関す 研究 有 効因子 抗腫瘍性溶連菌

4 8 8 金 沢大 学 十 全医 学 会 雑 誌 第8 8巻 第2 ^･ 3号 4 8 8‑⁴97 (1 9 7 9)

抗 腫瘍 性 溶連 菌^の 有効 因 子^に関 す^る研 究

第⁴ 報 溶 連 菌 菌 体 内 成 分6 0 F 並^びに抗 悪 性 肢 傷 薬^の E h^rli^ch がん細 胞^に対 する作^用の形 態学_{的 観 察}

金沢大学 医学 部 薬^理学 教 室( 主 任^: 正 印 達 教授 )

入 江

( 昭和^{5 4}年⁵ 月1 8日受 付)

Str ep tolysin S (以下S L S と略 記) 産 生 能^を有す る溶 連 菌Su 株( 以 下^Su 菌と略 記) ^に制が ん能が あ る こと が一越 村^らl】によ^っ て実 証さ れて以来, 溶 連 菌の制 が んに関す る実 験 的 研 究が,溶連 菌^の核 酸 効 果^2】に関す る実 験と平行し な が ら行な わ れ. や がて制が ん活 性が 強く･

･S L S 塵 生 力を欠く溶 連 菌 製 剤^{O K‑}4 3 2³¹ が開 発 さ れ, O K^･4 3 2 は臨 床で用^いら れ る よ うにな^っ た^.

O K^ご4 3 2 の作 用 機序と しては. 宿 主 介 在 作 用^3卜5)と腫 瘍 細 胞に対す る直 接 傷害 作 用^{3 卜5}躯 考え ら れて いる が^, その原 菌であ る Su 菌^につ い ては. 多くの人^によ ^っ て 主に直接 傷 害 作 用につい て実 験が行な わ れてき た. す な わ ち, 清 水ら輿こよ る腫 瘍 細 胞か ら^の R N A 流 出につ い て の実 験, 日a v a s ら⁷及び地 相ら^ヰIによ る位 相差顕 微鏡によ る Su 菌^の腫瘍細 憾 傷 害の観 察 実験^, 越 村ら^8I によ る Su 薗の固型 腫 瘍 内 注 射 実験, 及び倉田. 北 村 ら^別の R N A 及 び D N A 染 色^によ る Su 菌の腫 瘍 細 胞 傷 嘗^に関 す る実験な どであ る. これ ら S u 菌の腫 瘍 細 胞 直 接 傷 害作用^の実 験にも と づい て . Su 薗の制が ん性 有 効 因 子^{につい て の}研 究が行な わ れ, 越 札 正 印¹⁰¹は Su 菌^の無細 胞 抽 出 液^に抗 腫瘍 活 性が あ ること を実 証 し, 正印^川は無 細 胞 抽 出液よ り 硫酸アンモニ ウ ム濃 度 別分_{画 沈}澱 饉^によ^って抗腫 瘍 活 性をもつ タ^{ン パ}ク性 分 画 6 0 F を分 離す るに至^っ た.

60 F 分 画につ い ては,in vit_{r o}^‑in viv o 故 実 験^で 数 種の可 移 植 性 腹 水腫 瘍 細 胞^の移 植 性を阻 止す るこ と^‑2や , 6 0 F 腹 腔 内投 与によ^っ てエ ^ー ルリッヒが ん細 胞 接種マ ウ ス に著しい延命 効果^川が み ら れ ること が報 告さ れて いる. ま た. 6 0 F ^の可 移 植 性 腹 水 腫瘍 細 胞^に 対す る作用 を in vitr o で走 査型電 子 顕微 鏡に よ っ て

観察す る と^, 感受 性腫瘍 細 胞^には O K ^‑432 と よ く似た

形 態 学 的 変化が み ら れ る が, Su 菌でみ ら れ た R N A 流 出 像は 認 め ら れ ない こと^{‑ 3‑}も報 告さ れて いる^.他方,

生 化 学 的実 験では^, 6 0 F は^{エ ー} ル リ ッ ヒが ん細 胞の R N A 代 謝及 び D N A 代 謝を 阻害す る^こと^{1 4)}も報 告さ れて いる が･ 作 用 機 序と して は核 酸代 謝 阻 害によ るも

のか ∴或^いは 60_{F が タ}ン パ ク性 分 画^{であ る た めの}その

他^の作用によ る ものか は明ら かでない.

