日本 Archaea 研究会第 24 回講演会要旨集期日 : 平成 23 年 9 月 2 日 ( 金 ) 3 日 ( 土 ) 会場 : 慶應義塾大学先端生命科学研究所メタボロームキャンパス大会議室 ( 山形県鶴岡市覚岸寺水上 ) 1

全文

(1)日本 Archaea 研究会第 24 回講演会要旨集. 期日：平成 23 年 9 月 2 日（金）・3 日（土）会場：慶應義塾大学先端生命科学研究所メタボロームキャンパス大会議室（山形県鶴岡市覚岸寺水上）. 1.

(2) 日本 Archaea 研究会第 24 回講演会プログラム期日：平成 23 年 9 月 2 日・3 日会場：慶應義塾大学先端生命科学研究所メタボロームキャンパス大会議室（山形県鶴岡市覚岸寺水上）. 9 月 2 日（金） 14:30-14:40. 開会の挨拶（幹事）. 14:40-15:40 01. 座長：河原林裕（九州大学）. 「再設計プライマーを用いた PCR クローンライブラリー法による温泉アーキアの系統学的多様性の再評価」 ◯加藤真悟 1. 02. 1,2. 1. 1. 、伊藤隆、大熊盛也、山岸明彦 2. 理研・バイオリソースセンター、東薬大・生命科学. 「深海底堆積物環境に生息する難培養性アーキアの分離培養の試み」 1. 1. 2. ○青木仁孝、山口隆司、高井研、井町寛之 1. 03. 2. 2. 2. 長岡技術科学大・環境システム工学専攻、 (独)海洋研究開発機構. 「好熱好酸性菌 Sulfolobus tokodaii のリアノテーション」 ○市川夏子、宮澤せいは、吉田ゆみ、中澤秀和、山崎秀司、藤田信之製品評価技術基盤機構・バイオテクノロジーセンター. 15:40-16:20 04. 座長：須貝昭彦（北里大学）. 「Bacteria 型脂質と Archaea 型脂質の混合脂質から成るヘテロキラルなリポソームの安定性」〇島田治男、山岸明彦東薬大・生命科学. 05. 「アーキア膜脂質の大腸菌における生産」 ◯磯部圭祐、横井宇、吉村徹、邊見久名古屋大・生命農学研究科. 16:20-16:40 休憩（20 分）. 2.

(3) 16:40-17:20 06. 座長：福田青郎（立命館大）. 「硫黄転移酵素システインデスルフラーゼの機能分散性」 ○秀瀬涼太、山下敬太、藤原伸介関西学院大・理工. 07. 「超好熱始原菌のリボソーム画分に存在する高温依存的タンパク質の解析」 ○青木俊、橋本雄介、妹尾あかね、秀瀬涼太、藤原伸介関西学院大・理工. 17:20-18:20 08. 座長：藤原伸介（関西学院大）. 「超好熱菌 Thermococcus kodakarensis の有する転写制御因子の網羅的解析」 1. 1. 1. 2. 2. ○東海林寿久、藤村早野、福田青郎、金井保、跡見晴幸、今中忠行 1. 09. 2. 立命館大・生命科学、京大・院工. 「超好熱菌 Thermococcus kodakarensis の有するウイルス様領域に関する研究」 1. 1. 1. 2. 2. ○田頭健太、松原正晃、福田青郎、金井保、跡見晴幸、今中忠行 1. 10. 1. 1. 2. 立命館大・生命科学、京大・院工. 「Thermococcus kodakarensis の３種の mcm 遺伝子について」 1. 1. 1. 1. 2. 2. ○石野良純、石野園子、藤野誠司、尾木野弘実、冨田宏矢、金井保、跡見晴幸 1. 2. 九大・院農、京大・院工. 19:00-21:00. 懇親会（「グランドエルサン」）. 3. 2.

(4) 9 月 3 日（土）座長：邊見久（名古屋大学）. 9:00-10:00 11. 「補酵素 A 生合成に関わる Archaea 特有の新規酵素 phosphopantothenate synthetase の酵素学的解析」 1. 1. 1. 2. 2. 2. 3. ○石橋拓也、冨田宏矢、横大路裕介、森北達弥、渡辺文太、平竹潤、今中忠行、跡見晴幸 1. 12. 1 2. ３. 京大・院工、京大・化研、立命館大・生命科学. 「アーキア特異的な AMP 代謝経路を構成する新規酵素の解析」 1. 2. 1. 2. 1. 1. ３. ○青野陸、中村顕、佐藤喬章、藤橋雅宏、矢野歩、吉田昭介、今中忠行、三木 2. 邦夫、跡見晴幸 1. 13. 1. 2. ３. 京大・院工、京大・院理、立命館大・生命科学. 「超好熱菌 Thermococcus kodakarensis におけるペントース代謝経路の改変」 1. 1. 1. 1. 2. 松原正晃、○福田青郎、石井浩子、松宮芳樹、跡見晴幸、今中忠行 1. 2. 立命館大・生命科学、京大・院工. 10:00-10:40 14. 1. 座長：佐藤喬章（京都大学）. 「計算機を用いた、Archaea を中心とした微生物のゲノムワイドかつ網羅的な比較」 ○木幡賢人東京大学・新領域創成科学. 15. 「ゲノム丸ごとクローニングのインパクトとアーキアへの応用に向けて」 ○板谷光泰慶應義塾大学・先端生命科学研究所. 10:40-11:00 11:00-11:40 16. 休憩（20 分）座長：横川隆志（岐阜大学）. 「RNA-Seq 法による好塩性古細菌の全転写産物解析」 ○井原邦夫名古屋大学・遺伝子実験施設. 17. 「超好熱性アーキア Pyrococcus furiosus 由来 RNA 3ʼ-terminal phosphate cyclase は GTP 依存にリン酸基の環状化を触媒する」佐藤朝子、曽我朋義、五十嵐香織、竹末可奈子、冨田勝、○金井昭夫慶應義塾大学・先端生命科学研究所. 4.

(5) 11:40-12:20 18. 座長：金井昭夫（慶應義塾大学）. 「Methanosarcina acetivorans のイントロン含有 tRNA 前駆体と結合するタンパク質群の解析」 ○横川隆志、四宮美紗子、恩田由美子、能村友一朗、大野敏、西川一八岐阜大学・工学部. 19. 「SPring-8/XFEL の新しい光に期待する古細菌 RNA/RNP 分子イメージング手法の開発」 ○別所義隆理化学研究所・SPring-8 センター. 12:20-12:40 総会（司会：幹事） 12:40-12:50. 閉会の挨拶. （幹事）. __________________________________________________________________________ 12:50-13:30. 昼食. 13:45-14:30. 慶應義塾大学先端生命科学研究所ラボツアー. 14:30-16:30. エクスカーション. 17:00-18:30. 一般公開講座（鶴岡メタボロームキャンパス. 5. レクチャーホール）.

