博 士 （ 医 学 ） 山下 陽 一郎

博 士 （ 医 学 ） 山下 陽 一郎

    学 位 論 文 題 名

BRCAI mutation testing for Japanese patients     ●

    ●

with ovarian cancer in breast cancer screenlng

（ 乳 癌 検 診 で の 日 本 人 の 卵 巣 癌 患者 に対 する 鰡C4J変 異の 検索）

学 位 論 文 内 容 の 要旨

    緒言

  卵巣癌（表層上皮性・問質性腫瘍）全体の約5N100/oは，浸透率の異なる常染色体優性遺伝 形式を示す家族性卵巣癌とされている．家族性卵巣癌は最近では，乳癌卵巣癌症候群と遺 伝 性非ポ リポ ーシ ス大 腸癌(HNPCC)と 関連 した 卵巣 癌と に大 別さ れる ．家 系内 に乳癌・

卵 巣癌が 多発 する 乳癌 卵巣 癌症 候群 は家 族性 卵巣 癌全体の約85〜90%を占め，その約90%

にBRCAI，一 部にBRCA2のgermline mutationが関与している．BRCA1変異の860/0は蛋白中 断 型のナ ンセ ンス また はフ レー ムシ フト 変異 であ り， 一般 的にはBRCA1遺 伝子 上に広く 分 布する ．ま た，BRCA1変 異の キャリ アー が70歳ま でに 乳癌 ・卵 巣癌 にな る累 積危険率 は各々，87%・44%との報告がある．

  教室の乳房外来には比較的多くの卵巣癌患者（受診者全体の約4%)が受診しており，我々 は 乳 癌 検 診 時 に 卵 巣 癌 患 者 にBRCAI変 異 の 検 索 を 行 うこ との 利点 につ いて 検討 した ．     対象と方法

患 者 と 検 査 材 料1996年2月 か ら1998年4月 ま でに 教 室 の 乳 房 外 来 で 乳 癌 検 診 を 受 け た 116例の卵巣癌（表層上皮性・問質性腫瘍）患者に，同意を得た後，BRCAIのexon 11の変異 の検 索を行 った ．末 梢血 リン バ球 から 抽出 した ゲノ ムDNAを変 異検 出の ため の検 査材料 と した ． な お ， 患 者 の 変 異 が 確認 された 場合 には ，未 成年 者を 除く 患者 の血 縁者 にも BRCA1変異の検索を勧めた．

SC(stop codon)ア ッ セ イ ゲ ノ ムDNAと プ ラ イマ ー を 用 い て 増 幅 し たBRCA1のexon 11 を含 むPCR断片 に対 して ，SCアッ セイに よりBRCA1のexon 11の 変異 をス クリ ーニ ングし た．PCR産物とgap vector (pCI‑BRlbg)によるYPH499 (Stratagene)の形質転換はIshioka etal． の方法で行い，口イシンを含まない培地で形質転換細胞を選択した後，ロイシンとウラシ ルを含まない培地での形質転換細胞の発育により，Ura゛の頻度を算出した．Ura゛が>80%の 検 体 を ホ モ 接 合 性 野 生 型 ，Ura゛ が く70%の 検体 を へ テ ロ 接 合 性 中 断 型 変 異 と し た ． DNAシ ー ク エ ン ス 分 析 ヘ テ 口 接 合性 中 断 型 変 異 が 検 出 さ れ た検 体に は， 変異 を同 定す るた めにDNAシ ーク エン ス分 析を 行った ，4組の プラ イマ ー対 を設定 してPCR産物 を部分 的に 重複さ せ，exon 11を完 全に 分析で きる よう にし た，PCR産物はALFオー トシ ークエ ンサー(Pharmacia Biotech)で分析した．

臨 床・ 病 理 組 織 学 的 デ ー 夕 乳 癌検 診を行 う前 に， 癌に 関す る家 族歴 を面 接に より 調査 し，1）第1度・第2度近親者に患者を含めて2例以上の卵巣癌がいる患者，2）第1度・第2度 近親 者に3例以 上の 乳癌 または卵巣癌がいる患者を乳癌卵巣癌症候群と診断した．卵巣癌 の組織標本を鏡検し，組織型と組織分化度を判定した．組織分化度はShimizu etal．の分化 度診断法により決定した．進行期(FIGO，1988)，重複癌，診断時年齢，生存月数などは診 療記録から調ぺた．

統計解析Fisher's exact probability test，Mann‑Whitney'sUtest，Kaplan‑Meier法，Mantel‑Cox (log‑rank) testを使用し，pく0.05を統計学的有意とした，