タ^{ン パ} ク性 抗 悪 性 腫 瘍 薬と して は ネオ カ ル チ ノ スタ チンが あ り^, ネオカ ^ル チ ノ ス タ チン は 196 4 年 石田 ら^{15J16 )}に よ っ て 放 線 菌 Str ep to myc e s c a rtin ｡^̲

Static u s F 4 1 の培_養濾 液よ り え ら れ た分 子^量約

1 0･7 0 0 の酸 性^ペ プチ ド で .作 用機 序と しては腫 瘍細胞 膜に作 用^{し, D N A} 合 成を阻 害^{17 回 即}す る と さ れて い

る^. こ の こと か ら本 論 文では. 6 0 F のエ ^ー ルリッヒが ん細 胞^に対 する 形態 学 的 影響を ネ オ カル チ ノ スタチン

並びに作用機 序の異な る抗悪性 腫 瘍 薬と 走査型 電子顕 微 鏡を 用い て比較 実 験し, さ らに腫 瘍 細 胞^の形 態変化 と移 植 性^の関係 に^つい ても検 討が行な わ れ た^.

実 験材料並 び に 実 験方法 1 . 6 0 F 分 画

6 0 F 分 画は 正印^川の方 法によっ て作 製し た^. すな わ ち. 教 室 保 存の溶連 薗S u 株 (Su 薗) ^の普 通ブイ^{ヨ ン} 培 養液 6 00 m ほ 3 % 酵母 ^エキ^ス培 養液 (pH 7.2) 10 ∠ に接 種し,3 7⁰c で2 0 時 間培 養し たのち^, 低温下^で連 続遠 心 (1 1.0 0 0rpm . 1 2 0 mL/min) を行な^っ てSu 菌 体を集め^, 生 理的食塩水で2 匝】洗 浄し たのち, 洗浄菌 体を袷 蒸留 水に浮 遊さ せ, 更^に適量^の兼 留 水を加えて S u 菌浮遊液^の覇 度が O D6 6 0即 で40 ^にな る よ う^に調 整す る^. つ い で, こ の菌 浮 遊 液3 0 mエにガラ ス粒(プラ

Studie s o n the a ntic a n c e r fa cto r(^s) ^{fr o m} g^{r o u}p A str ep t^{o c o c c}i Pa rt 4 M o rphologi ^{c al}

e xp^{e r}im e nts o n the influ e n c e of 6 0 F a nd a ntic a n c er dr ug^{s u}p^{o n} E hrlich c a r ci_{n o m a} c e11s

H ir o sh i Irie_, Dep^{a r}tm e nt of P harm a c olog y (^{D ir e ctor: P} r of. S.S hoin)^{,S cho ol of M edici‑}

n e, K a n a z a w a U niv e r ci_{t y}.

ウ^ン社製.径 0^.1 m m ) を 40g 加えて セ ル ホ モ ジ ナイザ

ー( ブ^{ラ ウン}社 製)で 4,0 0 0rpm 4 分 間振 と う してSu

蔚体を破壊し･振と う さ れ た菌液 を ガラ ス濾過器(G 2 ) で濾過 し た^のち^. 濾 液の無 細 胞 抽 出液 を低 温 下^で遠心 ( 1 0^.00 0^rpm ･ 2 0分) し, その上 清 液に1^/1 0畳^の2 0