(6) ^ßÝBF5CL2º PCR 8ILJF5AFGL©+.®¨4L74 }¾w¤ ^àZ. ÊÌ. d×À 1,2 T×õ 1 x±¿P 1 2 1. ·e}ÂÈK@56G=L;<J>LK¹³ñ½,. 2. QÖÅx}¹lÅ}î. «ªýnvý®¨*«²§m_rÑ.&ýÐ°»!w¤4L74 |o.[1]þ ýµo âä.4L74w¤!ýÀ O. 4L74. |of#. 4L74w¤. ÊÌ}¾w¤2Á.(.

(7) Mî` þ¸u. MÔ¾©!ý4L74 16S rRNA íU{. ïa2¥¾BF5CL2º PCR Û.þ ýBF5CLïaMÒ 16S rRNA íU{ïa!ý. BF5CL2º PCR Û2Øó-ýS¸uO[\¾|o. )¢_ þè ýPCR Y|ûE>ü:?DÛ+]

(8) 4L7 4. |o , /ûX" Nanoarchaeota[2]* ARMAN 9HLB[3]üþ/,. tj!ý&. âä/4L74 Ð°¸uO|o.2Ä.þRc+- PCR Û .BF5CLïaV@54;. ðÙ!âä/. [4]ý4L74´¼¾BF5CL. ò!%3¢Þ /þ&-ý ¤!0 ýÐ°». 4L74ò.Áä!ý. `*ÊÌ}¾w¤,)ó~¾). ¹·}¾w. .Ü1.2þ. ôN®¨*«²§m_rú®¸u)ýw¤4L74 |o. , /.[5,6]þú®¸u¹Ï.4L74!ýp¶b. ¹Ê*¹l. bëe2Á. .NÓkÂÈæ.[7,8]þÂÈ!ýµo&ÕÇ/. 16S rRNA íU{ïa2 )ý/&MÔ¾º,/ 4L74´¼¾BF5CLûArch21F[9]ü2^ßÝ ûArc9FüþAr9F 2º PCR 8ILJF5AFGL©+-ýÉ¡x¬å. ®¨§û78ºC, pH3.5ü. sÇ³û28ºC, pH2.5ü|o.4L74w¤2ã$þArch21F 2ºÛ)i¤Øý, /Ë 2¦ç.+ Arc9F. º2àZþ. ®¨§!ýArc9F Arch21F 2º,/4L74Î÷£éx ì!Ú,/ý¢ _/ 16S rRNA íU{. ÊÌq!iágp¯ ,`ø/.

(9) . ÆèÍ). ûX" Vulcanisaeta * CaldivirgaüþMýsÇ³ ,!ýThermoplasma òê9HLB rRNA íU{. ÊÌq w,/þ&ýsÇ³!ýArc9F Arch21F 2º,/4L7. 4Î÷£éýThermoplasma òê9HLB w¢_/ÊÌq. ~¹Ï®!ö. ,/4L74Î÷£é N. 16S. ¢_ùx ì ',/þArc9F + ¸u®h¾þ+Arc9F +. % Arch21F +,//+-)z..R. ,ýÂÈ^ßÝ4L74´¼¾BF5CLArc9F ¸uO. º. Ã (,/ý,!É¡x¬å. ¦ç¾®. 4L74Î÷Û. WsÇ³O!y. Thermoplasma òê4L74 |o. , [10]þ [1] Schleper et al. (2005) Nat. Rev. Microbiol. 3: 479-488. [2] Huber et al. (2002) Nature 417: 63-67. [3] Baker et al. (2006) Science 314: 1933-1935. [4] Baker (2003) J. Microbiol. Method. 55: 541-555. [5] Barns et al. (1994) PNAS 91: 1609-1613. [6] Takai & Horikoshi (1999) Genetics 152: 1285-1297. [7] Woese (1987) Microbiol. Rev. 51: 221-271. [8] Kato & Yamagishi (2010) Viva Origino 38: 46-55. [9] Delong (1992) PNAS 89: 5685-5689. [10] Kato et al. (2011) FEMS Microbiol. Lett. 319: 34-43.. 6.

(10) 深海底堆積物環境に生息する難培養性アーキアの分離培養の試み ○ 青木仁孝 1、山口隆司 1、高井研 2、井町寛之 2 1 長岡技術科学大学大学院、2(独)海洋研究開発機構 . 背景・目的分子生物学的手法を用いた微生物生態解析の研究結果から、深海底堆積物には多様なアーキアやバクテリアが存在しており、それらの多くが既知の分離株とは系統分類学的位置が全く異なる未知微生物であることが判明している。また、2008 年の Nature 誌に深海底堆積物中には大量のアーキアが生息していること (アーキアワールド仮説) が報告された。この報告が仮に正しいとすれば、地球規模での物質循環には未知アーキアが大きく関与しているということになる。これらの未知アーキアの環境中での役割や詳細な生理学的・遺伝学的特徴の理解を進めていくためには未知アーキアを培養し、最終的には純粋分離株を取得することが重要な課題の 1 つであると我々は考えている。しかしながら、深海底堆積物に生息する未知アーキアの多くはどのような基質を利用して生育可能であるかについては全くと言ってよいほど明らかにされていないため、どのような培養条件が適切であるのか不明な状況にある。加えて、深海底堆積物からの微生物の培養は従来のバッチ式培養法では非常に困難なことが経験的に知られている。そこで我々は、未知アーキアを培養・分離するために以下のような戦略で研究を進めている。(1) 既往の研究から未知アーキアが直接あるいは間接的に関わっていると推定されている深海底環境で見られる微生物反応 (本研究では嫌気的メタン酸化反応) を基に培養条件を設定し、下降流懸垂型スポンジ (down-flow hanging sponge : DHS) リアクターを用いた連続培養により集積培養を行う、(2) 集積培養されたアーキアの同定を 16S rRNA およびその遺伝子に基づいたクローン解析により行い、純粋分離したい標的未培養アーキアを決定する、(3) 標的未培養アーキアを fluorescence in situ hybridization (FISH) 法で検出するための DNA プローブの設計と検出の条件検討を行う、 (4) FISH 法と他の分子生物学的な手法を組み合わせた解析 (例えば、FISH-nanoSIMS 解析や特異的細胞分取技術とゲノム解析等) により標的未培養アーキアの機能推定を行う、(5) (4) で得られた情報を基に純粋分離を試みる。本発表では、(1)-(3) の DHS リアクターによる嫌気的メタン酸化微生物群の培養、微生物種の同定および FISH 法による未培養アーキア検出について報告する。結果・考察未知アーキアの培養には、南海トラフ冷湧水帯から採取した深海底堆積物を用いた。DHS リアクター内部のスポンジ担体に深海底堆積物を付着させ、リアクター上部から嫌気的にした人工海水を、リアクターの下部からメタンガスを供給した。DHS リアクターは 10°C の恒温器内で運転を行った。リアクター内部の微生物が生きた状態で存在しているのかの確認と、培養できているのであればどのような微生物種がいるのかを調べるために、運転開始 903 日目にリアクター内部のスポンジ担体の一部を採取し、RNA を鋳型とした 16S rRNA のクローン解析を行った。その結果、嫌気的メタン酸化反応に直接関わっていると推定されている ANME アーキアと、ANME の共生パートナーと考えられている Deltaproteobacteria 綱の硫酸還元細菌に近縁なクローンが最も多く検出された。加えて、深海底堆積物環境に普遍的かつ優占的に存在する未培養アーキア群である Deep-Sea Archaeal Group (DSAG) や Marine Benthic Group-D (MBG-D) 等に属するクローンも検出された。続いて、クローン解析により検出された未培養アーキア群を標的として、FISH 法あるいは catalyzed reporter deposition (CARD)-FISH 法による視覚的検出を試みた。その結果、FISH 法では ANME-1 および Methanococcoides 属の 2 種類のアーキアを検出することに成功した。通常、深海底堆積物のような微生物代謝活性の低いサンプルに通常の FISH 法を適用しても検出は不可能であることが知られている。従って、FISH 法の結果は DHS リアクターを用いた培養により微生物の代謝活性が高められ、嫌気的メタン酸化反応が起きていることを強く示唆していた。FISH 法で検出されなかった未培養アーキアに対しては CARD-FISH 法を適用した。その結果、 ANME-2a 、 ANME-2c 、 DSAG 、 MBG-D および Miscellaneus Crenarchaeota Group (MCG)の 5 種類の未培養アーキアの検出に成功した。以上、本研究において嫌気的メタン酸化反応に関与する未培養アーキアの機能推定をするための解析を行う準備を整えることができた。今後は、研究戦略 (4) に示した FISH 法と組み合わせた微生物の機能推定法を用いて、未培養アーキアの詳細な生理学的・遺伝学的特徴を取得し、純粋分離するための情報を得る予定である。. 7.

