成 膜 大 学 理 工 学 研 究 報 告
J.Fac.Sci.Tech.,SeikeiUniv.
Vo1.54No.2(2017)pp.25-28
(特 別 研 究 費 に 係 る 論 文)
小 胞 体 内 に お け る1一デ オ キ シ ノ ジ リマ イ シ ン結 合 マ ンノ シ ダー ゼ の 選 別
栗 原
大 輝*1,戸
谷
希 一 郎*2
Screeningofl-deoxyn()jirimycinbindingmannosidaseintheendoplasmicreticulum
TaikiKURIBARA*1,KiichiroTOTANI*2
(ReceivedNovxx,2017)
1.研 究 背 景 ・目 的
小 胞 体 で 新 生 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質 上 の 糖 鎖 は 、 糖 タ ン
パ ク 質 の 分 泌 あ る い は 分 解 を 制 御 す る シ グ ナ ル と して 機
能 す る こ と が 、 提 唱 さ れ て い る1)。 特 に 小 胞 体 に 局 在 す
る α一1,2一マ ン ノ シ ダ ー ゼ 類 で あ るERma皿osidaseI
(ERManI)、ER-degradation-enhancingmannosidase-like
proteinl(EDEMI)、EDEM2お よ びEDEM3が 、
MangGlcNAc2(M9)型 糖 鎖 を 順 次 、 切 断 す る こ と で 産 生
さ れ る糖 鎖 群 は 、 糖 タ ン パ ク 質 の 選 別 に 重 要 な 役 割 を 果
た す(Fig.1)。 す な わ ちM8B型 糖 鎖 は 糖 タ ン パ ク 質 の 分
泌 シ グ ナ ル 、M8A型 糖 鎖 あ る い は さ ら に マ ン ノ ー ス が
切 断 さ れ たM6やM5型 糖 鎖 は 糖 タ ン パ ク 質 の 分 解 シ グ
ナ ル と し て 機 能 す る こ と が 想 定 さ れ て い る 。 しか しな が
ら 、 そ れ ら の シ グ ナ ル 糖 鎖 の 産 生 経 路 は 、 明 ら か と な っ
て い な か っ た 。
Secretion
一
M8B
Degradation
一
OD-Man
M8A
響ず
M6
■D-GlcNAc
M5
Figure1.Sortingsignalsofglycoprotein.
我 々 は 最 近 、 小 胞 体 の 構 成 要 素 が 全 て 含 有 され る小 胞
体 画 分 中 、適 切 に 酵 素 阻 害剤 を使 い 分 け、 小 胞 体 内 にお
い てM8Bあ
る い はM8A型
糖 鎖 の産 生 を基 軸 と して 、 糖
*1:理 工 学 研 究 科 理 工 学 専 攻 博 士 後 期 課 程
*2:物 質 生 命 理 工 学 科 准 教 授(ktotani@st
.seikei.ac.jp)
タ ン パ ク 質 の 分 泌 あ る い は 分 解 に 関 与 す る独 立 し た2っ
の 糖 鎖 産 生 経 路 が 存 在 す る こ と を 報 告 し た2)。 し か し な
が ら 、 依 然 と し て 、2っ の 独 立 し た 糖 鎖 産 生 経 路 に ど の
α一1,2一マ ン ノ シ ダ ー ゼ が 関 与 し て い る か 不 明 で あ る 。 本
研 究 で は 、M8Bを 経 由 す る 分 泌 シ グ ナ ル 糖 鎖 産 生 経 路
を 高 選 択 的 に 阻 害 す る 、1一 デ オ キ シ ノ ジ リ マ イ シ ン
(dNJ)に 対 す る 標 的 酵 素 の 絞 り 込 み をCellularThermal
ShiftAssay(CETSA)に て 検 討 した 。
2.実
験 方 法
本 研 究 で 使 用 し たdNJはTorontoresearchchemicals社 か
ら 購 入 し た 。 抗ERManl抗 体 はGeneTex社 、 抗EDEMl/2/3
抗 体 はSIGMA社 か ら 購 入 し た 。
2.1小 胞 体 画 分 の 抽 出
灌 流 処 理 し たSAMP63)マ ウ ス 肝 臓(0.5g)に 緩 衝 液
[0.25Msucrose,2mMEDTA,10mMHEPES(pH7.4)and
EDTA-freeproteaseinhibitorcocktailltab./50mL(Roche)](4
mL)を 加 え 、 ポ ッ タ 型 ホ モ ジ ナ イ ザ ー に て 破 砕 し た(20
ス トu一 ク,4。C)。 得 ら れ た 破 砕 液 を4QCで 遠 心 操 作 に
よ っ て 段 階 的 に 分 画 し た[900×g(10min),5,000×g(10
min),8,000×g(10min),20,000×g(120min)]。 最 終 的 に
得 た ペ レ ッ ト10mgを100pLの 可 溶 化 緩 衝 液[0.25M
sucrose,2mMEDTA,10mMHEPES(pH7.4),EDTA-free
proteaseinhibitorcocktailltab./50mL,1%triton-X100]で
再 溶 解 し た 。 さ ら に 、 懸 濁 液 を20,000×g(20min)で 遠
心 し 、 上 清 を 小 胞 体 画 分 と し た 。
2.2CellularThermalShiftAssay(CETSA)
小 胞 体 画 分(3mg/mL)を 、4。Cで30分 間 イ ン キ ュ ベ
ー シ ョ ン 後