    結 果

患 者・ 血縁 者に おけ るBRCA1のexon 11の 変異

  11例(9.5％ ，11/116)の 患 者 がSCア ッ セ イ で ヘ テ 口 接 合 性 中 断 型 変 異 と 判 定 さ れ ，7例 (6.0％ ，7/116)がDNAシ ー ク エ ン ス 分 析 で 蛋 白 中 断型 のBRCAIの 変異 をも つこ とが 判明 した ．   変 異 が 検 出 さ れ た 乳 癌卵 巣癌 症候 群の 家系 は4家 系(A，B，C，D） で あっ た． 家系A，B，Cの 患 者 は ， 血 縁 者 のBRCA1の 変 異 の 検 索 に 協 力 的 で あ っ た ， 変 異 型 対 立 遺 伝 子(2508deIGA:

家 系A，Leu1216terニ 家系B，1275insT:家系C）と 野生 型対 立遺 伝子 のへ テロ 接 合体 が，これら の3家 系 で5例 の 患 者 を 含 む14例 で 確 認 さ れ た ． 乳 癌 卵 巣 癌 症 候 群 の1例 の 患 者(2508deIGA:

家 系D） は ， 血 縁 者 に キ ャ リ ア ー が 見 っ か っ た 場 合 の 精 神 的 シ ョ ッ ク と 罪 悪 感に 耐え られ な い と い う 理 由 で ， 血 縁 者 のBRCA1変 異 の 検 索 を 拒 否 し た ．1例 の 散 発 性 卵 巣 癌 患 者 (2508deIGA)は ， 結 果 の 判 明 前 に 卵 巣 癌 の た め に 腫 瘍 死 し た た め ， 血 縁 者 の 検 索 は 遂 行 で き なか った ．

B1でCA1のexon 11の 変 異を もつ 患者 の臨 床・ 病理 組織 学的 特徴

  ni期+rv期 の 進 行 例 ， 漿 液 性 腺 癌 ，G2+G3の 組 織 分 化 度 ， 乳 癌 卵 巣 癌 症 候 群 ， 重 複 癌 と し て の 乳 癌 を 有 し て い た 症 例 が ， 変 異 の な い 群 と 比 べ て 変 異 の あ る 群 で 有 意 に 多 か っ た (p:ニ0.002，p=0.0006，p=0.01，pく0.0001，p=0.003).変異のある群とない群における卵巣癌の 平 均 診 断 時 年 齢 は51.0歳 と51.2歳 で あ り ， 両 群 間 で 差 を 認 め な か っ た ． ま た ，ni期+IV期 の 症例 の予 後に 関し て も両 群間 で有 意差 はな かっ た（p 0．55）．

BRCA1のexon 11の変 異 をも つ患 者・ 血縁 者の 管理

  今 回 の 検 討 で ，7例 の 患 者 を 含 む16例 がBRCA1のexon 11の 変 異 の キ ャ リ ア ー で あ る こ と が 確 認 さ れ た ． 卵 巣 癌 で 死 亡 し た4例 の 患 者 と3例 の 男 性 の キ ャ リ ア ー を 除 い た9例 の 女 性 の キャ リア ーに は， 監 視の 強化(increased surveillance)と予防的手術（乳房切除術，卵巣摘出 術 ） に つ い て 説 明 し た と こ ろ ， 全 員 が 前 者 を 選 択 し た ． 我 々 は ， こ れ ら の 女 性 の キ ャ リ ア ー に 対 し ，1998年4月 以 来6ケ 月 毎 に 乳 癌 検 診 （ 視 診 ・ 触 診 ， 超 音 波 断 層 法 ， マ ン モ グ ラ フ イ ー ） と 卵 巣 癌 検 診 （ 内診 ，経 腟超 音波 断層 法，CA125など の腫 瘍マ ーカ ー検 査） を行 って い る が ， 現 時 点 で は 新 た な 乳 癌 ・ 卵 巣 癌 は 発 見 さ れ て い な い ． な お ， 今 回 の 検 索 の 結 果 が 陰 性 で あ っ た 患 者 に は ， 癌 の 発 生 に お け る 遺 伝 的 素 因の 関与 は否 定で きな いこ とを 説明 した ．     考察

  BRCA1変 異 の 検 索 に 伴 う 問 題 点 と し て ， プ ラ イ パ シ ー の 侵 害 ， 雇 用 ・ 保 険 ・ 結 婚 に お け る 遺 伝 的 差 別 の 危 険 性 ， 自 分 の 遺 伝 情 報 を 知 る こ と に よ る 心 理 的 悪 影 響 な ど が 従 来 よ り 指 摘 さ れ て い る が ， こ れ ら の ほ と ん ど が 本 研 究 で も 観 察 さ れ た ． ま た ，BRCA1変 異 の キ ヤリ アー は一 般の 米 国婦 人で は200〜400人 に1人 ，日 本人 女性 では2，000 ‑‑‑2，500人に1人と 低 頻 度 で あ る こ と も 検 索 上 の 問 題 と さ れ て い る ． し か し ， 我 々 は 卵 巣 癌 患 者 に 対 し て 選 択 的 に 検 索 を 行 っ た た め ， 比 較 的 高 率(6.00/0)にBRCA1変 異 の キ ャ リ ア ー を 検 出す るこ とが 可 能で あっ た．

