラ イ ブ ラ リ ー よ り ク ロ ー ニ ン グ さ れ ， リ ガ ン ド の 不 明 な オ ー フ ァ ン レ セ プ タ ー と し て 同 定 さ れ た 1 9 )．そ の 後 ，コ レ ス テ ロ ー ル が ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン や 胆 汁 酸 へ と 変 換 さ れ る 際 に 生
じ る オ キ シ ス テ ロ ー ル 類 で あ る (R)−ヒ ド ロ キ シ コ レ ス テ ロ ー ル ， (S)−ヒ ド ロ キ シ コ レ ス テ ロ ー ル お よ び −ヒ ド ロ キ シ コ レ ス テ ロ ー ル な ど が 生 体 内 リ ガ ン ド と し て 報 告 さ れ た (Figure 1) 2 0 )．
Figure 1. Endogenous ligands
LXR に は ， 2 種 類 の サ ブ タ イ プ ( ) が 存 在 し ， LXR は 主 に 肝 臓 ， 脂 肪 組 織 ， 小 腸 ， マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど に 特 異 的 に 発 現 し て い る ． 一 方 ， LXR は 普 遍 的 に 発 現 し て い る 2 1 )．
LXR は N 末 端 よ り 順 に ， activation function -1 (AF-1) ， DNA 結 合 ド メ イ ン (DNA binding domain; DBD)， リ ガ ン ド 結 合 ド メ イ ン (ligand binding domain; LBD) で あ る activation function-2 (AF-2) か ら 構 成 さ れ て い る (Figure 2)．こ の う ち ，AF-1 は 恒 常 的 に 転 写 活 性 能 を 保 持 す る ． 一 方 で AF-2 は ， LBD に リ ガ ン ド が 結 合 す る と 構 造 を 変 化 さ せ ， 転 写 活 性 を 起 こ す (Figure 2-a)． す な わ ち ， リ ガ ン ド が 結 合 す る 前 は ， 主 に co-repressor に よ り 不 活 化 さ れ て お り (Figure 2-b) ， リ ガ ン ド が 結 合 す る と ， 主 に co-activator に よ り 活 性 化 状 態 と な り ， 構 造 変 化 を 生 じ る ． そ れ に 伴 い レ チ ノ イ ド X 受 容 体 (retinoid X receptor; RXR) と ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 し ，DNA 上 の LXR 応 答 配 列 (LXR response element; LXRE) に 結 合 し て 標 的 遺 伝 子 の 転 写 を 誘 導 す る (Figure 2-c)．
3
Figure 2. Mechanism of LXR transcriptional activation 2 2 )
LXR の 活 性 化 は ， 小 腸 に お い て は ATP-binding cassette transporter G5 (ABCG5) お よ び ABCG8 発 現 の 上 昇 に よ る コ レ ス テ ロ ー ル 排 泄 促 進 作 用 を 示 し ，末 梢 血 管 に お い て は ABCA1， ABCG1 発 現 の 上 昇 に よ り コ レ ス テ ロ ー ル 逆 転 送 系 (reverse cholesterol transport; RCT) を 亢 進 し 抗 動 脈 硬 化 作 用 を 示 す 2 3 )． し か し ， 肝 臓 に お い て は sterol
regulatory element -binding protein 1c (SREBP-1c) や 脂 肪 酸 合 成 酵 素 (Fatty acid synthase; FAS) な ど の 脂 肪 酸 合 成 に 関 与 す る 酵 素 を 転 写 促 進 し ， ト リ グ リ セ リ ド (Triglyceride; TG) の 増 加 に 繋 が る 可 能 性 が あ る (Figure 3) 2 4 )． こ の 肝 臓 で の SREBP-1c や FAS な ど に よ る 脂 肪 酸 合 成 の 亢 進 は ， 主 に 肝 臓 に 分 布 し て い る LXR の 活 性 化 作 用 に 起 因 す る ． し た が っ て ， 肝 臓 で の LXR へ の 作 用 も し く は LXR へ の 作 用 を 回 避 す れ ば TG の 増 加 を 回 避 し 得 る と 推 察 さ れ ， LXR ア ゴ ニ ス ト の 創 製 に お い て は ， i) 組 織 選 択 的 LXR ア ゴ ニ ス ト ii) LXR 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト iii) LXR パ ー シ ャ ル ア ゴ ニ ス ト (部 分 活 性 化 薬 ) の 戦 略 が 考 え ら れ る こ と に な る ．
4
Figure 3. Physiological role of LXR activation
多 く の 製 薬 企 業 が 凌 ぎ を 削 る 中 ，Wyeth 社 (現 Pfizer 社 ) は LXR 部 分 活 性 化 薬 と し て ， 自 社 開 発 品 LXR623 (Figure 4) の 臨 床 第 一 相 試 験 を 実 施 し た ． LXR623 は 用 量 依 存 的 に 所 望 の ABCA1 発 現 上 昇 作 用 を 示 し ，懸 念 さ れ て い た TG の 増 加 は 確 認 さ れ ず LDL-C 低 下 作 用 や 心 血 管 イ ベ ン ト 抑 制 作 用 が 期 待 さ れ た 2 5 )． さ ら に 中 型 動 物 の う さ ぎ を 用 い た シ ン バ ス タ チ ン と の 併 用 投 与 試 験 に お い て ， 動 脈 硬 化 の 進 展 抑 制 作 用 お よ び プ ラ ー ク 退 縮 の 促 進 作 用 が 確 認 さ れ た 2 6 )．し か し ，臨 床 第 一 相 試 験 に お い て 中 枢 性 の 副 作 用 が 確 認 さ れ た こ と か ら 開 発 は 中 止 さ れ た 2 7 )． Bristol-Myers Squibb (BMS) 社 と Exelixis 社 に よ る 開 発 品 BMS852927 (Figure 4) は ， 臨 床 第 一 相 試 験 に お い て 好 中 球 減 少 の 副 作 用 が 確 認 さ れ た こ と か ら 開 発 は 中 止 さ れ た 2 8 )．し か し ，こ れ ら の 結 果 か ら は ， TG 上 昇 以 外 の 副 作 用 が LXR ア ゴ ニ ス ト の 標 的 ま た は 化 合 物 に 由 来 す る も の で あ る か ど う か は 不 明 で あ る ．
5
著 者 は ，新 規 な 動 脈 硬 化 治 療 薬 の 開 発 を 目 的 と し て ，ま ず ，ABCA1 mRNA/SREBP-1c mRNA 選 択 性 を 有 す る LXR ア ゴ ニ ス ト の 創 製 を 目 指 す こ と と し た ． す な わ ち ， SREBP-1c mRNA の 発 現 を 低 く 抑 え て 肝 臓 に お け る 脂 肪 酸 合 成 の 増 加 を 抑 制 し ， ABCA1 mRNA の 発 現 促 進 に よ り 末 梢 血 管 に お け る HDL コ レ ス テ ロ ー ル (high-density lipoprotein cholesterol; HDL-C) を 増 加 さ せ て コ レ ス テ ロ ー ル 逆 転 送 系 の 亢 進 に よ っ て 抗 動 脈 硬 化 作 用 に つ な げ よ う と い う 目 論 み で あ る ． ABCA1 mRNA の 発 現 を 促 す 分 子 は ，同 じ ABC フ ァ ミ リ ー に 属 す る ABCG5 や ABCG8 の 活 性 化 に も 寄 与 し ， 小 腸 で の コ レ ス テ ロ ー ル 排 泄 作 用 に よ る LDL-C 低 下 作 用 に つ な が る こ と も 期 待 し た ．
研 究 開 始 当 初 (2003 年 )，合 成 リ ガ ン ド と し て Tularik 社 (現 Amgen) の T0901317 2 9 )
や GlaxoSmithKline (GSK) 社 の GW3965 3 0 ) が 創 薬 ツ ー ル と し て 報 告 さ れ て い た が