、50pLず つ マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 分 注 し 、そ れ
ぞ れ サ ー マ ル サ イ ク ラ ー に て3。C刻 み で3分 間 加 熱 処 理
一25一
成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告
Vol.54No.2(2017.12)
し 、 氷 上 で3分 間 冷 却 した 。 各 サ ン プ ル を40C、20,000
×g(20min)で
遠 心 し 、 上 清35μLを 可 溶 性 サ ン プ ル と
し た 。 可 溶 性 サ ン プ ル に5×SDSsamplebuffer[(Tris/HCl
(250mM,pH6.8),DTT(375mM),SDS(10%),glycerol(50%),
BromophenolBlue(0.1%))8.75μLを 加 え 、SDS-PAGE用 サ
ン プ ル と し た 。 各 サ ン プ ル をSDS-PAGE(7.5%ポ リア ク
リ ル ア ミ ドゲ ル)後 、 抗ERManIお よ び 抗EDEM1/2/3抗
体 を 用 い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ トに よ り、 加 熱 処 理 後 の 標
的 タ ン パ ク 質 の 残 存 量 を イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー で 解 析 し、
融 解 曲 線 を 描 い た 。
2.31sothermaldose-responsefingerprint(ITDRF)
小 胞 体 画 分(3mg/mL)にdNJ(0.001-10mM)を 添 加 し
た 反 応 液(50μL)を 、40Cで30分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ
ン し た 。 そ の 後 、 各 サ ン プ ル を 融 解 曲 線 を も と に 決 定 し
た 温 度(40。c:Fig.3A,46。c:Fig.3B,54。c:Fig.3c,
66。c:Fig.3D)で3分 間 加 熱 処 理 し 、3分 間 氷 上 に て 冷
却 し た 。 各 サ ン プ ル を40C、20,000×g(20min)で 遠 心
し 、 上 清35μLを 可 溶 性 サ ン プ ル と し た 。 可 溶 性 サ ン プ
ル 中 の α一1,2一マ ン ノ シ ダ ー ゼ 類 の 残 存 量 を2.2と 同 様 に
ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト に よ り評 価 し た 。
3.実
験 結 果 と 考 察
CETSAは 、ITDRFと 組 み 合 わ せ る こ と で 組 織 あ る い
は ラ イ セ ー ト中 で 化 合 物 と 標 的 タ ン パ ク 質 と の 結 合 を 評
価 す る 手 法 と し て 報 告 さ れ た4)。CETSA(ITDRF)で は 、 タ
ン パ ク 質 と リガ ン ド化 合 物 と の 結 合 に よ る 熱 安 定 化 効 果
を 利 用 し 、標 的 タ ン パ ク 質 を 同 定 し て い る 。具 体 的 に は 、
CETSAに て 測 定 し た 融 解 曲 線 を も と に 標 的 タ ン パ ク 質
が ほ と ん ど 変 性 さ れ る 温 度 下 に お い て 、ITDRFに よ り リ
ガ ン ド濃 度 依 存 的 な 標 的 タ ン パ ク 質 の 安 定 化 を 比 較 し、
結 合 の 有 無 を 評 価 す る。
こ の 原 理 に 従 い 、 本 研 究 で は ま ず 、 標 的 酵 素 群
(ERManI,EDEMI,EDEM2お よ びEDEM3)を 様 々 な 温
度 で 熱 処 理 し 、 融 解 曲 線 を 得 た(Fig.2)。 こ の 結 果 か ら 、
EDEM3は 標 的 酵 素 群 の 中 で 熱 安 定 性 が も っ と も 低 い こ
と が 分 か っ た(Fig.2A)。 こ れ に 対 し 、ERManlお よ び
EDEM1は 中 程 度 の 安 定 性 を 示 した(Fig.2BandC)。 一
方 で 、EDEM2は 標 的 酵 素 群 の 中 で も っ と も 熱 安 定 性 が
高 い こ と が 分 か っ た(Fig.2D)。
続 い て 、融 解 曲 線 に 基 づ い て 各 標 的 酵 素 に 対 し、ITDRF
に 最 適 な 熱 処 理 温 度 を 設 定 し 、dNJ濃 度 依 存 的 な タ ン パ
ク 質 熱 安 定 化 効 果 の 有 無 を 評 価 し た(Fig.3)。 そ の 結 果 、
EDEM3がdNJ濃 度 依 存 的 に 安 定 化 さ れ 、dNJがEDEM3
A
b
O75
ξ
。.5
§ 。25
歪
C
b
O.75
ξ 。5
奎 。25
歪
画
303438424650
Temperature(℃)
幽
454953576165
Temperature(℃)
B
≧
075
t
。.5
§ 。、5
歪
D
b
oア5
ξ 。5
婁 。25
歪
Temp
禽 ・や 亭 傘"ま)禽
《
303438424650
TPrt{C)
Temp
ρ ま)禽 徐 げ む δ ♂ 浄 ♂
國
瓶
4246505458626670
Temperature(nc)
Figure2.ThermostabilityofmannosidasesintheER.