(11) ¯ ç Ò Sulfolobus tokodaii H , = 8 M 2 G K } ®n·#Q®ÁsÁlÔ·`R ñ±ÄÕ«T ØtÝ^Öx¼¨¦ >-.80=J3M5K7Mò ØtÝ^Öx¼¨¦ (NITE) NBRC (NITE Biological Resource Center) ]' ´°*Q§µ¥f¶ ('´°1=DÚ¢ LAJ8.MDÚ¢ *Õy*]',M/, Pyrococcus horikoshii OT3 (=NBRC 100139), Aeropyrum pernix K1 (=NBRC 100138), Sulfolobus tokodaii strain 7 (=NBRC 100140) Methanocella paludicola SANAE (=NBRC 101707) 1=Dæe*bé 2001 yr¯çÒ S. tokodaii 2011 ³w¡Ò1=Dy*¶ Þ 180 yXO¸×(100 XO7K?0ßÄ[¦â Ú(' V! 10 ê,M/,ë'¾Ù ~ ÓÂ( ' %f¶Ð$&º y*]'. ¡Ò1=DyH,=8M2GK*Õ. H,=8M2GKäYSd¤ÛL¨ÑdLëãyái 3 ©î \¥*ÕäYSd¤ÛGene Finding 6@:*¶S*ÕC <F,Ia ORF ¤Ü*ÕÊ£132 ORF *gí131 ORF *áiORF Ì 2,816 ñ× 1òAJ8.MDÚ¢"V7K?0ß_¤ÜÊ £$&411 ORF éZÍ*| 1=DÚ¢ 10 ê»+Õ)(Ê£¨Ñ¶' 'yè!ð à¹{i'¨Ñd ½o¤É¨Ñ;E-KS

(12) äYP" pathway ¤ÛÇËÚ¢ÅÊ£!ÏO7K?0ßp*ª Ê£È 800 ORF 7K?0ßp* cXh hypothetical protein ¨Ñ* 500 XO ORF Uu¨Ñ*' ñv 1ò S. tokodaii 1=Dy bé(%~¡Òë'¿Ã Õ)(² £ ÓÂ( '1=D y*Nå¶¬´¹¦Æ(¨ÑäYÎ ë'9M7BM4!~ w'UuH,=8M2GK(%ëãy!kÑ ì&ïÈ' j. Ê£184 ORF ¡Ò²y*ái1000 ORF XO. ½o*À¾äY²y*Wi¡Òy*¶¨ÑäY9M7BM4 %ISfinder, CRISPRDB, TCDB, MEROPS, CAZy y*Ëm (%yDOGAN (Database Of the Genomes Analyzed at NITE) béQ'ñv 2ò × 1. General features of re-annotated S. tokodaii genome Feature 2,694,756 bp. Ìzx GC qè. 32.8 %. ORF . 2,816. Functionally assigned. 1,425 (50.6 %). Hypothetical proteins. 1,391 (49.4 %). RNA. 49. 8.

(13) 1.

(14) ORF . 2. DOGAN (http://www.bio.nite.go.jp/dogan/). 9.

(15) Bacteria 型脂質と型脂質と Archaea 型脂質の型脂質の混合脂質から混合脂質から成から成るヘテロキラルなヘテロキラルなリポソームのリポソームの安定性〇島田治男、山岸明彦（東薬大、生命科学）【緒言】生命が発生した当時、どのような脂質が使用されていたのかは大変興味深い。生命の起源に関する論文は多く報告されているが、脂質に関してはアプローチする方法はあまりないのが現状であり、詳しく議論されることは少ない。このような中、古賀らや Wächtershäuser により、Archaea とその他の生物の脂質構造の違いに着目した興味深い議論が展開された。生体膜を構成するグリセロ脂質は、その構造中にグリセロリン酸骨格を有する。この骨格構造は全生物で共通しているが、グリセロール部位の 2 位の炭素の光学活性は Archaea とその他の生物（Bacteria と Eucarya）で異なっており、それぞれ sn-グリセロール-1-リン酸(G-1-P)型と sn-グリセロール-3-リン酸(G-3-P)型である。現在両方のグリセロリン酸骨格を持つ生物は見つかっておらず、これまで、これら光学活性の異なる脂質を混合してできたヘテロキラル膜は不安定であると考えられてきた。また、グリセロリン脂質の生合成上で、これらの光学活性を決定付づけている Archaea の G-1-P デヒドロゲナーゼと Bacteria の G-3-P デヒドロゲナーゼが異なるスーパーファミリーに属していることが明らかとなり、それとヘテロキラル膜が不安定であるという仮定を基にして、これらの脂質が生合成上区別できるようになってから生物（細胞）となったという説が提唱された。すなわち Bacteria 或いは Archaea が発生したときが生命の始まりとなる。それ以前では、前生命体である pre-cell というステージが存在し、そこで不安定なヘテロキラル膜や不完全な代謝が存在していたとみられている。しかし、ヘテロキラルな脂質が不安定であるという報告はなく、この説を裏付けるためにはヘテロキラル膜が不安定であるか否かを検証する必要がある。そこで、我々は異なる生物界の脂質から得られたヘテロキラル膜の安定性を調べることにした。【方法】 [脂質成分の調製]：Archaea (Thermoplasma acidophilum HO-62 、 Sulfolobus tokodaii 、 Aeropyrum pernix)、Bacteria (Thermus thermophilus HB-27)をそれぞれ培養し、有機溶媒により脂溶性の成分を抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて極性脂質画分を得た。T.acidophilum については更に HPLC で精製を行い、主要な脂質(MPL:main polar lipid)を単離した。 [脂質構成成分の分析]：各極性脂質の構成成分で、これまで明ら. a DMPE. d T.acidophilum (MPL). かにされていない S.tokodaii 及び T.thermophilus の極性脂質構造について、TLC で精製. 3. 1 2. O O O O. 3. OH. 1 2 O P O. O. 2. H. H. O. O. O. O P O. Gul. O. 1. O. H O. 3. OH OH. NH2. OH. Fatty acid moiety. Caldarchaeol moiety. b DPPC. e S. tokodaii. 1 2. O O O O. した後、質量分析等を用いて分. H. 3. 析を行った。. 3 O. O. O P O O-. N+. Glc Cal. H O. OH. 2O O. 1 O P O Ino 2 H O. 1 3. [ リポソームの作成 ] ： Dimyristoylphosphatidyletha nolamine(DMPE) 、または Dipalmitoylphosphatidylcholi ne(DPPC)、および各生物の極性脂質をモル比が 2:1 および. O. c T. thermophilus f A. pernix. 1 2. O O O O. 3O. H. 3. O. O P OO. O. Glc Ino. O P O. 2. O. 1. OH. NH O. O H. GlcNAc. Archaeol moiety. 図 1 各脂質の構造(左：Bacteria 及び Eucaria 由来、右：Archaea 由来の極性脂質). 10.