(Figure 5)，ABCA1 mRNA/SREBP -1c mRNA 発 現 の 選 択 性 を 有 す る LXR ア ゴ ニ ス ト は 報 告 さ れ て い な か っ た ．
Figure 5. Structure of the LXR agonists from Tularik (T0901317) and GSK (GW3965)
そ こ で 新 規 骨 格 の 探 索 を 目 的 に 自 社 化 合 物 ラ イ ブ ラ リ ー に よ る ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ (high-throughput screening; HTS) を 実 施 し た ．
約 56,000 化 合 物 の ア ッ セ イ 結 果 か ら ，著 者 は 選 択 性 を 有 す る 7 化 合 物 を 選 出 し た ． し か し な が ら ， 各 HTS ヒ ッ ト 化 合 物 の 周 辺 構 造 を 鋭 意 検 討 し た が ， 十 分 な ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 と ABCA1 mRNA/SREBP -1c mRNA 発 現 の 選 択 性 を 有 す る 化 合 物 を 見 出 す に は 至 ら な か っ た ． こ の 結 果 を 受 け 著 者 は ， LXR と LXR の 構 造 の 差 異 に 基 づ く 分 子 設 計 に よ っ て ， LXR 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト を 創 製 す る こ と に 方 針 を 転 換 し た ． LXR と LXR の リ ガ ン ド 結 合 部 位 の ホ モ ロ ジ ー は 高 く ， 当 時 LXR 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト の 報 告 は な か っ た ． ま ず ， LXR デ ュ ア ル ア ゴ ニ ス ト で あ る T0901317 の LXR と の 共 結 晶 の X 線 結 晶 構 造 解 析 ， お よ び 僅 か な が ら LXR 活 性 化 作 用 に 差 を 有 す る GW3965 の LXR と の 共 結 晶 の X 線 結 晶 構 造 解 析 に 注 目 し た (Figure 6)． LXR の 活 性 化 作 用 は ， リ ガ ン ド と LXR の 結 合 領 域 と の 相 互 作 用‘ His435-Trp457 activation switch’に よ り 発 現 す る こ と が 提 唱 さ れ て い た 3 1 )． T0901317 で あ れ ば 1,1-ビ ス (ト リ フ ル オ ロ メ チ ル )
6 カ ル ビ ノ ー ル 部 位 の 水 酸 基 と LXR の 結 合 領 域 で あ る His435 と の 相 互 作 用 が ， GW3965 で あ れ ば 2-ク ロ ロ -3-ト リ フ ル オ ロ メ チ ル フ ェ ニ ル 部 位 の ト リ フ ル オ ロ メ チ ル 基 と LXR の 結 合 領 域 で あ る His435 と の 相 互 作 用 が こ れ に 当 た る ． さ ら に GW3965 で は ，カ ル ボ ン 酸 部 位 が ，周 辺 の ア ミ ノ 酸 で あ る Arg319 と Leu330 の 主 鎖 の ア ミ ド 結 合 の NH を 含 ん だ 極 性 ポ ケ ッ ト と 相 互 作 用 し て い る こ と が 確 認 さ れ て い る 3 2 )．
Figure 6. X-ray crystal structure of T0901317 or GW3965 with LXR
著 者 は ， LXR 活 性 化 作 用 に 重 要 な 部 分 (head 部 分 ) と LXR 選 択 性 を 発 現 す る 可 能 性 を 有 す る 部 分 (tail 部 分 ) と を 想 定 し て 考 え る‘ head-to-tail’の ド ラ ッ グ デ ザ イ ン を 基 に 構 造 最 適 化 を お こ な い ，最 終 的 に 世 界 で も 稀 に 見 る 高 い LXR 選 択 性 と 高 活 性 を 示 す 化 合 物 (Scheme 6, (S)-(−)-10) の 創 製 に 成 功 し た ．本 論 文 は ，そ の 詳 細 を 述 べ る も の で あ る ． 本 論 の 第 一 章 第 一 節 で は ，ま ず ，HTS で 見 出 し た ヒ ッ ト 化 合 物 1 を も と に LXR 選 択 性 を 示 す 化 合 物 2 を 見 出 し た 経 緯 を 述 べ る ． す な わ ち ， head 部 分 に 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 構 造 を ， tail 部 分 に イ ミ ダ ゾ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン (ヒ ダ ン ト イ ン ) 構 造 を 有 し ， お の お の を 適 切 な メ チ レ ン リ ン カ ー で 結 合 さ せ た 化 合 物 で あ る (Figure 7) 3 3 )． 残 念 な が ら ， head 部 分 の 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 構 造 は ， 生 体 内 で 速 や か に 代 謝 さ れ る こ と が 判 明 し ， 化 合 物 2 は さ ら な る 最 適 化 を 必 要 と し た が ， LXR 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト 創 製 の た め の 有 用 な 情 報 を 得 る こ と が で き た ．
7 Figure 7 第 一 章 第 二 節 で は ， 化 合 物 2 を も と に LXR 活 性 化 作 用 と 選 択 性 お よ び 代 謝 安 定 性 の 向 上 を 目 指 し ，head 部 分 の 探 索 合 成 を お こ な っ た 結 果 に つ い て 述 べ る ．化 合 物 2 の 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 構 造 は ，LXR の 結 合 領 域 で あ る His435 と 相 互 作 用 し て い る と 考 え ら れ る が ， 活 性 発 現 は 十 分 で は な か っ た ． そ こ で head 部 分 の 原 子 配 置 ， 距 離 あ る い は 角 度 を 考 慮 し な が ら 構 造 変 換 を お こ な っ た ． そ の 結 果 ， 1,3-ジ ヒ ド ロ イ ソ ベ ン ゾ フ ラ ン 骨 格 を 有 す る 化 合 物 3 が ， T0901317 と 同 等 以 上 の LXR 活 性 化 作 用 を 有 す る と と も に 代 謝 安 定 性 も 向 上 す る こ と が 判 明 し た (Figure 8) 3 4 )． し か し ， LXR 選 択 性 が 低 下 す る と い う 課 題 を 残 し た ． Figure 8 第 一 章 第 三 節 で は ， head 部 位 に 1,1-ビ ス (ト リ フ ル オ ロ メ チ ル )カ ル ビ ノ ー ル 構 造 を も つ 化 合 物 4 の 創 製 と そ の 活 性 に つ い て 述 べ る ． こ の 化 合 物 は ， 上 記 の 化 合 物 3 の 1,3-ジ ヒ ド ロ イ ソ ベ ン ゾ フ ラ ン 環 を 開 裂 し た も の に 相 当 し ，T0901317 の head 部 位 を 念 頭 に 置 い て デ ザ イ ン し た も の で あ る ．こ の head 構 造 を も つ 誘 導 体 の LXR 活 性 化 作 用 は ， T0901317 と 比 べ て 同 等 以 上 で あ り ，化 合 物 2 と 比 べ て 代 謝 安 定 性 も 改 善 し た ．さ ら に ヒ ダ ン ト イ ン 部 位 の 構 造 最 適 化 検 討 に よ り LXR 選 択 的 活 性 化 作 用 を 示 す