% 硫 酸^{ス トレプ トマ}イ シン水 溶液 を加えて低温 下で放 置 し^, 3 0分 後に1 0^,0 0 0rpm 2 0分 間遠_{心 し}て上 清液 を 分取す る^{･ こ の}上 清液 を 硫酸^{ア ン モニ} ウム飽 和 水 溶 液( アンモ^エ ア水で p H 7^.1 に調 整)に対して低温 下^で

一昼夜透析 を行ない, 生じ た 沈澱 物^を遠心によ^って集 め, これ を蒸 留 水に溶 解し た もの につ い て硫酸アンモ

ニウム に よ る濃度 別分 画沈 澱を行ない , 硫 酸^アンモ ^ニ ウム飽和濃 度5 0 % と60 % ^の間^で生じ る沈 搬 物を集 め, 恭留 水に溶 解して蒸 留 水に対して透 析を行なっ て

脱塩 し た^のち^･ 凍 結 乾 燥を行なって帯 黄 白色^の無 品形 粉末標品 60 F 分 画を用 意し^, 低 温 下に保 存す る.

実験^には 60F 分 画を M/1 5 燐 酸 緩 衝 生理的 食塩水 ( P B S と略記) ^に溶解して, 0.4 % 溶液 を作 製し.ミリ ボ ア フィ ルタ^ー に て濾 過滅 菌し たも^のを用^いた.

2, 抗悪性腫瘍 薬

1 ) ^{シ クロ ホス フ}ァ ミ ド : エン ドキサ ン ( 塩野 義 製薬株 式会 社)を 滅菌P B Sに溶 解し_{て 2 0 f}^L_ghlL,2 0 0 f^Lg/

m=蓉液 を作 製.

2 ) ^{カ ルバ ジル}キノ ン : エスキノ ン (三共 株 式 会 社) を 聞 S に て稀釈して 2 0 〃g/ 蛇 2 0 0 〃 g 仙 溶液 を 作 製.

3 ) 5^‑ フ ^ロロ ウ ラ シル ( 5 ゼ U) ^: 5^‑F U ( 協 和 醗 酵 製薬 株式 会 社)を P B S に溶 解して 2 0 F^Lg/nL ^.2 0 0 j^Lg/ 止溶_{液 を}作 製,

4) メ ソトレキ^{セ ー} ト : メ ソ トレキセ ^ー ト(武田薬 品株式 会 社)を P B S に稀釈 して_,2 0F^Lg仙,2 0 0j^Lg血 液 を作 製^.

5 ) ^マ イ トマ イ シン C (M M C) : M M C ( 協 和 醗 酵 製薬株式 会 社) を P B S に稀_{釈 し}て 2 0 F^Lg/mL^.2 0 0 F^Lg/

mエ溶 液 を作 製.

6) ネ オ カルチ ノ ス タ テ ン : ネオカル テ ノ ス タ チ ン (山 之 内 製 索 株 式 会 社^. 2 0 0 0 U^/2 雨 ; 1^m g は 1^t5 0 0 U) を P B S に て稀釈して 2 〃 g 血･2 0 〃g/^m 腰 を 作 製.

7 ) ^ブレオマ イ シン : ブレ オマイ シン (日本 化 薬 株 式_会社) を P B S に て稀 釈^して 2 0 〃g 仙 ^,2 0 0 〃 g 凧 溶 液 を作 製^.

8 ) O K^･4 3 2 : ピ シ バ ニ ^ー ル ( 中 外 製 薬 株 式 会 社･ 5 0 K E^/vial) を P B S に 浮 遊 さ せ て 5 K E/ ml･ 8 K E/ 山 液 を作 製^.