(16) 4:1 となるように混合し（抽出した極性脂質の場合は主成分換算）減圧下で乾燥した。これに、 70mM Calboxyfluorescein (CF)を含むリン酸カルシウム緩衝液を加えて 70℃で 30 分間加温し超音波洗浄器内で撹拌し多重膜リポソーム(MLV: multilamella vesicle)を作成し、次いでポリカーボネートフィルター(pore size 0.1µm)を使用してサイジングを行い、粒径 0.1μm～0.2μm の単層膜リポソーム(SUV: small unilamella vesicle)とし、Sephadex G50 に通して外層の CF を除き、CF が内包された SUV 試料を調製した。 [CF 漏えい率]：各 SUV 試料について、次の 3 条件（80℃、100℃、120℃）で 30 分間保存した。その際、保存前後で蛍光強度(Ex: 470nm, Em: 520nm)を測定し漏えい率を計算した。【結果及び考察】 [構成脂質の構造] S. tokodii の極性脂質は他の Sulfolobus 属と同様に calditocaldarchaeol 骨格の両端にそれぞれホスファチジルイノシトールとグルコースが結合した構造であった(図 1e)。また、T.thermophilus の脂質は、末端が分岐した脂肪酸がグリセロリン酸のグリセロール部にエステル結合し、更に脂肪族アミンが結合したグリセロ糖脂質がグリセロリン酸のリン酸部位に結合した構造であった(図 1c)。 [CF 漏えい実験]. 100. Thermoplasma の主要脂質及び DMPE、DPPC のせて作成したリポソームを 80℃、100℃、及び 120℃ で 30 分間保存し、内包された CF の漏えい率を調べ. Leakage (%). 構造をそれぞれ図 1d,a,b に示す。これらを組み合わ. DMPE DMPE/MPL(4:1) calc. DMPE/MPL(2:1) calc. DMPE/MPL(4:1) DMPE/MPL(2:1) MPL. 80 60 40 20. たところ、Bacteria や Eucarya タイプの DMPE や. 0. DPPC のそれぞれ単独でできたリポソームでは 30%. 60. と低い漏えい率であった（図 2●実線）。次いで、. 80. 考慮して漏えい率を予想し（図 2□及び△点線）、. Leakage (%). タイプの MPL から成るリポソームでは、3%～15%. 100. これら単独での漏えい率から、組み合わせの比率を. 40 20. （図 2■及び▲実線）と比較したところ、実測値は. 0. 向は他の全ての Archaea タイプの極性脂質と. DPPC DPPC/MPL(4:1) calc. DPPC/MPL(2:1) calc. DPPC/MPL(4:1) DPPC/MPL(2:1) MPL. 60. 混合脂質からなるハイブリッドリポソームの実測値いずれも予想よりも低い漏えい率であった。この傾. 80 100 120 140 temp.(℃). ～90%と高かったのに対して（図 2◆実線）、Archaea. 60. 80 100 120 140 temp.(℃). 図 2 ヘテロキラル膜によるリポソームの安定性. Bateria タイプの極性脂質との組み合わせでも同様であり、ハイブリッド型のリポソームはいずれも予想より安定であった。特に MPL と好熱性の Bacteria である T.thermophilus とのハイブリッド型のリポソームは極めて安定であった。以上の結果から、Archaea の G-1-P 型脂質とそれ以外の G-3-P 型脂質でできたヘテロキラル膜は不安定ではなく、むしろ安定であることがわかった。すなわち、ヘテロキラルな混合膜から成る生命の可能性を膜の物理的な安定性から否定することはできず、むしろこのような膜から成る生命の発生が可能であったことを示唆する結果となった。 Archaea と Bacteria が分岐する以前からヘテロキラル膜を持つ細胞性の共通の祖先(commonote)が存在していたとしても不思議はないように思われる。本研究では更にハイブリッドリポソームの安定性における炭化水素鎖の影響に関する興味深い知見も得られたため合わせて報告する。参考文献：H.Shimada and A.Yamagishi (2011) Biochemistry 50, 4114-4120. 11.