8 化 合 物 4 (EC5 0 (): 1.2 M) を 見 出 し た (Figure 9) 3 5 )． 化 合 物 4 は ， 動 脈 硬 化 モ デ ル で あ る 高 脂 肪 食 負 荷 F1B Bio ハ ム ス タ ー に お い て ，100 mg/kg 反 複 経 口 投 与 に て 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 を 示 し た ． そ こ で ， 著 者 は こ の 化 合 物 を リ ー ド 化 合 物 と し て 位 置 付 け る こ と と し た ． Figure 9 次 に 著 者 は ， リ ー ド 化 合 物 4 お よ び 合 成 中 間 体 で あ る ヒ ダ ン ト イ ン 5 を 光 学 分 割 す る 方 法 を 開 発 し ，そ の 結 果 ，化 合 物 4 は 鏡 像 異 性 体 の 一 方 に の み 所 望 の LXR 活 性 化 作 用 が あ る こ と を 明 ら か に し た (Scheme 1) 3 6 )．そ の 詳 細 を ，第 二 章 第 一 節 第 一 項 か ら 第 三 項 で 述 べ る ． Scheme 1 第 二 章 第 一 節 第 四 項 で は ， 光 学 分 割 法 で 得 た 5-(4-(1-メ チ ル エ ト キ シ )フ ェ ニ ル )-5-メ チ ル イ ミ ダ ゾ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン 中 間 体 (+)-5 の 絶 対 立 体 配 置 の 決 定 法 に つ い て 述 べ る ． 化 合 物 (+)-5 を NCS を 用 い る 塩 素 化 に よ っ て ， (+)-Cl-6 へ と 誘 導 し ， X 線 結 晶 構 造 解 析 し た と こ ろ ，(+)-5 の 絶 対 立 体 配 置 は S で あ る こ と を 決 定 で き た (Scheme 2) 3 6 )．
9 Scheme 2 続 い て ，上 述 の 結 果 を も と に 鍵 中 間 体 で あ る (+)-5 を 安 定 に 大 量 合 成 す る 方 法 を 開 発 し た (Scheme 3) 3 6 )． す な わ ち ， ま ず 1-(4-(1-メ チ ル エ ト キ シ )フ ェ ニ ル )エ タ ン -1-オ ン (7) を ，ラ セ ミ 体 の 5 を 経 由 し て ア ミ ノ 酸 エ ス テ ル 誘 導 体 8 へ と 誘 導 す る ．こ れ を L-(+)-マ ン デ ル 酸 を 用 い た ジ ア ス テ レ オ マ ー 塩 の 形 成 に よ り 光 学 分 割 し ， 次 い で ， 尿 素 を 用 い て 閉 環 反 応 す る こ と に よ っ て (+)-5 を 高 い 鏡 像 体 過 剰 率 (≧ 99% ee) で 得 る と い う 製 造 法 で あ る ． そ の 詳 細 を ， 第 二 章 第 一 節 第 五 項 で 述 べ る ． Scheme 3 第 二 章 第 二 節 で は ，化 合 物 4 の 血 中 濃 度 推 移 を 検 証 し た 結 果 に つ い て 述 べ る ．化 合 物 4 は in vitro で の 代 謝 安 定 性 は 改 善 し た も の の ，in vivo で は カ ル ボ ン 酸 体 9 へ と 比 較 的 速 や か に 代 謝 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た (Figure 10) 3 6 )． こ の 結 果 か ら ， 血 中
ABCA1 発 現 を 上 昇 で き な か っ た 理 由 と し て ， 代 謝 に よ り 必 要 な 血 中 濃 度 を 有 し て い な か っ た こ と が 示 唆 さ れ た ．
10 Figure 10 と こ ろ で ， 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 に は LDL-C 低 下 作 用 の 寄 与 が 大 き い こ と か ら ， 化 合 物 4 に は 脂 質 異 常 改 善 薬 と し て の 可 能 性 が あ る こ と が 示 唆 さ れ た ．一 方 ，化 合 物 4 は ， 末 梢 血 管 へ の 直 接 的 な 作 用 が 少 な く ，動 脈 硬 化 治 療 薬 と し て の 開 発 に は 課 題 を 残 し た ． そ こ で ， 末 梢 血 管 へ の 直 接 的 な 作 用 を 有 す る 化 合 物 を 見 出 す べ く 新 た な 合 成 展 開 を 試 み る こ と と し た ． こ こ で ま ず ， 活 性 発 現 に 必 要 な カ ル ビ ノ ー ル 部 位 と 選 択 性 発 現 に 必 要 な ヒ ダ ン ト イ ン 部 位 と を 結 ぶ リ ン カ ー 部 位 を 柔 軟 性 の あ る 直 鎖 の ブ タ ン 構 造 か ら 堅 牢 な 構 造 に 変 え ，両 部 位 間 の 距 離 と 配 向 性 を 考 慮 す る こ と と し た ．ま た ，LXR 活 性 化 作 用 と LXR 選 択 性 の 向 上 だ け で は な く ，さ ら な る 代 謝 安 定 性 の 向 上 も 必 要 で あ っ た た め ， 分 子 全 体 の 脂 溶 性 を 低 減 さ せ る こ と を 考 え た ． 検 討 の 結 果 ， リ ン カ ー 部 位 に 2-ヒ ド ロ キ シ ア セ ト フ ェ ノ ン 構 造 を 導 入 し た 化 合 物 10 (EC5 0 (): 0.058 M) に ，こ れ ま で に な く 高 い LXR 活 性 化 作 用 ，LXR 選 択 性 お よ び 顕 著 な 代 謝 安 定 性 の 改 善 が 確 認 さ れ た (Figure 11) 3 7 )．さ ら に 化 合 物 10 の 鏡 像 異 性 体 の う ち 良 好 な LXR 活 性 を 示 す (−)-10 は ，動 脈 硬 化 モ デ ル で あ る 高 脂 肪 食 負 荷 low-density lipoprotein (LDL) 受 容 体 欠 損 マ ウ ス に お い て ， 1 mg/kg 反 複 経 口 投 与 に て 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 を 示 し た ． こ れ ら の 結 果 に 基 づ き ， 著 者 は 当 該 化 合 物 を 安 全 性 評 価 候 補 化 合 物 の 一 つ と し て 位 置 付 け る こ と と し た ． そ の 詳 細 を 第 三 章 で 述 べ る ． Figure 11
11 次 に 著 者 は ，化 合 物 (−)-10 の 絶 対 立 体 配 置 を 決 定 し た ．す な わ ち ，化 合 物 (−)-10 の tail 部 分 と な る 5-(5-(1- メ チ ル エ ト キ シ ) ピ リ ジ ン -2- イ ル )-5- メ チ ル イ ミ ダ ゾ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン (ヒ ダ ン ト イ ン 中 間 体 (+)-11) を 光 学 分 割 に よ っ て 調 製 し ， そ の 臭 化 水 素 塩 の X 線 結 晶 構 造 解 析 を 実 施 し た (Scheme 4) 3 8 )． そ の 結 果 ， (+)-11 の 絶 対 立 体 配 置 は S で あ る こ と が 確 認 さ れ た ． そ の 詳 細 を 第 四 章 第 一 節 で 述 べ る ． Scheme 4 第 四 章 第 二 節 で は ， 鍵 中 間 体 と な る (+)-11 を 安 定 に 大 量 合 成 す る 方 法 に つ い て 述 べ る (Scheme 5) 3 8 )．す な わ ち ，ピ リ ジ ン 誘 導 体 12 よ り 合 成 し た ラ セ ミ 体 の ヒ ダ ン ト イ ン (±)-11 を ア ミ ノ 酸 エ ス テ ル 13 へ と 変 換 し ，D-(−)-マ ン デ ル 酸 を 用 い て ジ ア ス テ レ オ マ ー 塩 を 形 成 さ せ 光 学 分 割 す る こ と に よ り (+)-13 を 得 た ． こ れ を ， 尿 素 を 用 い て 閉 環 反 応 す る こ と で ，(+)-11 を 高 い 鏡 像 体 過 剰 率 (≧ 99% ee) で 得 る こ と が で き た ． Scheme 5 続 い て ， 化 合 物 (−)-10 を さ ら な る 動 物 試 験 評 価 に 十 分 量 供 す る こ と を 目 的 に ， そ の 効 率 的 合 成 法 を 検 討 し た (Scheme 6) 3 8 )． 2-プ ロ ピ ル ア ニ リ ン (14) の 1,1,1,3,3,3-ヘ キ サ フ ル オ ロ ア セ ト ン へ の 付 加 反 応 に よ り カ ル ビ ノ ー ル 部 位 を 構 築 後 ， 得 ら れ た ア ニ リ ン 誘 導 体 15 の ア ミ ノ 基 を Sandmeyer 反 応 に よ り 水 酸 基 へ 変 換 し ，さ ら に カ ル ビ ノ ー ル 水 酸 基 を ベ ン ジ ル 基 に て 選 択 的 に 保 護 し た ． 次 い で ， 1-(2-(ベ ン ジ ル オ キ シ )-4-フ ル オ ロ )-4-フ ェ ニ ル )エ タ ン -1-オ ン (17) と の 反 応 に よ り ジ )-4-フ ェ ニ ル エ ー テ ル 18 へ と