3･ エ ^ー ルリ^ッ ヒか ん細 胞_浮遊 液

d d 系^マ ウ ス( 堆^, 19 ^〜 2 1g) ^{にエ ー ル}リッ ヒ腹 水が ん細 胞を移嘩^{し たのち,} 1 0 日目に腹 水を採取し. 遺尤､

( 8 0 肝pm ･ 5分) ^によ^って沈 毅し た が ん細胞を集め,

これ を仔牛 血清1 % 加P B S に て2 回 洗浄し た^の ち.洗 浄が ん細胞を仔 牛 血 清1 % 加P B S に浮遊さ せ,細 胞数 を T臼rk 型血 球 計 算 板に て算 定し た^のち^, 適 量の仔年 血 清1 % 加P B S を加えて3^.5 × 10^丁細 胞/ mエの細 胞 浮 遊液 を調 整す る^.

4^･ が ん細胞傷 害 作用 に関す る実験術 式

がん細 胞に対す る傷害 作 用を, 足査 型 電 子顕 微 鏡に よる が ん細 胞の形態 学 的 観 察^と, 60F 並びに供 試 薬物

のがん細胞の移 植 能^に及 ぼす 影響^によ^って検 討し た.

1) 形態学 的観 察 実 験 術 式

がん細胞 浮 遊 液_{( 3} .5 ×1 0⁷ 細 胞/ mり2 ^m=こ6 0 F 溶 液ま た は供 試 薬 物 溶 液2 mほ 加えて37⁰c で 1 20 分 間イ^ンキ^{ュ ベ ー} トし たのち その混合液 0^.5m ほ採 取し て直ちに2･5 % ダ^ルク ^{ー ル}ア ルデヒ ドに加えて室 温 下

で固定し･ 800^rpm 3 分 間遠心 し∴沈殿 物^を更^に 1 % オスミ ウム酸で後 固定し たのち. 再び遠心 してえ ら れ る沈 澱 物を ^エタノ ^ー ルで順 次脱 水を行な^い, つ い で酢 酸 イソ ア ミルに浮 遊さ せて ス ラ イ ドガラ ス上^{に の}せ,

臨 界点 乾燥器( 日立 社 軋 H C ゼZ 型) ^でイ オン スパ _ッ タリ^ン グ を行なっ たのちに, 走 査 型 電子 顕 微 鍍 試 料 台

に固 定し,羞査 型 電子顕 微 鏡(^日立 社 製S 5 5 0 及 び S 4 50)

で観 察を行な^っ た. な お一 対 照と しては が ん細 胞 浮 遊 液に仔牛 血 清1 % 加P B S を加え た 混合 液を上 記^の如 く処_{置 し た も}のが用^いら れ た.

2 ) ^{エ ー ル}リ ッヒがん細 胞の移 植 性に関 す る実 験 術 式

が ん細_胞浮 遊 液3m￡に6 0 F 溶液 ま た は供 試 薬 物 溶 液 3 m ほ加えて3 7⁰c に1 2 0 分 間イ ^ンキエ ペ ^ー 卜し た のち･ そ の混合 液_を ^一群1 0 匹 と す るマ ウ ス腹 腔 内^に 0^･5 m上ず^つ接 種して5 0 日間 観 察し^,途 中鬼死 し た^マ ウ ス及 び 5 0 日 日^に生存し たマ ウ ス につ い て そ れ ぞ れ剖 検を行な^ってがん細胞 浸潤の有 無を確か め た^.

な お, 対輿 と しては が ん細 胞浮 遊液 3 山に仔 牛 血 清 1 % 加P B S 3 m ほ加えて上 記^の如く処 置し た もの が 用^いら れ た^.

実 験 成 績

走査型電子 顕微鏡によ る観 察 実験

抗腫瘍 性 溶 連 菌 菌 体 内成 分6 0 Fのエ ^ー ル リ^ッ ヒがん

細 胞に対す る形 態 学 的 観 察^につい ては 既^に報 告さ れて いる 如 く,今回^の実 験におい ても写真2 にみ る ご と く^. 対 照 (写真1) ^に比 して微 絨毛の減 少. 消 失と微細 毛

4 9 0 入

の先 端膨 化が著 明にみ と め ら れ る と共^に, 大^′ト不同^の 数 多く^{の ブレア ス の}形成が み ら れ, 細 胞 表 面も 凹 凸状 を示し た が^, 細胞 膜^の破壊 像は み と め ら れ な か^った^.