(17) アーキア膜脂質の大腸菌における生産 ◯磯部. 圭祐、横井. 宇、吉村. 徹、邊見. 久. （名古屋大学大学院生命農学研究科）. （背景・目的）アーキアの膜脂質は他の生物群には見られない独自のものであり、その特徴はグリセロールの sn-2 位と sn-3 位にイソプレノイド鎖がエーテル結合していることである。イソプレノイド鎖の構造は様々であるが、炭素数 20 の完全飽和イソプレノイド鎖が２本結合したアーキオールコアを有する膜脂質が一般的である。このコア構造を基本とし、他にも、イソプレノイド鎖に水酸基が付加したヒドロキシアーキオールや、イソプレノイド鎖の末端同士が結合し、二量化したカルドアーキオールなどの様々なコア構造を有する脂質が見つかっている（図１）。しかし、それらの生合成経路の全容については明らかになっておらず、多様なイソプレノイド鎖構造の生理的な意義も完全には分かっていない。そこで我々は、アーキア由来の一連の膜脂質生合成酵素遺伝子をクローニングし、それらを大腸菌に導入することにより、バクテリア細胞内でのアーキア膜脂質の生産を目指した（図２）。これにより得られる大腸菌はアーキア・バクテリア由来のキメラ膜脂質を持つことになる。このことが菌の生育やその生体膜の性質に与える影響は興味深い。その一方で、この組換え大腸菌は、アーキア膜脂質の構造多様性を生み出す新奇生合成酵素の探索の手段として期待される。すなわち、同菌にアーキア遺伝子をさらに導入し、生産されるアーキア膜脂質、特にそのイソプレノイド鎖の構造を解析することで、既知の生合成経路に続く反応を触媒する未知酵素を単離することができると考えられる。. アーキオール. sn-3-ヒドロキシアーキオール. 図１アーキア膜脂質のコア構造. カルドアーキオール. X：極性頭部. （方法・結果）これまでに報告された膜脂質生合成酵素は主に好熱性アーキア由来であった。そのため、大腸菌の至適生育温度である 37℃で高い活性を示す生合成酵素を同定する必要があった。そこで常温性メタン生成アーキア Methanosarcina acetivorans より、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素 (GGPP 合成酵素、①)、グリセロール 1-リン酸デヒドロゲナーゼ (G1P デヒドロゲナーゼ、②)、ゲラニルゲラニルグリセロール 1-リン酸合成酵素 (GGGP 合成酵素、③)、ジゲラニルゲラニルグリセロール 1-リン酸合成酵素 (DGGGP 合成酵素、④)のホモログ遺伝子をクローニングした。各遺伝子を大腸菌で発現させ、放射標識した基質を用いて各発現株破砕後上清の酵素活性を測定したところ、配列相同性から. 予想された通りの機能が同定された。そこで、 ①～④の遺伝子を同一のプラスミドに挿入した pBAD-ALB4 を作製し、これにより大腸菌を形質転換した。その菌体から脂質を抽出し、LC-MS により解析をおこない、アーキア膜脂質の生合成中間体である DGGGP の合成を確認した。また現在、 pBAD-ALB4 にゲラニルゲラニルレダクターゼ (GGR、⑤)遺伝子やそのホモログを挿入し、形質転換した大腸菌から抽出した脂質の解析が進行中である。. 12.

(18) ジメチルアリル二リン酸 (DMAPP、C5). ジヒドロキシアセトンリン酸 (DHAP). イソペンテニル二リン酸 (IPP、C5). ①GGPP合成酵素. ②G1Pデヒドロゲナーゼ. ファルネシル二リン酸 (FPP、C15) グリセロール1-リン酸 (G1P). ③GGGP合成酵素. ゲラニルゲラニル二リン酸 (GGPP、C20). ④DGGGP合成酵素 ⑤GGR. ゲラニルゲラニルグリセロール-1-リン酸 (GGGP). ジゲラニルゲラニルグリセロール-1-リン酸 (DGGGP). 図２アーキア膜脂質生合成経路. 13. アーキチジン酸.

(19) 硫黄転移酵素システインデスルフラーゼの機能分散性 ○ 秀瀬涼太 1,3、山下敬太 1,3、藤原伸介 1,3 1 関西学院大学・理工・生命科学、3 関西学院大学•理工•生命環境科学研究センター. 【緒言】システインデスルフラーゼ（CDS）は、L-システインから L-アラニンと硫黄を生成するピリドキサル酵素である。硫黄脱離反応により CDS の活性中心システイン残基上に生成する sulfanylcysteine (Enzyme-S-SH) の硫黄が、鉄硫黄クラスターや、チアミン、ビオチン、リポ酸などの含硫ビタミンの生合成や tRNA のチオ化修飾に供給される。バクテリア、ユーカリアの様々な生物種におけるそれら含硫化合物の生合成経路に CDS が関与することが明らかになっている。アーキアにおいても含硫化合物は重要な生理機能をもつと予想されるが 1)、それら化合物の生合成機構は未だ不分明である。本研究ではアーキアの CDS に着目し、アーキアにおける CDS の分布を解析したので報告する。. 【結果•考察】 Blast によるデータベース検索により、CDS ホモログはクレンアーキオータ門からユリアーキオータ門まで広く分布している一方で、Methanocaldococcus 属、Thermoproteus 属や Pyrodictium 属には CDS ホモログは存在しないことが明らかとなった。興味深いことに、ユリアーキオータ門に属する高度好塩菌の CDS 遺伝子ホモログは鉄硫黄クラスター生合成に関与する遺伝子ホモログ群とゲノム上でオペロンを形成しているのに対して、ユリアーキオータ門に属する Thermococcus 属や Methanothermus 属、クレンアーキオータ門に属する Sulfolobus 属や Pyrobaculum 属などの CDS 遺伝子ホモログはそれら遺伝子とオペロンを形成していないことが明らかとなった。一般に、超好熱性アーキアの CDS 遺伝子ホモログは鉄硫黄クラスター生合成に関与する遺伝子ホモログ群とオペロンを形成していない特徴が認められる。さらに近年、ユリアーキオータ門に属する Methanococcus maripaludis では鉄硫黄クラスターの硫黄源はシステインではなく硫化水素であるという報告がなされた. 2). 。これらの事実は、. Thermococcus 属などの CDS ホモログが鉄硫黄クラスター以外の含硫化合物の生合成に関与している可能性を示唆しており、CDS が生物の進化の過程で鉄硫黄クラスター生合成の機能を担ったのではないかと予想された。また、CDS の系統進化は、16S rRNA に基づく進化系統樹とは異なり、ドメイン単位での分散性は認められない。そのため、CDS が環境適応•順化と連動して進化していった可能性が考えられた。. 1) Makarova et al., 2010, Article ID 710303 (2010) 2) Liu et al., J. Biol. Chem., 285, 31923-31929 (2010). 14.

(20) 超好熱始原菌のリボソーム画分に存在する高温依存的なタンパク質の解析超好熱始原菌のリボソーム画分に存在する高温依存的なタンパク質の解析 ○青木俊1,3、橋本雄介1,3、妹尾あかね2、秀瀬涼太1,3、藤原伸介1,3 1. 関西学院大院・理工・生命科学、2関西学院大・理工・生命科学、 3. 関西学院大・理工・生命環境科学研セ. [背景と目的] 超好熱性始原菌 Thermococcus kodakarensis は 60℃から 100℃の幅広い生育温度を示し、至適温度は 85℃である。低温(60℃)、至適温度(85℃)、高温(93℃)における遺伝子の発現動態を調べるためにマイクロアレイ解析を行った。この結果、高温特異的に発現するタンパク質として TK0482 が見つかった。また、TK0482 は T. kodakarensis のリボソーム画分に存在することが分かっている。 TK0482 のホモログはバクテリアやユーカリアには存在せず、超好熱始原菌のみがもつタンパク質である。しかし、超好熱始原菌における TK0482 ホモログの生理的役割や構造について、未だ報告例はなく、詳細は明らかにされていない。これらのことから、T. kodakarensis 等の超好熱始原菌においては、至適生育温度より高温での生育に TK0482 遺伝子群が関与していると予測し、生体内での役割について知見を得ることを目的とした。そこで TK0482 遺伝子群の生理学的及び生化学的解析を試みた。 [実験方法] まず培養温度依存的な TK0482 遺伝子の転写量変化を調べるため、60℃、85℃及び 93℃ で培養した T. kodakarensis から抽出した RNA を用いて、RT-PCR を行った。さらに、TK0482 遺伝子群の生体内における役割について知見を得るためにピリミジン合成系遺伝子 pyrF が欠失した T.. kodakarensis を用い、 pyrF をマーカーとして TK0482 遺伝子群破壊株を作製した。そしてこの得られた破壊株と野生株を 60℃、85℃、93℃で培養し生育の違いを調べた。また、TK0482 組換え型タンパク質を用いて、無細胞翻訳系へ添加しタンパク質合成活性に対する影響を調べた。加えて、詳細な機構を解析するために生育時期の異なる菌体を用いて遺伝子の発現動態を調べた。 [実験結果と考察] まず RT-PCR 解析により、高温培養条件下で TK0482 遺伝子の転写量が増加することが分かった。また、Blast を用いたデータベース検索により TK0482 は TK0488 までの 7 つの遺伝子とクラスターを形成しており、それぞれは高いアミノ酸配列相同性を示すことが明らかとなった。そこで生理学的に解析するため TK0482 破壊株及び TK0482 - TK0485 多重破壊株を取得して生育特性解析を行ったところ、野生株との顕著な差は見られなかった。しかし、TK0482 - TK0488 多重破壊株を取得して生育への影響を調べたところ、高温培養条件 (93℃) において生育阻害が見られた。このことから、TK0482 遺伝子群は互いに機能を相補しながら共同して働き、高温での生育に必要であることが分かった。次に TK0482 を組換え型タンパク質として精製し、本タンパク質の翻訳活性に対する影響を調べた。その結果 TK0482 添加により翻訳活性の低下が見られた。さらに各生育時期の細胞における遺伝子の発現動態を調べた結果、対数期と比べ定常期により転写量が増加することが分かった。以上より TK0482 及びそのパラログは共同して働きリボソームの翻訳活性を抑制することが示された。. 15.