12 誘 導 し た 後 ， カ ル ボ ニ ル 基 の 位 を 臭 素 化 し て 19 を 合 成 し た ． 化 合 物 19 を 用 い て ヒ ダ ン ト イ ン (+)-11 を ア ル キ ル 化 し た 後 ， 得 ら れ た 化 合 物 20 の 二 つ の ベ ン ジ ル 基 を 加 水 素 分 解 反 応 に よ り 除 去 す る こ と に よ り (S)-(−)-10 を 得 る こ と が で き た ．こ の 合 成 法 の 開 発 に よ り ， 初 期 合 成 法 と 比 較 し て 工 程 数 お よ び 収 率 を 格 段 に 改 善 す る こ と に 成 功 し た ． そ の 詳 細 を 第 四 章 第 三 節 で 述 べ る ． Scheme 6 こ う し て ， 所 期 の 目 的 で あ っ た 高 活 性 か つ 高 選 択 的 な LXR ア ゴ ニ ス ト (S)-(−)-10 の 創 製 に 成 功 し た ．(S)-(−)-10 は 世 界 で 稀 に 見 る LXR 高 選 択 性 お よ び 高 活 性 を 示 し ， 動 脈 硬 化 疾 患 モ デ ル に お い て も 優 れ た 薬 理 効 果 を 示 す こ と か ら LXR ア ゴ ニ ス ト の 創 薬 研 究 に お い て 有 用 な 情 報 を 提 供 す る も の と 期 待 で き る ． 以 下 ， 各 章 に て 詳 細 を 論 ず る ．
13
第一 章 Liver X Receptor 選択的アゴニスト の創製~Hit to Lead~
第 一 節 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 の 創 製
第 一 項 ド ラ ッ グ デ ザ イ ン ①
著 者 は ， 新 規 動 脈 硬 化 治 療 薬 の 創 製 を 目 指 し ， ま ず ， 緒 言 で 述 べ た よ う に ABCA1 mRNA/SREBP-1c mRNA 選 択 性 を 有 す る LXR ア ゴ ニ ス ト の 探 索 を 開 始 し た ． は じ め に ， ヒ ト 単 球 由 来 の THP-1 細 胞 を 用 い て ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 を 評 価 し た ． す な わ ち ， ラ ン ダ ム ラ イ ブ ラ リ ー 48,000 化 合 物 ， 核 内 受 容 体 ラ イ ブ ラ リ ー 6,696 化 合 物 ， さ ら に 自 社 ラ イ ブ ラ リ ー 1,368 化 合 物 の 計 56,064 化 合 物 を 用 い て ， 10 M の 濃 度 に て HTS を 実 施 し た (Figure 12, Table 1)．各 化 合 物 は DMSO 溶 液 と し て 調 製 し た ． ま た ， DMSO の み を 添 加 し た と き の 値 を 100%と し ， こ の 値 を コ ン ト ロ ー ル と し て ， 各 化 合 物 を 評 価 し た ．< HTS flow >
14
以 下 に HTS ヒ ッ ト 化 合 物 の 構 造 と ス ク リ ー ニ ン グ 結 果 を 示 す ．
Table 1. Structure and in vitro result of the HTS hit compoundsa
Compound Structure ABCA1b SREBP1cc ABCA1/SREBP -1cd
21 5.1 0.8 6.4 22 5.0 1.4 3.6 23 2.5 0.8 3.1 24 0.8 0.3 2.7 25 3.8 1.5 2.5 26 2.4 1.0 2.4 27 2.2 1.0 2.2
a The assays was conducted at 10 M. b The value is ratio of activation relative to control
(DMSO). ABCA1 mRNA expression was assayed in THP1 cell. c The value is ratio of
activation relative to control (DMSO). SREBP -1c mRNA expression was assayed in HepG2 cell. d The value is ABCA1 mRNA/SREBP-1c mRNA expression ratio .
15
そ の 結 果 ， コ ン ト ロ ー ル の 200%以 上 の ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 を 示 す 化 合 物 を 計 78 個 見 出 し た ．そ の 後 ，こ の 78 化 合 物 に つ い て ，ヒ ト 肝 癌 由 来 の HepG2 細 胞 に お け る SREBP-1c mRNA 発 現 亢 進 作 用 を 評 価 し た ． す な わ ち ， ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 を 評 価 し た と き と 同 様 に ， DMSO を 添 加 し た と き の 値 を コ ン ト ロ ー ル (100%) と し ， 各 化 合 物 は DMSO 溶 液 と し て 調 製 し ， 濃 度 10 M に て 評 価 し た ．
ABCA1 mRNA お よ び SREBP-1c mRNA 発 現 亢 進 作 用 の コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 値 を 用 い て ， ABCA1 mRNA/SREBP-1c mRNA 発 現 亢 進 作 用 の 比 が 大 き い 7 化 合 物 を HTS ヒ ッ ト 化 合 物 と し て 選 出 し た ．ま た ，各 化 合 物 に つ い て ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ に よ っ て LXR 活 性 化 作 用 を 確 認 し た ． HTS ヒ ッ ト 7 化 合 物 の う ち ， 4 化 合 物 (21, 25, 26, 27) に 9-ア ミ ノ ア ク リ ジ ン 構 造 が 含 ま れ て い る こ と が 判 明 し た ．し か し ，一 般 に 9-ア ミ ノ ア ク リ ジ ン 類 縁 体 に は 発 癌 性 が 懸 念 さ れ る た め ， そ の 後 の 検 討 か ら は 除 外 し た 3 9 )． 一 方 ， 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 構 造 を 有 す る 化 合 物 22 と ナ フ タ レ ン -1,4-ジ オ ン 構 造 を 有 す る 化 合 物 23, 24 に つ い て は 種 々 の 誘 導 体 を 合 成 し ，ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 を 調 べ た ．そ の 結 果 ，化 合 物 23, 24 の 誘 導 体 か ら は 良 好 な 作 用 を 有 す る 化 合 物 を 見 出 せ な か っ た が (デ ー タ 不 記 載 )，
Table 2. Structure and cellular activity of the 2-oxochromene derivativesa
Compound ABCA1b SREBP-1cc ABCA1/SREBP -1cd
22 5.0 1.4 3.5
28 1.3 3.3 0.4
1 9.1 3.9 2.4
GW3965 15.0 4.9 3.1
a The assays was conducted at 10 M. b The value is ratio of activation relative to control
(DMSO). ABCA1 mRNA expressio n was assayed in THP1 cell. c The value is ratio of
activation relative to control (DMSO). SREBP -1c mRNA expression was assayed in HepG2 cell. d The value is ABCA1 mRNA/SREBP -1c mRNA expression ratio.