ェ スキノンの作用 養 う け た が ん細 胞では^, 写真3 に み ら れ る ご と く, 微細毛は著明^に減 少,消 失し^, ま た^. 残 存し^{て い}る微絨 毛 全 体^に膨 化 像が み と め ら れ, プレ ブス形成も み ら れて細 胞 表 面は 凹凸 状を 呈 して い る が. 細胞は比 較 的球 形を保^って いた.

エ ン ド キ サンの作用 を う け た が ん細 胞^では, 写真4 にみ ら れ る如く^, 時^には徴 絨 毛^の消 失がみと め ら れ るが

徴 絨 毛 自 身^の変化はほとんど み と め ら れ な か^っ た. プ レブス形 成は み と め ら れ ∴細胞 表面 も 若干凹凸 状を 呈 して いた が, 細胞の変形 は み と め ら れ な か^った^.

5^‑F U とイ ンキ^{エ ペ ー} トさ れ た が ん細胞^では, 写真 5にみ ら れ る如く. 微 細 毛には全く変 化が み ら れ ず^, プ^レブス形成及 び細 胞の変 形 もみ と め ら れ な か^った^. メ ソ ト レキ^{セ ー} ト^の作用を う け た が ん細 胞^では, 写 真6 ^にみ ら れ る如く. 微細 毛^の減少と 延長な ら びに硬 化像が み と め ら れ る が, 膨 化, 消失ほ み^.と め ら れ ず,

プ^レブス形 成∴細胞^の変 形も み と め ら れ な か^っ た.

マ イ ト^マ イ シンC の作 用を う け た が ん細 胞^ではt 写 真7 にみ ら れ る如く^, 微 繊 毛^の萎 縮 或^いは消失^{が み ら} れ る と共にプ^レブス の形 成も み ら れ^, 細 胞 表 面は凹凸 状を 呈 し た.

ネ オカ ル テ ノ スタテ ンの作用 を う け た が ん細 胞では 写真8 にみ ら れ る如_く, 徴 絨 毛は著 明^に膨 化して花 弁 状を 呈 し∴微細 毛の消失 もみ と め ら れ る と と もに大き な プ^レブスの形 成も み ら れ^, 6 0 F と よ く 似 た形 態 変 化 を 呈 し た が, 6 0 F ほ ど細 胞^の変 形は み ら れ ず, 細 胞 表 面^の凹凸状も著 明^では な かった.

ブレ オマ イシンの作 用を う け た が ん細 胞では, 写 真 9にみ ら れ る如く, 微 細 毛は消 失して はぼ球形 状と な る が. 細 胞 表面^の凹凸は み と め ら れ な か^った.

O K^‑43 2 ^の作 用を う け た が ん細 胞^では ∴写真1 0 にみ ら れ る如く, 6 0 F によ るのと よ く似た形 態 変 化^{が み ら} れ, 微 細毛^の消 失, 先 端膨 化. 萎 縮 像 或^いは変 形が み ら れ, ま た^, 大 小不同^の数 多く^のプレブス形 成と細 胞 表面^の凹凸状 及び細 胞の変 形が み ら れ た が. 細 胞 膜の

破壊 的所 見は み ら れ な か^っ た^. 移櫨阻止 効果^に関す る実 験

In vitr o^･in viv o 法^によ る 6 0 F 並び^に各 種 抗 悪 性 腫瘍 薬の^{エ ー} ルリ^ッ ヒが ん細 胞の移 植阻止 効果に関す る実 験の成 績は衰､1 に示さ れて いる, すな わ ち, 薫 物 又 は 60 F と が ん細胞を混じて3 7⁰c で1 2 0 分 間イ ^ン キ