と結 合 す る こ と が 示 唆 され た(Fig.3A)。 一 方 、ERManI、
EDEM1お よ びEDEM2に 関 し て は 、dNJに よ る熱 安 定 化
効 果 は 観 測 され な か っ た(Fig.3B,CandD)。
一 連 のCETSA(ITDRF)実 験 の 結 果 は
、dNJの 標 的 結 合 タ
ン パ ク 質 がEDEM3で あ る こ と を 示 唆 し て い る 。 これ ま
で にEDEM3は 、M8B型 糖 鎖 産 生 に 関 わ る と の 報 告 は な
い が 、そ の 後 産 生 され るM7やM6型 糖 鎖 の 産 生 に 関 わ る
マ ン ノ シ ダ ー ゼ と解 釈 され て き た5)。 こ れ ら の 結 果 を 総
A
訟
ξo'ア5
婁o'5
歪 。・25
C
言。・・
1。,1
.25
畠
. _一 一 ■■■ ■ 夢
110100100010000
dN」CpM)
. _一 一 ■■■■■ 蕊
く
1101001DOOIOOOOlOOOOO
dNJ(pM)
B
診
ξ075
奎o・5
歪025
D
._一 一 ■圃 ■■ δ
1 10
dNJ{pM〕
1001000
一_一 一 ■ ■ ■ ■ 蕊
e・.'一'ltle#-dtとi
5
5
5
7
0
2
0
0
︾
一
一ω
⊆
Φ
一=
一
U
=
O
ρ
①
﹀
コ
邸
一①
匡
国
110100100010000iOOOOO
dNJ(pM}
Figure3.Stabilitye什ectofdNJformannosidasesintheER.
一26一
成 践 大 学 理 工 学 研 究 報 告
Vol.54No.2(2017.12)
合 す る と、EDEM3はM8B型
糖 鎖 産 生 に 引 き続 くM7やM6
型 糖 鎖 産 生 に 関 与 す る酵 素 候 補 と考 え られ る。 しか しな
が ら、M9型
糖 鎖 か ら のM8B型 糖 鎖 産 生 に 関 わ るマ ン ノ
シ ダ ー ゼ の候 補 は未 だ に 不 明 で あ る。 これ ま で の 研 究 か
ら、ERManlとEDEM2が
そ の 候 補 と して 考 え られ るが 、
本 研 究 で は 、 い ず れ の タ ン パ ク質 もdNJの 添 加 に よ り安
定 化 され な か っ た。しか しな が ら、本 研 究 に よ り、dNJが
抑 制 す る分 泌 シ グ ナ ル糖 鎖 産 生 経 路 の 、M8B以
降 の 糖 鎖
産 生 に 関 与 す るマ ン ノシ ダ ー ゼ の 絞 り込 み が で きた 点 は
意 義 が あ る。CETSAで
は 、標 的 タ ンパ ク質 固 有 の 熱 へ の
安 定 性 が異 な るた め 、dNJに 対 す る結 合 タ ンパ ク 質 の 候
補 が複 数 存在 す る場 合 、 評 価 す るの は 難 しい 。 今 後 は 標
的 タ ンパ ク質 群 に対 して 、dNJの 結 合 を均 一 な 条 件 で 評
価 で き る手 法 を 併 用 し、 小 胞 体 内 糖 鎖 プ ロセ シ ン グの 全
容解 明 に 取 り組 ん で い き た い 。
参考文献
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3)K.Takahashi,T.Tsuboyama,M.Matsushita,R.Kasai,H.
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一27一