16
化 合 物 22 の 誘 導 体 か ら は 二 つ の 化 合 物 28， 1 が 見 出 さ れ た (Table 2)． こ れ ら 化 合 物 は ，2-オ キ ソ ク ロ メ ン 骨 格 の 4 位 に 疎 水 性 置 換 基 で あ る ト リ フ ル オ ロ メ チ ル 基 を 有 す る も の で あ っ た ．化 合 物 22, 28, 1 は い ず れ も ，GW3965 と 比 べ て ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 が 低 く ， ま た ， キ ノ リ ジ ン 骨 格 を も た な い 化 合 物 28 は ， キ ノ リ ジ ン 骨 格 を 有 す る 化 合 物 22 お よ び 1 と 比 べ て ， ABCA1 mRNA/SREBP-1c mRNA 発 現 の 選 択 性 が 低 か っ た ． そ こ で ， こ の 選 択 性 の 向 上 を 目 指 し ， 化 合 物 1 の 類 縁 体 を 種 々 合 成 し た が ， 残 念 な が ら 十 分 な 選 択 性 を 有 す る 化 合 物 を 見 出 す こ と は で き な か っ た ．
そ こ で 方 針 を 転 換 し ，ABCA1 mRNA 発 現 亢 進 作 用 と SREBP-1c mRNA 発 現 亢 進 作 用 に 基 づ い て 探 索 を お こ な う の で は な く ， 転 写 促 進 作 用 の 上 流 に 位 置 す る 受 容 体 (LXR) の 構 造 そ の も の に 着 目 し ，LXR 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト の 創 製 を 目 指 す こ と に し た ． LXR と LXR の サ ブ タ イ プ の リ ガ ン ド 結 合 領 域 の ホ モ ロ ジ ー は 高 く 3 1 )，当 時 LXR 高 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト の 報 告 は な か っ た が ， わ ず か で は あ る も の の GW3965 が LXR 選 択 性 を 有 し て い た こ と か ら ， そ の 構 造 に 着 目 し た ． LXR と の 共 結 晶 の Ｘ 線 結 晶 構 造 に お い て ，LXR デ ュ ア ル ア ゴ ニ ス ト で あ る T0901317 は ，受 容 体 の 疎 水 性 領 域 と 呼 ば れ て い る 部 分 (head 部 分 ) と の 相 互 作 用 を 有 し ，さ ら に そ の 中 で ， 分 子 の カ ル ビ ノ ー ル 部 位 の 水 酸 基 が 受 容 体 の His435 と 水 素 結 合 し て い る (Figure 13)． 一 方 ， GW3965 は ， 疎 水 性 領 域 で あ る head 部 分 と の 相 互 作 用 に 加 え て 2-ク ロ ロ -3-ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ベ ン ジ ル 部 位 の フ ッ 素 原 子 が His435 と 相 互 作 用 を 有 し て い る ．さ ら に ， Figure 13 の 右 側 に 位 置 す る 領 域 (tail 部 分 ) で は ， GW3965 の カ ル ボ ン 酸 部 位 周 辺 が Arg319 お よ び Leu330 と 相 互 作 用 し て い る 3 2 , 3 3 )． こ の こ と か ら tail 部 分 へ の 相 互
17
Figure 13. X-ray crystal structure s of T0901317 (PDB ID: 1PQ9) and GW3965 (PDB ID: 1PQ6): A pink line show the hydrogen bond. A green line show the - interaction. A red dotted line show our attracted area.
と こ ろ で ， 一 般 に LXR の 活 性 化 の た め に は ， His435 と リ ガ ン ド が 相 互 作 用 す る こ と に よ り ，‘ His435-Trp457 activation switch’と 呼 ば れ る 部 位 が 活 性 化 さ れ る こ と が 重 要 で あ る と 報 告 さ れ て い る 3 2 c )． こ の こ と を 踏 ま え Table 2 の 結 果 を 以 下 の よ う に 推 察 し た ． ① 化 合 物 1 の カ ル ボ ニ ル 基 の 酸 素 原 子 が ， His435 と 相 互 作 用 し て い る ． ② 8 位 の 置 換 基 は ， LXR の 高 度 に 疎 水 的 な LXR リ ガ ン ド 結 合 ポ ケ ッ ト (head 部 分 ) と 疎 水 性 相 互 作 用 し て い る ． ③ キ ノ リ ジ ン 部 位 は ， Thr316 や Phe340 と 疎 水 性 相 互 作 用 し て い る ．
18
た だ し ， 化 合 物 1 の 発 現 亢 進 作 用 が GW3965 と 比 べ て 低 か っ た こ と か ら ， 上 記 3 つ の 相 互 作 用 は 十 分 な も の で は な い と 考 え た ． ま た ， 平 面 性 の 高 い 構 造 は ， DNA 鎖 に イ ン タ ー カ レ ー シ ョ ン を 起 こ し て し ま う こ と も 懸 念 さ れ た 4 0 )．
さ ら に ，化 合 物 1 は ア ン ド ロ ゲ ン 受 容 体 (Androgen receptor; AR)，ペ ル オ キ シ ソ ー ム 増 殖 因 子 活 性 化 受 容 体 (Peroxisome proliferator activated receptor; PPAR) (サ ブ タ イ プ )，フ ァ ル ネ ソ イ ド X レ セ プ タ ー (farnesoid X recptor; FXR) の ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ に お い て ，活 性 化 作 用 が 確 認 さ れ た (デ ー タ 不 記 載 )．し た が っ て ，他 の 核 内 受 容 体 と の 選 択 性 を 確 保 す る こ と も 不 可 欠 で あ っ た ．
と こ ろ で ， Merck 社 は ， 化 合 物 29 が 化 合 物 1 と 比 べ て 強 い LXR 活 性 化 作 用 を 示 す こ と を 報 告 し て い た (Figure 14) 4 1 )．
Figure 14. Structure of the LXR agonists from Merck (compound 29)
そ こ で 著 者 は ，あ ら た め て 以 下 の 点 を 念 頭 に お い て ，構 造 最 適 化 を 図 る こ と と し た ．
① 化 合 物 1 と GW3965 と の ド ッ キ ン グ モ デ ル 4 2 ) に よ れ ば ，化 合 物 1 の head 部
分 が His435 と 相 互 作 用 し て い る こ と が 示 唆 さ れ る が ，Leu330 側 の 領 域 (tail 部 分 ) で の 相 互 作 用 は な い (Figure 15)． ② LXR 選 択 性 の 発 現 に は ， tail 部 分 の 相 互 作 用 が 必 要 で あ る ． ③ ピ ペ リ ジ ン 環 の 炭 素 － 窒 素 結 合 を 開 裂 し ， 構 造 の 平 面 性 を 崩 す こ と が 必 要 で あ る ． ④ メ ル ク 社 の 化 合 物 29 に お け る ベ ン ゾ イ ソ キ サ ゾ ー ル 環 上 の 3 位 の ト リ フ ル オ ロ メ チ ル 基 と 7 位 の プ ロ ピ ル 基 の 位 置 関 係 は ， 著 者 の 化 合 物 1 の 構 造 と 共 通 し て い る ． 一 方 で ， 化 合 物 29 は チ ア ゾ リ ジ ン ジ ノ ン 部 位 を 有 し て お り ， tail 部 分 と 相 互 作 用 す る こ と に よ り LXR 活 性 化 作 用 が 増 強 さ れ て い る も の と 推 察 さ れ る (Figure 16)．