ュ づ ^‑ 卜して.その0 ^.5^mエを 1 群1 0 匹^の各^{マ ウ ス}腹 腔 内^に注射 して5 0 日目^にお け る生 存 数を^{パ ー} セン ト で

江

あ ら わ す と,

エ スキ ノ ン( 作用濃 度1 0 〃 g/ 雨 ). ネオカ ルチ ノ^スタ チ^ン(作用濃 度1 〃 g 仙) ,

マイ ト^マイシ ンC (作

用濃 度1 0 〃g/^mり^, O K^‑4 3 2 ( 作用濃 度2^.5 K E/ mり及 び 6 0 F (作用濃 度1^m g / mり と イ^ンキ^{エ ペ ー} トさ れ た がん細 胞^の移 植は阻 止さ れ, 5 0 日目^にお け るマ ウ ス

生 存 率は そ れ ぞ れ 1 00 % ^. 1 0 0 % ^. 5 0 % ^, 3 0 % 及び 1 0 0 % であ り. 5 0 日日^に生存し た^マ ウ スを屠 殺 解 剖 し た肉眼観 察でも腹 水^の貯 溜. が ん細胞 浸潤像は みと め ら れ な か^った^. ネオ カ ル チ ノ スタ^チンでは, 作用濃 度が1 0 /^Jg/ 血 と 増 加 す る と生 存率は70 % と低 下し た が^, 途 中 免死 し た^マ ウ スを解 剖しても腹 水^の貯溜. が ん細 胞 浸潤像は み と め ら れ な かっ た. ェ スキノン. マ

イ トマ イ シン C. O K ^･4 3 2 及 び60F で は作用濃 度をそ れ ぞ れ1 0 0 i^Lg/mL.1 0 0 F^Lg/mL.4 K E^/n‖灸 び 2^m g / mL と 増 加して も生 存 率は 100 % , 6 0 % ^,90 % 及び 1 00 %

Tab le l Expe rim e nts o n the iflu e n c e of 6 0 F

a nd v ario u s a ntic a n c e r dr ugs upo n the inv a^･ Sio n po w e r of E hrlich c a r cino m a c ells

M ate rials

Co n c e ntr^･ Nu mbe r atio n of ^Of s u r viv^‑

O r S/^te st the m ate r^‑ a nim als o n

ial in the

the 5 0th day ^of

mixtu r e in o c ulatio n

6 0 F 1m g/^{ml 1}心^砧

2m g/^ml 1 0ノ1 0

Cyclopho spha mi de 1叫^g/ml 0 /1 0 1 0叫^{g/ml 0 /1 0}

C^{a r}ba zil_quin o n e 1 0_{〃 g}/^ml 1 0 /1 0 1 0 0〃 g/^ml 1 0 /1 0

5^‑flu o r o u r a cil 1 0〃 g/ml 0 /1 0

1 0 0_{〃 g}/^ml 0 /¹0

M ethotr e x ate 1 0/^∠g/^m】 0 / 1 0

1 0 0〃 g/ml 0 /1 0

M ito m ycin C 1 0〟 g/^ml 5 /^{1 0} 1 0 0〃 g/^ml 6 / 1 0 N e o c a r zin o statin 1_{〃 g}/^ml 1 0 /1 0 1 0_{〃 g}/ ^ml 7 /¹0

B le o m ycin

1叫g/^ml 0 / 1 0 1 0 0_{〃 g}/^ml 0 / 1 0

0 Ⅰく^･4 3 2 2^.5 K E /^ml 3 /1 0 4 K E /ml 9 / 1 0 co ntr ol(Ca r cin o m a ｡ ells al｡ n ｡) 0 / 1 01

A ^mixt_{u r e o}f E hrlich c a r cin o m a c ells s u spe^･ n sio n a nd a s olutio n of te sted m ate rial w a s

i

nc ubat_ed at 3 7 ℃ fo r 2 ho u r s^. A fte r the

in c ubatio n,the mixtu r e w a s l nj^{e cted intr ape r･} ito n e ally into a m o u s e.