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(27) ~x¥EaP ¢MOmXa. DNA «. ¤Xa369+ -;1%$ (Table 1) %")(7/}°ZL-;1% $¥Ea~x#)(7/°Z T. kodakarensis «!k¯&> $ =s$ yybY$ 4 )(7/}°Z > $k¯&l$ &)(7/}°Z&[ T. kodakarensis TlS o{. 4(*9'8({&. Fig. 1. _ T. kodakarensis (i) )(7/}°ZF (U). Table 1. )(7/}°ZL@¥Ea °ZV. °ZL@¥Ea (¥Ear). °Zª. :Subtilisin-like serine protease precursor (1) TKV1. :Predicted transcription regulator (2). 23592 bp. :DNA replication licensing factor (1) TKV2. :Predicted transcription regulator (4). 27203 bp. :DNA polymerase sliding clamp (1) TKV3. :Predicted transcription regulator (1). 27886 bp. :DNA replication licensing factor (1) TKV4. :Predicted transcription regulator (1). 17. 18824 bp.

(28) gt;lj|"1073oU (TKV1~TKV4) **}XmC-# l4 1073oUMy}Xm (TKV1 mTKV2 mTKV3 mTKV4 m) OaeIl&(P1073oUz b H p57 4:-vJ>ûsVTzm (KU216 m) N. }Xmz xck-+. KU216 mr TKV1~TKV4 m!z d_ '* (Fig. 2)*'l&( TKV1~TKV4 T. kodakarensis z b AWq-D)B' SZ-R .)= , F )fKYL-!)$Pm6029 /80[-+TKV1~TKV4 mE Glutamine synthetase @ZGw\ ~*1073oUFR"*)SZ Glutamine synthetase @ZGQ{_ -<) '*) ?`]i Glutamine synthetase k%1073oUR"*)@ZF[z _-<)@Z B) n

(29) ). Fig. 2. zm (KU216 m) P}Xm (TKV1~TKV4 m) z h. 18.

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(32) " MCM ) in vitro #ûØ&GM:R?²Ç&

(33) çÂ©·µ#) MCM (Mcm2-7) $ Cdc45, GINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3) 0&2 CMG ÞubGM:R?²(£ b# 2$

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(35) 2 1, 2) 7R;7#)Methanothermobacter thermautotrophicus Sulfolobus solfataricus ( MCM HKÞ ub#). 1GM:R?²5Ç$|w3"

(36) 2. 3). ) Pyrococcus furiosus. ( MCM )²«-"GINS ({V#eê32$5|w"

(37) 2. 4). ,ç. Thermoplasma acidophilum ( MCM HKÿñb0&2 GINS $Á[c¹2$.|w 5) 7R;7(ÞÝGM:R?(¬'!

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(52) E>(K ./*0,' 2J&%Mcm1 DNA L; M:GbW<(2J4F#` 2C%Mcm2 c6AXZ =TR Mcm2 QI !#_X` Y %. 1.. Moyer, S.E., Lewis, P.W. & Botchan, M.R. (2006) Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10236-10241.. 2.. Pacek, M., Tutter, A.V., Kubota, Y., Takisawa, H. & Walter, J.C. (2006) Localization of MCM2-7, Cdc45, and GINS to the site of DNA unwinding during eukaryotic DNA replication. Mol. Cell 21, 581-587.. 3.. Sakakibara N, Kelman LM, Kelman Z (2009) Unwinding the structure and function of the archaeal MCM helicase. Mol Microbiol 72: 286-296.. 4.. Yoshimochi, T., Fujikane, R., Kawanami, M., Matsunaga, F. & Ishino, Y. (2008) The GINS complex from Pyrococcus furiosus stimulates the MCM helicase activity. J. Biol. Chem. 283, 1601-1609.. 5.. Ogino, H., Ishino, S., Mayanagi, K., Haugland, G.T., Birkeland, N.K., Yamagishi, A. & Ishino, Y. (2011) The GINS complex from the thermophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum may function as a homotetramer in DNA replication. Extremophiles 15, 529-539.. 6.. Fukui, T., Atomi, H., Kanai, T., Matsumi, R., Fujiwara, S. & Imanaka, T. (2005) Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes. Genome Res. 15, 352-363.. 7.. Oyama, T., Ishino, S., Fujino, S., Ogino, H., Shirai, T., Mayanagi, K., Saito, M., Nagasawa, N., Ishino, Y. & Morikawa, K. (2011) Architectures of archaeal GINS complexes, essential DNA replication initiation factors.. 8.. BMC Biol. 9, 28.. . Ishino, S., Fujino, S., Tomita, H., Ogino, H., Takao, K., Daiyasu, H., Kanai, T., Atomi, H., & Ishino, Y. Biochemical and genetical analyses of the three mcm genes from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus kodakarensis. Submitted.. 20.