19 な お ，GW3965 の head 部 分 と tail 部 分 と の 距 離 を ，計 算 化 学 を 用 い て 算 出 し た 結 果 ，11～ 12Å で あ る こ と が 推 察 さ れ た ．そ こ で ， GW3965 と LXR と の 共 結 晶 の X 線 結 晶 構 造 を 用 い て ，化 合 物 1 と の ド ッ キ ン グ モ デ ル を 作 製 し ，リ ガ ン ド の 結 合 位 置 を 考 察 し た ．そ の 結 果 ，GW3965 の head 部 分 と 化 合 物 1 は 同 様 な 位 置 で 受 容 体 と 相 互 作 用 し て い る こ と が 推 察 さ れ た ． し た が っ て ， head 部 分 で あ る 化 合 物 1 の 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 骨 格 か ら 11～ 12Å の 距 離 に ，tail 部 分 と し て チ ア ゾ リ ジ ノ ン ，ま た は ， そ の 類 似 構 造 を 導 入 す れ ば LXR 活 性 化 作 用 を 増 強 す る こ と が で き る と 推 察 し ， リ ン カ ー と し て は ブ タ ン 構 造 を 用 い る こ と と し た (Figure 16)．
20
Figure 16. Our drug design of head -to-tail strategy
第 二 項 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 の 合 成
前 項 で 述 べ た よ う に ， 著 者 は LXR 選 択 的 ア ゴ ニ ス ト の 創 製 を 目 指 し ， 構 造 式 A お よ び B で 表 さ れ る 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 (Figure 17) を デ ザ イ ン し た ． は じ め に ， そ の 合 成 に 向 け ， head 部 分 の 合 成 フ ラ グ メ ン ト と な る フ ェ ノ ー ル 34 (Scheme 7) お よ び フ ェ ノ ー ル 38 (Scheme 8) を 合 成 し た ．Figure 17. Structure of the 2-oxochromen derivatives A and B
す な わ ち ，ま ず 1,3-ジ ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゼ ン (30) を ア リ ル エ ー テ ル 化 し た 後 ，Claisen 転 位 反 応 4 3 ) に よ り 2,4-ジ ア リ ル ベ ン ゼ ン -1,3-ジ オ ー ル (32) に 変 換 し た ．接 触 水 素 添
加 反 応 に よ り ア リ ル 基 を 還 元 後 ， 得 ら れ た 化 合 物 33 と 4,4,4-ト リ フ ル オ ロ -3-オ キ ソ ブ タ ン 酸 エ チ ル と を ZnCl2 の 存 在 下 ， 110 °C に 加 熱 し て 縮 合 さ せ る こ と に よ り ， 化
21
Scheme 7. Reagents and conditions: (a) allyl chloride, K2CO3, DMF, 70 °C, 24 h, 85%; (b)
N,N-dimethylaniline, 200 °C, 1 6 h, 57%; (c) H2 , Pd/C, MeOH, rt, 18 h, 98%; (d) ethyl 4,4,
4-trifluoro-3-oxobutanoate, ZnCl2, 110 °C, 18 h, 59%. ま た ， 1,3-ジ メ ト キ シ ベ ン ゼ ン (35) を n-ブ チ ル リ チ ウ ム を 用 い て リ チ オ 化 し ， 続 い て 1-ヨ ー ド プ ロ パ ン を 用 い て ア ル キ ル 化 す る こ と に よ り 1,3-ジ メ ト キ シ -2-プ ロ ピ ル ベ ン ゼ ン (36) を 得 た ． ジ ク ロ ロ メ タ ン 溶 媒 中 で 三 臭 化 ホ ウ 素 を 作 用 さ せ る こ と に よ り 脱 メ チ ル 化 し た 後 ，化 合 物 33 と 同 様 の 方 法 で 4,4,4-ト リ フ ル オ ロ -3-オ キ ソ ブ タ ン 酸 エ チ ル を 縮 合 さ せ る こ と に よ り ， 化 合 物 38 を 得 た ．
Scheme 8. Reagents and conditions: (a) n-BuLi, THF, 0 °C, 2 h; then PrI, 0 °C to rt, 22 h, 45%; (b) BBr3, CH2Cl2, −70 °C, 1 h to rt, 2 h, 76%; (c) ethyl 4,4,4 -trifluoro-3-oxobutanoate, ZnCl2, 110 °C, 18 h, 77%. こ う し て 合 成 し た 化 合 物 34 お よ び 38 を ， 次 に ， DMF 溶 媒 中 ， K2CO3 の 存 在 下 で 過 剰 量 (8–10 当 量 ) の 1,4-ジ ブ ロ モ ブ タ ン と 反 応 さ せ ， そ れ ぞ れ 臭 化 ア ル キ ル 体 39, 40 へ と 変 換 し た ．さ ら に ，そ れ ら を DMF 溶 媒 中 ，K2CO3 の 存 在 下 で チ ア ゾ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン ，ピ ロ リ ジ ン -2,5-ジ オ ン ，オ キ サ ゾ リ ン -2-オ ン ，ピ ロ リ ジ ン -2-オ ン お よ び 各 種 イ ミ ダ ゾ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン (ヒ ダ ン ト イ ン ) (Figure 18) と 反 応 さ せ て ，tail 部 位 を 導 入 す る こ と に よ り ， 目 的 と す る A， B を 得 た (Scheme 9)．
22
Scheme 9. Reagents and conditions: (a) 1,4 -dibromobutane, K2CO3, DMF, rt, 18–21 h,
80-96%; (b) tail parts, K2CO3, DMF, rt, 16–20 h, 51–99%.
Figure 18. Structure of tail parts
な お ，各 種 ヒ ダ ン ト イ ン 42 は Scheme 10 に 示 す 方 法 に し た が っ て 合 成 し た ．す な わ ち ， 対 応 す る ケ ト ン 41 を 含 水 エ タ ノ ー ル 中 で NaCN と (NH4)2CO3 と と も に 加 熱
す る こ と に よ り (Bucherer-Bergs 反 応 4 4 ))， 化 合 物 42 を 得 た ．
23
第 三 項 構 造 活 性 相 関 ①
Gal4-h-LXR を 用 い た レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 ア ッ セ イ を 用 い て ， 合 成 し た 各 化 合 物 に よ る LXR お よ び LXR の 活 性 化 (EC5 0 値 ) を 測 定 し た ． LXR/ デ ュ ア ル ア ゴ ニ ス ト で あ る T0901317 の 10 M に お け る 各 サ ブ タ イ プ の 活 性 強 度 を 100% と し ， 各 化 合 物 の 活 性 化 強 度 (Ema x 値 ) を 求 め た (Table 3)． ま ず ， 著 者 は 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 A の tail 部 分 の X お よ び Y に 位 置 す る 原 子 ま た は 置 換 基 の 効 果 を 検 討 し た ． そ の 結 果 を Table 3 に 示 す ． チ ア ゾ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン 体 43 (X = S, Y = O) は ， EC5 0 () 値 1.4 M お よ び LXR の Ema x (Ema x ( ) 値 ) 45% の 活 性 化 強 度 で あ り ，Ema x / 比 で 倍 の 選 択 性 を 示 し た ． ヒ ダ ン ト イ ン 体 44 (X = NMe, Y = O) は ， 43 と ほ ぼ 同 等 の 活 性 化 お よ び 選 択 性 を 示 し た ． 一 方 ， X に メ チ レ ン 鎖 を 有 す る ピ ロ リ ジ ン -2,4-ジ オ ン 体 45 (X = CH2, Y = O) は Ema x 比 で 倍 の 選 択 性 を 示 し た が ， Ema x () 値 は 減 少 し た ． ま た ， オ キ サTable 3. LXR activity of the 2-oxochromene derivatives Aa
Compound X Y LXR EC5 0b (%)c LXR EC5 0b (%)c Selectivity for Ema x d 43 S O 2.6 (6) 1.4 (45) 7 44 NMe O 2.6 (10) 1.3 (47) 4.7 45 CH2 O nd (2) 1.4 (22) 11 46 O H2 nd (1) 2.2 (5) 5 47 CH2 H2 ia (0) ia (0) 0 nd = not determined. ia = inactive at 10 M.