  本 研 究 で 認 め ら れ たBRCA1変 異 と 関 連 し た 卵 巣 癌 の 臨 床 ・ 病 理 組 織 学 的 特 徴 の 把 握 は ， 卵 巣 癌 患 者 にBRCA1変 異 の 検 索 を 行 う か ど う か を 判 断 す る 際 の 参 考 に な る と 考 え ら れ る ． 欧 米 で は 若 年 発 症 が ，BRCAI変 異 と 関 連 し た 卵 巣 癌 の も う ー つ の 特 徴 と さ れ て い る ． し か し ， 本 研 究 で はBRCAI変 異 の 有 無 に よ る 卵 巣 癌 の 診 断 時 年 齢 に は 差 は み ら れ ず ， ま た Matsushima etal． ，Aida etalIも診 断時 年齢 に 差は なか った と報告していることから，若年発 症 は BRCA1変 異 と 関 連 し た 日 本 人 の 卵 巣 癌 の 特 徴 で は な い の か も 知 れ な い ．   BRCA1変 異 の キ ャ リ ア ー に は ， 最 近 で は 説 明 と 同 意 の も と に ， 監 視 の 強 化 ま た は 予 防 的 手 術 の い ず れ か が 行 わ れ て い る ． 本 研 究 で は 予 防 的 手 術 を 選 択 し た キ ャ リ ア ー は い な か った ．   Burke etalIも キャ リア ーに 対し て早 期か らの 監視 の強 化を 勧め て いる が， 実際に予 後 が 改 善 さ れ る か に つ い て は 現 在 の と こ ろ 不 明 で あり ，今 後の デー タの 蓄積 が必 要で ある ．

キャリアーに対するカウンセリングは，乳房外来で乳癌・卵巣癌検診を行う際に我々自身 が行っている．キャリアーの悩みを聞き，アドパイスをすることはもちろん大切であるが 乳癌・卵巣癌検診などのフオ口ーアップに責任をもち，信頼関係を築くことに勝るカウン セリングはないと考えている．

学位論文審査の要旨

    学 位 論 文 題 名

正 ） RCAl mutation testing for Japanese patients     ●  ●

with ovarian cancer in breast cancer screenlng

（ 乳 癌 検診 での 日本人 の卵 巣癌 患者 に対 するB々〇u変 異の 検索 ）

  家系内に乳癌・卵巣癌が多発する乳癌卵巣癌症候群は家族性卵巣癌全体の約85〜90t70を 占 め ， そ の 約90c70にBRCA1のgermline mutationが関与 して いる ．BRCA1変異 の86％ は 蛋 白中 断型 のナ ンセ ンスま たは フレ ーム シフ ト変 異で あり ，一 般的 にはBRCA1遺伝 子上 に 広く 分布 する ．BRCA1変 異の キャ リア ーが70歳 までに 乳癌 ・卵 巣癌 にな る累 積危 険率 は各々，87%．440/0とされている，

  教室 の乳 房外 来に は卵巣 癌患者（受診者全体の約4%)が受診しており，申請者は乳癌検 診 時に 卵巣 癌患 者に おいてBRCA1変異の検索を行うことの臨床的意義について検討した．

  乳癌 検診 を受 けた116例 の卵巣癌（表層上皮性・問質性腫瘍）患者に，同意を得た後，

BRCA1のexon 11の 変 異 の 検 索を 行っ た． 変異 が確 認さ れた 場合 には ，未 成年 者を除 く 患者の血縁者にもBRCA1変異の検索を勧めた．