(53) ÆÝº A ¦X{á*( Archaea £ÊÝº phosphopantothenate synthetase Ýºi¬Ë °EèçP¨j®èçbÓÅIèçUÙréçÔcéçp¶ éçHDxÄêç ÒÉqèç æèçGÜbibiâ oi±´² X{@¦¢Tim éçGÜbi Ti±´} ¦LÁTi±´¹ êç. µZåbi ¦Z²iÛ ¦¢oi²ç. [¬] ÆÝº A (CoA) O¦¢ 'ÂÀÞX{¼Ó$ TCA [ÓJÏ # ßÈM

(54) +Eucarya, Bacteria ( CoA ¦X{¼Ópantoate & 4’-phosphopantothenate (PPan) !` pantothenate synthetase (PS) %. pantothenate kinase (PanK) 2 Ýº%. Ìf)(|a Archaea 149C)&7:>0ÚKg h\ ±´+×#½Archaea pantoate kinase (PoK) %. phosphopantothenate synthetase (PPS) . 2 ÊÝº CÍ`+~( & èç(Fig. 1) t¯&) Eucarya, Bacteria ¼Ó " pantoate -alanine ¿XWw%' pantothenate ¦ { (PS Ww) ¾ pantothenate <?ÞTWw%' PPan ¦{( (PanK Ww) )l Archaea PoK " pantoate <?ÞT+Ìf 4-phosphopantoate +¦{(s PPS %' -alanine ¿XWw ×Ä PPan u&)(% Bacteria/Eucarya Archaea ¼Ó¿XWw<?ÞTWwäª Õ(èç PPS BÖ &Á k

(55) ÚKg'Wwá(z_O | PPS Ýºi¬£y+& &yDv^Yk %. WwË+. [] Ñd¡eVÃ Thermococcus kodakarensis © PPS ÚKg+ pET21a. (+). Ns. Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL nNPPS 2? 5/Ð+«¤¸Ç¸Ç ¡Q¥ã-.?F/>8 30;6,A %. 1= Ø/. >830;6,AØ³+¼ Äu&)»] PPS l50 mM MES-NaOH (pH 6.5) 10 mM MgCl25 mM. Fig. 1. Bacteria/Eucarya Archaea (. ATP5 mM phosphopantoate5. pantoate & PPan "¦X{¼Ó. -1. mM -alanine20 μg ml PPS + ^»{Ww¹+§Ýºi¬Ë+ÄPPS Ww^Ð( phosphopantoate PoK Ww+S§ÎÇPPS y HPLC +§ AMP +kà·R. 21.

(56) [{g!|T] 7PPS H[} pH h MES-NaOH (pH 5.5-6.5), PIPES-NaOH (pH 6.5-7.5), HEPES-NaOH (pH 7.0-8.0), Bicine-NaOH (pH 8.0-8.5) 't PPS H[U$ pH X 'h {gPPS } pH 6.5 $ C (Fig. 2) 7PPS H[}oWh. Fig. 2. PPS H[U$ pH X. PPS n\' 65-95pR { gPPS mn\@oWB9b (Fig. 3) (5/),26-.'>] {g PPS H[n\F*04+8 82.3 kJ mol-1 $`R

(57) % (Fig. 4) 7PPS H[JNU$Wwf PPS H [ N $ -alanine, 4-phospho-. Fig. 3. PPS H[U$oWX. pantoate U$Wwf'~{ g-alanine U Michaelis-Menten M _E'y 4-phosphopantoate U N S'I $ C (Fig. 5-6) 7Nucleotide qv\ PPS H[N$ ATP =&# CTP GTPUTP 'tH['~nucleotide qv. Fig. 4. PPS H[(5/),26-.. \'h {gPPS ATP U n\'y < nucleotide 'Dt C sLATP U$Wwf' PPS zQwq\'

(58) "h $ ;Yj Archaea ue PPS ?P

(59) % $(31lNU Ov'VA PPS. Fig. 5. -Alanine U$Wwf. n\X'$ !#dzn\ :ZlNKR. H[kic'x^. [G|ar] 1) Yokooji, Y., Tomita, H., Atomi, H., and Imanaka, T. 2009. Pantoate kinase and phosphopantothenate synthetase, two novel enzymes necessary for CoA biosynthesis in the Archaea. J. Biol. Chem. 284: 28137-28145. Fig. 6. 4-Phosphopantoate U$Wwf. 22.

(60) アーキア特異的な AMP 代謝経路を構成する新規酵素の解析 ○青野陸 1)、中村顕 2)、佐藤喬章 1)、藤橋雅宏 2)、矢野歩 1)、吉田昭介 1)、今中忠行 3)、三木邦夫 2)、跡見晴幸 1) (1)京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻、2)京都大学大学院理学研究科化学専攻、 3). 立命館大学生命科学部生物工学科). 【目的】 AMP phosphorylase (AMPpase)、ribose-1,5-bisphosphate isomerase (R15Pi) は本研究室で新規に同定された酵素であり、Type III ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) とともにアーキア特異的な新規 AMP 代謝経路において機能することが明らかとなっている (Fig. 1) 1)。本研究では AMPpase、R15Pi の酵素学的解析および結晶構造解析を通じてアーキア特異的な新規 AMP 代謝経路の生理的役割の解明を目的とする。. Fig. 1. 新規 AMP 代謝経路. 【実験】 ○ R15Pi の解析・活性中心残基の同定結晶構造から、基質結合部位に存在し、反応性の官能基を有する Cys133 および Asp202 が活性中心を形成している可能性が示唆された (Fig. 2)。そこで Cys133 を Ser または Ala に、Asp202 を Asn に置換した変異体 C133S、C133A、D202N を作製・解析したところ、全ての変異体で酵素活性が検出されなかった (Fig. 2)。この結果より、 Cys133 および Asp202 が R15Pi 活性に不可欠であることが示された。 Fig. 2. 活性中心の解析. ・六量体構造形成の意義の解明本酵素と相同性を有するタンパク質はいずれも二量体であるのに対し、 R15Pi は結晶構造より Arg227 を介して 3 つの二量体が会合し、六量体構造を形成していると予測された (Fig. 3)。そこで六量体構造と酵素活性の関連を調べるために Arg227 を Glu に置換した変異体 R227E を作製し、解析を行った。その結果、R227E は野生型と比較して分子量が大きく変化し、酵素活性も大きく低下していた (Fig. 3)。この結果より、Arg227 は高次構造形成に重要な残基であることが明らかとなり、六量体構造 Fig. 3. 高次構造の解析. は酵素活性に重要であることが示唆された。. 23.