a GAL4-LXR luciferase assay were performed with a top dose of 30 M. The results are
given as the mean of two independent experiments. b EC
5 0 data is reported in M. c The %
of efficacy is defined as the percentage ratio between maximum fold induction for the test
compound and fold induction for T0901317 at 10 M in the same experiment.4 5 ) d selectivity = The value of selectivity is LXR E
24
ゾ リ ジ ン−−オ ン 体 46 (X = O, Y = H2) で は ， Ema x () 値 が 減 少 し ， ピ ロ リ ジ ン −−オ
ン 体 47 は 活 性 化 作 用 を 示 さ な か っ た ．
こ れ ら の 結 果 よ り ， LXR の 活 性 化 作 用 に は ， tail 部 分 に イ ミ ド 構 造 が 必 要 で あ る と 推 察 し た ．
次 に ，in vitro お よ び in vivo 評 価 に と も に 作 用 を 示 す 化 合 物 を 見 出 す た め ，化 合 物 43, 44 を 用 い て ， in vivo 評 価 を 実 施 し た ． ま ず ， C57BL/6J マ ウ ス を 用 い て 血 漿 お よ び 肝 臓 中 の 脂 質 濃 度 に 対 す る 影 響 を 評 価 し た ．各 化 合 物 30 ま た は 100 mg/kg を 一 日 一 回 8 日 間 経 口 投 与 し た ．そ の 結 果 ，化 合 物 43 の 投 与 は 血 中 脂 質 (HDL-C, LDL-C, TG) に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た が ， 化 合 物 44 に は HDL-C お よ び TG を 増 加 さ せ る 傾 向 が 認 め ら れ た (in vivo 試 験 結 果 不 記 載 )． 著 者 は ，上 述 の in vivo 評 価 の 結 果 お よ び 構 造 の 展 開 可 能 性 を 考 慮 し ，化 合 物 44 を 選 択 し て ヒ ダ ン ト イ ン 環 上 の 置 換 基 の 最 適 化 を 図 る こ と と し た ． 評 価 に は 先 と 同 様 に Gal4-h-LXR に よ る レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 ア ッ セ イ を 用 い た ．そ の 結 果 を Table 4-1, 4-2 に 示 す ． 比 較 の た め ， 化 合 物 44 (Table 3) の デ ー タ も 記 載 し た ． ヒ ダ ン ト イ ン 環 の 1 位 窒 素 上 の 置 換 基 お よ び 5 位 置 換 基 と し て メ チ ル 基 を 導 入 し た 場 合 ，導 入 し た メ チ ル 基 の 数 と Ema x () 値 と の 間 に 相 関 が あ る こ と が 認 め ら れ た (R1
= R2 = Me: 49 > R1 = H, R2 = Me: 48 > R1 = R2 = H: 44)．こ の こ と か ら ，化 合 物 の tail 部
分 で あ る ヒ ダ ン ト イ ン 環 周 辺 と 受 容 体 と の 結 合 領 域 で は 疎 水 性 相 互 作 用 が 重 要 で あ る と 推 察 し た ． そ こ で ， ヒ ダ ン ト イ ン 環 上 の 置 換 基 R2 と し て フ ェ ニ ル 基 を 導 入 し た と こ ろ (R2 = Ph: 51)， む し ろ 活 性 化 作 用 は 消 失 し て し ま っ た ． 一 方 ， 化 合 物 51 の 1 位 窒 素 上 の メ チ ル 基 を 水 素 原 子 に 代 え た と こ ろ (52)，僅 か に LXR 活 性 化 作 用 を 示 し た ． 次 に ， 化 合 物 52 の フ ェ ニ ル 基 上 に 置 換 基 を 導 入 し ， 高 活 性 化 の 可 能 性 に つ い て 検 討 す る こ と と し た ．
25
Table 4-1. LXR activity of the 2 -oxochromene derivatives Aa
Compound X R1 R2 LXR EC5 0b (%)c LXR EC5 0b (%)c Selectivity for Ema x d 44 NMe H H 2.6 (10) 1.3 (47) 4.7 48 NMe H Me 1.7 (16) 1.3 (52) 3.3 49 NMe Me Me 11 (21) 4.7 (70) 3.3 50 NH H Me 1.5 (5) 1.3 (14) 2.8 51 NMe Me Ph ia (0) ia (0) 0 52 NH Me Ph ia (0) 5.3 (6) only nd = not determined. ia = inactive at 10 M.
a GAL4-LXR luciferase assay were performed with a top dose of 30 M. The results are
given as the mean of two independent experiments. b EC
5 0 data is reported in M. c The %
of efficacy is defined as the percentage ratio between maximum fold induction for the test
compound and fold induction for T0901317 at 10 M in the same experiment.4 5 ) d selectivity = The value of selectivity is LXR E
ma x/LXR Ema x. 置 換 基 R1 を メ チ ル 基 ， X を NH に 固 定 し ， 電 子 供 与 性 お よ び 電 子 求 引 性 基 を も つ 種 々 の フ ェ ニ ル 基 を R2 に 導 入 し ， Gal4-h-LXR に よ る レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 ア ッ セ イ に よ っ て 活 性 化 作 用 を 評 価 し た (Table 4-2)． そ の 結 果 ， Ema x () 値 の 顕 著 な 改 善 は 認 め ら れ な か っ た が ，1,2-メ チ レ ン ジ オ キ シ ベ ン ゼ ン 体 58 に つ い て は ，Ema x () お よ び 選 択 性 も 比 較 的 良 好 で あ っ た ．し か し な が ら ，化 合 物 58 の 脂 溶 性 (ClogP of 58: 7.57) 4 6 ) は 高 く ， 分 子 全 体 の 脂 溶 性 を 低 減 さ せ る 必 要 が あ っ た ．
26
Table 4-2. LXR activity of the 2 -oxochromene derivatives Aa
Compound X R1 R2 LXR EC5 0b (%)c LXR EC5 0b (%)c Selectivity for Ema x d 53 NH Me 4-MePh ia (0) 2.4 (9) only 54 NH Me 2-MeOPh ia (0) ia (0) 0 55 NH Me 3-MeOPh ia (0) ia (0) 0 56 NH Me 4-MeOPh ia (0) 0.96 (8) only 57 NH Me 3,4-diMeOPh ia (0) ia (0) 0 58 NH Me 3,4-OCH2OPh nd (2) 1.2 (32) 16 59 NH Me 4-Me2NPh ia (0) ia (0) 0 60 NH Me 4-CF3Ph ia (0) nd (1) only 61 NH Me 4-NO2Ph ia (0) 8.0 (7) only 62 NH Me 4-(HO2C)Ph ia (0) ia (0) ia (0) 63 NH Me 4-HOPh ia (0) ia (0) ia (0) nd = not determined. ia = inactive at 10 M.
a GAL4-LXR luciferase assay were performed with a top dose of 30 M. The results are
given as the mean of two independent experiments. b EC
5 0 data is reported in M. c The %
of efficacy is defined as the percentage ratio between maximum fold induction for the test
compound and fold induction for T0 901317 at 10 M in the same experiment.4 5 ) d selectivity = The value of selectivity is LXR E
ma x/LXR Ema x.
そ こ で ， 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 部 分 に プ ロ ピ ル 基 を 一 つ だ け も つ プ ロ ピ ル 体 B に つ い て ， ジ プ ロ ピ ル 体 A と 同 様 に tail 部 分 の 置 換 基 の 違 い が 活 性 化 作 用 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た ．そ の 結 果 ，Ema x () 値 は プ ロ ピ ル 基 を 二 つ も つ 誘 導 体 A と 比 べ て 同 等 ，ま た
27
と 比 較 し て LXR 活 性 化 作 用 お よ び LXR 選 択 性 は 同 等 で あ る が ， 脂 溶 性 を 低 減 し た (ClogP of 2: 5.96)．
Table 5. LXR activity of the 2-oxochromene derivatives Ba
Compound X R1 R2 LXR EC5 0b (%)c LXR EC5 0b (%)c Selectivity for Ema x d 64 NMe H H nd (4) 1.3 (26) 6.5 65 NMe Me Me 2.4 (7) 1.0 (51) 7.3 66 NH Me Ph ia (0) 2.0 (8) only 2 NH Me 4-MeOPh nd (2) 1.4 (31) 16 67 NH Me 3,4-diMeOPh ia (0) 3.0 (9) only 68 NH Me 3,4-OCH2OPh nd (4) 1.1 (39) 9.8 69 NH Me 4-(HO2C)Ph ia (0) ia (0) 0 70 NH Me 4-HOPh ia (0) nd (2) only nd = not determined. ia = inactive at 10 M.
a GAL4-LXR luciferase assay were performed with a top dose of 30 M. The results are
given as the mean of two independent experiments. b EC
5 0 data is reported in M. c The %
of efficacy is defined as the percentage ratio between maximum fold induction for the test
compound and fold induction for T0901317 at 10 M in the same experiment.4 5 ) d selectivity = The value of selectivity is LXR E
ma x/LXR Ema x.