  ゲ ノ ムDNAと プ ラ イ マ ー を 用 い て 増 幅 し たBRCA1のexon 11を 含 むPCR断 片 に 対 し て ，SC(stop codon)アッセ イに よりBRCA1のexon 11の 変異 をス クリ ーニ ング した．PCR 産物とgap vector (pCトBRlbg)によるYPH499 (Stratagene)の形質転換はIshioka etal．の方法 で行い，口イシンを含まない培地で形質転換細胞を選択した後，ロイシンとウラシルを合 まない培地での形質転換細胞の発育により，Ura゛の頻度を算出した．Ura゛が>80c70の検体を ホ モ 接 合 性 野 生 型 ，Ura゛ が く70％ の 検 体 を へ テ 口 接 合 性 中 断 型 変 異 と し た ・   ヘテ 口接 合性 中断 型変異 が検 出さ れた 検体 には ，変 異を 同定 する ため にDNAシー クエ ン ス分 析を 行っ た．4組の プライマ一対を設定してPCR産物を部分的に重複させ，exon 11 を 分 析 し た ．PCR産 物 はALFオ ー ト シ ー クェ ン サ ー(Pharmacia BioLech)で分 析した ．   乳 癌 検 診 前 に ， 癌 の 家 族 歴を 面接 調査 し，1） 第1度 ・第2度近 親者 に患 者を 含め て2 例 以 上 の 卵 巣 癌 が い る 患 者 ，2）第1度・ 第2度近 親者に3例 以上 の乳 癌ま たは 卵巣癌 が いる患者を乳癌卵巣癌症候群と診断した．卵巣癌の組織標本を鏡検し，組織型と組織分化 度を判定した．進行期(FIGO，1988)，重複癌，診断時年齢，生存月数などは診療記録から 調べた．

  統計解析には，Fisher｜Sexact probability tcst，Mann‑Whitney'sUtest，Kaplan‑Meier法，

Mantel‑Cox (log‑rank) testを使用した．

敬 郎郎

  11例(9.5％，11/116)がSCアッセイで へテ口接 合性中断 型変異と 判定され ，DNAシーク エ ンス 分 析で7例(6.Oc'/o，7/116)が 蛋白中断 型のBRCA1の変 異をもつ ことが判 明した．

  変異が 検出され た乳癌卵 巣癌症候群 の家系は4家系(A，B，C，D)であった．家系A，B，C の3家系 では，血 縁者のBRCA1の 変異の検索 に協力的 で，変異 型対立遺伝子(2508deIGA:家 系A，Leu1216ter:家系B，1275insT:家系C）と 野生型対 立遺伝子 のへテ口 接合体が ，5例 の 患 者 を 含 む14例 で 確 認 さ れ た ．1例 の 患 者(2508delGA:家 系D)は ， 血 縁 者 のBRCAJ 変異の 検索を拒 否した．1例の散発性 卵巣癌患者(2508delGA)は，結果判明前に腫瘍死した ため，血縁者の検索を遂行できなかった・

  BRCA1のexon 11の 変異 を も つ患 者 の臨 床 ・ 病理 組 織学 的 特 徴と して は，III期+IV期 の 進行 例 ，漿 液 性 腺癌 ，G2+G3の 組織 分化 度，乳癌 卵巣癌症 候群，重 複癌として の乳癌 を 有し て いた症例が ，変異の ない群と 比べて変 異のある 群で有意 に多かった(p=0.002， p=0.0006，p=0.01，pく0.0001，p二ニ0.003).変異のある群とない群における卵巣癌の平均診断時 年 齢 な ら び に III期 +IV期 の 症 例 の 予 後 に 関 し て は 両 群 間 で 差 は な か っ た ．   卵巣癌 で死亡し た4例の患 者と3例の男 性キャリ アーを除 いた9例の女性キャリアーに，

監視の強化と予防的手術（乳房切除術，卵巣摘出術）について説明したところ，全員が前者 を選択した・

  公 開 発 表 に際 し ， 副査 の 長嶋 教 授 から ，BRCA1のexonの選 択 につ い て ，SCア ッセ イ でのpoint mutationの 検出の可 能性，日 本人におけ るBRCA1変異頻 度が低い理由，変異陽 性の卵 巣癌の組 織型，な どについて の質問と乳癌と卵巣癌の発症年齢の相違から乳癌検診 での変 異検査の 意義につ いての確認 があった．副査の藤本教授からは，進行卵巣癌におけ る変異 の有無と 予後との 関係，男性 キャリアーに対する監視の強化の内容，女性キャリア ーに対 する予防的手術の意義，などについて質問があった．主査の吉木教授からは，BRCA1 がコードしているタンバクの機能，遺伝子発現の臓器特異性，epigenetic factorを含む変異 頻度の 人種的差 異，変異 陽性の卵巣 癌の組織型が漿液性腺癌であることの理由，変異陽性 の場合 の乳癌の 組織型の 特徴，予防 的手術以外の治療法，遺伝子治療の可能性，などにつ いて質 問があっ た．いず れの質問に 対しても，申請者は自身の解析結果と文献的情報をも とに概ね妥当な回答をなしえた・

  審 査 員一 同は，乳癌 検診での 日本人卵 巣癌患者 におけるBR CA1変異の検 索の臨床的 意 義を初 めて示唆 した本研 究の成果を 評価し，申請者が博士（医学）の学位を受けるのに資 格を有するものと判定した．