(61) ・活性化物質の探索上記の実験では AMPpase 酵素を用いて基質の R15P を合成していたが、代わりに化学合成した R15P を基質に用いた場合 R15Pi 活性が著しく低下することがわかった (Fig. 4)。この結果から、AMPpase 反応溶液中に R15Pi の活性化物質が含まれる可能性を考え、AMP、Pi、adenine が R15Pi 反応に与える影響を検討した。その結果、R15Pi は AMP により活性化されることを明らかにした (Fig. 4)。. Fig. 4. R15Pi 活性化物質の探索. ・反応速度論的解析 R15Pi について基質である R15P 濃度に対する反応速度論的解析を行った ([AMP] = 10 mM)。その結果、[S]-v plot はほぼ Michaelis-Menten 型に合致し、Vmax = 43.8 ± 1.2 µmol min-1 mg-1、Km = 0.58 ± 0.06 mM と算出された (Fig. 5)。. Fig. 5. 基質である R15P に対する R15Pi の反応速度論的解析. ○ AMPpase の解析 AMPpase は NMP のうち AMP のみを基質とすると考えられていた。しかし、AMPpase 活性の検出にカップリング酵素として用いていた R15Pi が AMP により活性化されることが明らかとなったため、AMP 以外の NMP も基質とする可能性が考えられた。そこで、AMPpase の基質特異性について再検討を行った。その結果、TMP について. Fig. 6. AMPpase の NMP 特異性. は活性が検出されなかったのに対し、CMP、UMP、GMP についても活性が検出された (Fig. 6)。この結果から、 AMPpase は生体内で AMP のみならず CMP や UMP も基質としている可能性が考えられる。さらに、様々な濃度の AMP、CMP、GMP、UMP に対する AMPpase 活性を測定したところ、全ての NMP について濃度依存的に活性が上昇した (Fig. 7)。また、AMP については 0-5 mM で活性が抑えられる正の allosteric 制御が観察された。. Fig. 7. 各種 NMP に対する AMPpase 活性の測定. 【まとめ】. Fig. 8. AMP による酵素レベルでの代謝制御. 以上の実験により、AMPpase と R15Pi が AMP により活性化されること、および AMPpase は AMP のみならず CMP や UMP も基質とすることが示唆された。【引用文献】 1) Sato, T., Atomi, H., and Imanaka, T. 2007. Archaeal type III RuBisCOs function in a pathway for AMP metabolism. Science. 315: 1003-1006.. 24.

(62) Ís¥Æ Thermococcus kodakarensis +CH<J8SÌ»Ïp c ¡ 1±¨ ÜÔ 1O£v 1|Å 1ÎÊãQL È 1 (1) ´jàrx §j²xÕ §¦x²(2) PÖrxrxÙ x®³² ÀIª©KÄ?6;E0'¬§¦. CH<J8EHØ»Ï(Øc+. CH<J8 (Ribulose 5-phosphate / Ru5P) .g+CH<J8EHØ»Ï. Øa©A21. 9ÝØa©A219_, *Øa©CH<J8EHØ (Ox-PP) »Ï NADPH 3=F5J.

(63) ) Ru5P .§+W`CH<J8. ÝØa©CH<J8EHØ. (NOx-PP) »Ïp,Ë¶·,}qtcÆ CH<J8g. EBGJ8D>EHØ»Ï (RuMP »ÏäÃ formaldehyde .U fructose. 6-phosphate ) Ru5P !p+) # Þ. Ox-PP »Ï.. NOx-PP »ÏÐe(*È-,+#¦IÇ. NOx-PP » Ï + × ¸ phosphoribulokinase (Prk) ' ribulose 1,5-bisphosphate. carboxylase/oxygenase (RubisCO) µ(*¤ØlykÏ (4F@H716F)

(64) ,+,} tcÆ. RubisCO .+N. %¹Á]. 4F@H716F. - +

(65) "/tcÆ Prk

(66) Ê Â¾ ),+. áZ«z°¢w(*bÛ,Ís¥Æ Thermococcus kodakarensis Â¼}u¢ß°âÓYmÍs¥Æ+ T. kodakarensis +& Prk . )¹Á]. 4F@H716F. ÚÑdni T. kodakarensis ¹Á]. 60-100§¿f RubisCO .. Â¾ ),+{. RuMP »Ï RubisCO .h$AMP gI_Ë. rkÏ

(67) ,+

(68) ) * (Fig. 1. {½Õ)kÏ @H716F. M,+kÏ. ct©4F. RuMP »Ï§ formaldehyde

(69) ¤. Øp,^,+

(70) RubisCO ¤Ø.ly+N

(71) +%kÏ\V¤Øºt G+®³. :. RÍs¥Æ )ÝØa©CH<J8EHØ»ÏÒTv (transketolase / Tkl. transaldolase / TalRibulose 5-phosphate 3-epimerase / Rpe) ~['RuMP »ÏÒTv¯o(*C H<J8SÌ»Ï.p¤ØlyÂ. a T. kodakarensis XÉ.ª (Fig. 1. ¯½Õ). Fig. 1. T. kodakarensis CH<J8SÌ»Ï ({½Õ) ®³ +~[»Ï (¯½Õ). 25.

(72) «RÉ¤¡¾Ã$'Ý²J?QÏ Methanocaldococcus jannaschii ,. NOx-PP ÈÞ#ä Æ#GKP;ã_ (Mj-tal /MJ0960Mj-tklA /MJ0679 v% Mj-tklB /MJ0681Mj-rpe /MJ0680) 3x 0-# Tkl "$ T. kodakarensis *GKP;3/ NOx-PP ÈÞ#^Ú# ¬03Àh/#"tn!ç#¼· /

(73) V/)j3§Ö'í¼·ºEPKS ?S glutamate dehydrogenase ã_'$`¼·ºEPKS?SDMI=QzÅ#ä Æã_ (Tk-pyrF) #EPKS?S3oºbÒã_j¦#FQ@S>qRéq #¸Ì´Õ£3Ñ! (Table 1)#É¤T. kodakarensis ¡¢#FQ@S>zÈÞ/ RuMP ÈÞ3¿ ¦ (KUdHP) $FQ@S>Óª Ô-0-"# RuMP ã_¿ ¦" Mj-tal Mj-rpe ã_3j¦$FQ@S>Óª Ô-0!!#\,. j NOx-PP ÈÞèáã_Ê ÇÍkiRuMP ÈÞ"^2.FQ@S>z3Ñ/ \ n

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(75) -FQ@S>z$Z" RuMP ÈÞ Ñ/0/#) M. jannaschii " / NOx-PP ÈÞ#p$V. NOx-PP ÈÞ$èf#±ÈÞi/yÎ*Á|0

(76) ]}#É¤,.! *FQ@S>z3Ñ \ yÎ/ n

(77) Table 1. ã_j¦#¸Ì´Õ£ ¸Ì. FQ@S>¯. ã_j¦#ã_ Mj-tal. Mj-tkl. Mj-rpe. éq. q. MA-YT . . î. î. î. . . +++. KUdHP. î. î. î. î. . . KULARdHP. î. `¼·. . î. . . . ++++. KULAKRdHP. î. `¼·. . . . . . +++. KUHARdHP. î. í¼·. . î. . . . ++. KUHAKRdHP. î. í¼·. . . . . . ++. Strain. RuMP. KU216. Promoter. -"¥êÛ! (MA-YT )ê KULARdHP ¦$2

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(124) . 30.

日本 Archaea 研究会 第 24 回講演会 要旨集 期日 : 平成 23 年 9 月 2 日 ( 金 ) 3 日 ( 土 ) 会場 : 慶應義塾大学先端生命科学研究所メタボロームキャンパス大会議室 ( 山形県鶴岡市覚岸寺水上 ) 1

日本 Archaea 研究会第 24 回講演会要旨集期日 : 平成 23 年 9 月 2 日 ( 金 ) 3 日 ( 土 ) 会場 : 慶應義塾大学先端生命科学研究所メタボロームキャンパス大会議室 ( 山形県鶴岡市覚岸寺水上 ) 1