第 四 項 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 2 の 薬 理 評 価
LXR の 活 性 化 強 度 (Ema x ()) お よ び LXR 選 択 性 (Selectivity for Ema x /) が 共 に 良 好 で あ っ た 化 合 物 2 に つ い て 動 脈 硬 化 疾 患 モ デ ル 動 物 の 一 つ で あ る Bio F1B ハ ム ス タ ー を 用 い て in vivo 評 価 を 実 施 す る こ と と し た 4 7 )． な お ， 以 降 に 記 述 す る 動 物 実 験 は ， す べ て 興 和 株 式 会 社 東 京 創 薬 研 究 所 の 動 物 実28
験 委 員 会 に て 審 査 さ れ た 後 ， 承 認 さ れ た プ ロ ト コ ー ル に 基 づ い て 実 施 さ れ た も の で あ る ． 結 果 は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 示 し た ． 多 群 間 比 較 の 場 合 は ， 一 元 配 置 分 散 分 析 (one-way analysis of variance: one -way ANOVA)， ま た は ， 二 元 配 置 分 散 分 析 (two-way ANOVA) を 用 い て 解 析 し た 後 ， post-hoc 解 析 と し て Dunnett’s test を 実 施 し た ． 有 意 水 準 は ， 5%未 満 ， 1%未 満 ， 0.1%未 満 と し た ． す べ て の 統 計 解 析 に は SAS9.1.3 (SAS Institute Japan Ltd., Tokyo, Japan ) を 用 い た ．
は じ め に ， あ ら た め て in vitro 評 価 の 結 果 を Table 6 に ま と め ， ま た ， 用 量 反 応 曲 線 を Figure 19 に 示 し た ．こ こ で ，30 M で 活 性 が 減 少 し て い る 原 因 は ， 各 化 合 物 の 細 胞 毒 性 に よ る の で は な く ， 高 い 濃 度 で 評 価 し て い る た め に 細 胞 が 不 活 化 し て い る こ と に よ る も の と 推 察 し て い る ． 以 降 の in vitro 評 価 に お い て も ， し ば し ば 同 様 の 現 象 が 観 測 さ れ た が ， 同 じ 原 因 に よ る も の と 考 え て い る ．
Table 6. LXR activity of T0901317 and 2a
Compound T0901317 2 LXR EC5 0b (%)c 0.41 (100) 1.4 (31) LXR EC5 0b (%)c 0.49 (100) nd (2) Selectivity for Ema x d 1 16 nd = not determined.
a GAL4-LXR luciferase assay were performed with a top dose of 30 M. The results are
given as the mean of two independent experiments. b EC
5 0 data is reported in M. c The %
of efficacy is defined as the percentage ratio between maximum fold induction for the test
compound and fold induction for T0901317 at 10 M in the same experiment.4 5 ) d selectivity = The value of selectivity is LXR E
ma x/LXR Ema x.
29 ハ ム ス タ ー に 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 負 荷 を 2 週 間 お こ な っ た 後 ， 陽 性 対 照 薬 T0901317 を 1, 3, 10 mg/kg お よ び 化 合 物 2 を 10, 30, 100, 300 mg/kg， 各 々 8 週 間 1 日 1 回 経 口 投 与 し た ． 以 下 に ，そ の 結 果 を 示 す ．ま ず TC に つ い て は (Figure 20)，T0901317 で は 1 mg/kg お よ び 10 mg/kg 投 与 に お い て 僅 か な 上 昇 が 認 め ら れ る が ，化 合 物 2 で は 全 用 量 に て 有 意 な 上 昇 は な い こ と が わ か る ．
Figure 20. TC profile in T0901317 and 2
*p < 0.05, ** p < 0.01; The statistical analysis was conducted usin g Dunnett’s test.
Figure 21 は HDL-C お よ び LDL-C の 変 化 を 示 し た も の で あ る ． T0901317 で は ， HDL-C， LDL-C と も に 1 mg/kg 投 与 か ら 用 量 依 存 的 に 低 下 す る こ と が 認 め ら れ る ． そ れ に 対 し て 化 合 物 2 で は ，300 mg/kg の 投 与 で HDL-C の 僅 か な 上 昇 が 認 め ら れ る も の の ， LDL-C は 全 用 量 に て 有 意 な 変 化 は な い ．
Figure 21. HDL-C and LDL-C profile in T0901317 and 2
30
TG に つ い て は (Figure 22)， T0901317 が 血 漿 TG お よ び 肝 TG を 顕 著 に 増 加 さ せ る の に 対 し ，化 合 物 2 で は 血 漿 TG お よ び 肝 TG と も に 有 意 な 増 加 は 確 認 さ れ な い ．
Figure 22. Plasma TG and liver TG profile in T0901317 and 2
*p < 0.05, *** p < 0.001; The statistical analysis was conducted using Dunnett’s test.
Figure 23 は 脂 質 沈 着 面 積 を 評 価 し た 結 果 で あ る ． T0901317 は 3 mg/kg お よ び 10 mg/kg に て ， 化 合 物 2 は 300 mg/kg に て 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 が 認 め ら れ る ．
Figure 23. Area of lipid accumulation in the aortic arch in T0901317 and 2 *p < 0.05, ** p < 0.01; The statistical analysis was conducted using Dunnett’s test.
以 上 の よ う に ， T0901317 は 3 mg/kg お よ び 10 mg/kg 投 与 に て 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 を 示 し た が ， TG を 顕 著 に 増 加 さ せ て し ま う こ と が 確 認 さ れ た ． T0901317 は LXR デ ュ ア ル ア ゴ ニ ス ト で あ る た め ， 肝 臓 で の LXR 活 性 化 作 用 が TG 増 加 の 原 因 で あ る と 推 察 さ れ る ． こ れ ら 結 果 は ， T0901317 の 動 物 モ デ ル で の 報 告 と 一 致 す る 2 9 )． 一
31 避 で き て お り ， 望 む 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 も 示 し た ． こ の 結 果 か ら ， LXR 選 択 的 な 活 性 化 作 用 の み で も LXR デ ュ ア ル ア ゴ ニ ス ト で あ る T0901317 と 同 等 の 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 を 示 す 可 能 性 が あ る こ と が 確 認 さ れ た ． ま た TG の 増 加 に つ い て は ， 緒 言 で 述 べ た 仮 説 の と お り ， LXR 活 性 化 作 用 を 減 少 さ せ る こ と で 回 避 で き る こ と が 確 認 で き た ．
第 五 項 2-オ キ ソ ク ロ メ ン 誘 導 体 2 の 薬 物 動 態 評 価
化 合 物 2 が 脂 質 沈 着 抑 制 作 用 を 示 し た こ と か ら ， さ ら な る 構 造 最 適 化 に 向 け て ， 化 合 物 2 の 血 漿 中 濃 度 推 移 を 確 認 し た ．前 項 の in vivo 試 験 と 同 様 に ハ ム ス タ ー を 用 い ，300 mg/kg 投 与 時 の 血 漿 中 濃 度 を 測 定 し た ．そ の 結 果 ，化 合 物 2 は 投 与 後 ，速 や か に 代 謝 さ れ て し ま う こ と が 判 明 し た (Table 7， Figure 24) 4 8 )．Table 7. Drug concentration of 2 in peripheral blood after administration Time
(h) 0.5 1 2 6
2
(ng/mL) 50 53 59 0
