博 士 （ 理 学 ） 永 川 桂 大
学 位 論 文 題 名
Conjugation of gold nanoparticle with viral capsid proteins for biomedical applications
（生物医学的応用を目指したウイルスキャプシドタンパク質と 金ナノ粒子のコンジュゲーション）
学位論文内容の要旨
近 年 、 金 属 ナ ノ 粒 子 は そ の サ イ ズ に依 存し た 光学 ある い は磁 気特 性 が注 目さ れ 、細 胞 内 へ の 遺 伝 子 薬 剤 の 送 達 キ ャ1Jヤ ー とし て、 ま た腫 瘍組 織 に対 する 治 療ツ ール と して の 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る 。 こ れ ま でに 核酸 を 表面 に修 飾 した ナノ 粒 子、 ある い は合 成 チ オ ー ル 化 合 物 に よ っ て 被 覆 さ れ た ナノ 粒子 が 開発 され て いる 。し か し、 これ ら の場 合 多 く は 血 清 中 に お け る 高 分 散 性 、 標 的物 に対 す る特 異性 、 さら には 容 易な 合成 方 法と い っ た 点 で 個 々 の 機 能 は 有 し て い る も のの 、全 て を網 羅し た 機能 性分 子 の開 発に は 及ん で い な い 。 そ こ で 単 独 で 高 い 標 的 性 を 持ち 、か つ 血清 中で も 高い 分散 能 を有 する ウ イル ス キ ャ プ シ ド タ ン パ ク 質 に 着 目 し た 。 ウイ ルス カ プセ ルは 、 高い 標的 性 と細 胞導 入 率を 兼 ね 備 え た 理 想 的 な ナ ノ 粒 子 の 分 散 剤 に な る と 考 え ら れ る 。 例 え ばJCウ イ ル ス の キャ プ シ ド タ ン バ ク 質 の み で 構 成 さ れ た ウ イル スカ プ セル は、 ウ イル スゲ ノ ムを 持た な いた め 病 原 性 や 感 染 カ は 無 い が 、 野 生 型 ウ イル スと 同 様の レセ プ 夕一 介在 型 エン ドサ イ トー シ ス に よ っ て 効 果 的 に 哺 乳 類 細 胞 内 へ 導入 され る 。し かし な がら 、こ れ まで にウ イ ルス タ ンバ ク 質で ナノ 粒 子を 被覆 し た例 はin vitroでの 再 集合 系で し か報 告さ れ てい ない。再集 合系 の 欠点 は、 ウ イル スサ イ ズ以 上の ナ ノ粒 子を 内 包す る事 が 出来 ない と いう 点である。
さ ら に は 、 盛 ん に 自 己 集 合 が 行 わ れ てい るウ イ ルス は植 物 ウイ ルス が 主で あっ た 。そ こ 至 杢 班 窓 至Lま ュ △ 窒 宿 圭 と 立 るJC空i2ヒ 丕Q主iプ シ ド 夕ZZさ2質ユ 堡1童 用！ ！ エュ 全 土Z粒 王 ！ 三 空 ゴ)1丕 主iZ2ピ2ZZ！2質Q機 能 童 位 皇 童 埜 ユ 光 逗 惑 痣 法 圭 を 堕9 ‑1坐 丕 童 Z222！ 三 墨 吐 歪 機 能 性 士Z樋 料 と ヒ 至 星 囲 窒 壷 三 と 童 目 的 とL t(Fig.l)。 第1章 で は 、 ナ ノ ビ ル デ ィ ン グ ブ ロ ッ ク と し て の ウ イ ル ス粒 子の 魅 カと 先行 研 究の 紹 介 、 生 体 材 料 と し て ナ ノ 粒 子 を 利 用 する 上で の 被覆 材に 関 する 課題 に つい て言 及 した 。
第2章 で は 、 大 腸 菌 発 現 系 を 用 い てJCウ イ ル ス の キ ャ プ シ ド タ ン パ ク 質VP1を 回 収 し 、 夕 ン バ ク質 の自 己 集合 能 に つ い て の 検討 を行 っ た。
JCウ イ ル ス は ナ ノ 粒 子 や 薬 剤 の 細 胞 内 送 達キ ャリ ヤ ーと し て 期 待 さ れ てい るが 、 報告 例 は ほ ぼ 皆 無 であ った 。 そこ で 、 本 学 位 論 文 に お い てJC ウ イ ル スVP1のin vitroに お
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ける自己集合条件を決定した。 Fig.JSchematic illustration of three t・0picsof血terestbaSed ウ イ ル ス キ ャ プ シ ド タ ン パ クOnuraldimnCtmteraCdanSpreSen旭dinthiSth．eSiS．
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質VP1は 、 ま ず 大 腸 菌 内 で 形 成 さ れ た ウ イ ル ス カ プ セ ル と し て 回 収 し た 。 これ を還 元 剤 で あ る2‑mercaptoethanol丶Ca2十 を キ レ ー ト するEDTAを 添加 す るこ とで ウ イル スカ プ セ ル か らVPlpentamerへ と 解 離 さ せ た 。 そ の 後 、 解 離 し たVPlp齟tamerが 自 己 集 す るNaC1 濃 度 、CaC12濃 度 お よ びpH条 件 を 検 討 し た 。 ウ イ ル ス カ プ セ ル の 同 定 に は 、サ イズ 排 除 ク 口 マ ト グ ラ フ イ ー 、 走 査 型 透 過 電 子 顕 微 鏡 を 用 い た 。 そ の 結 果 、mu的 で の 再 集 合 で は 、 野 生 型 の ウ イ ル ス と 同 じ サ イ ズ で の 粒 子 （T三7構造 ）は 確 認さ れな か った 。そ の 一 方 、NaC1濃 度 がO．1一1．0Mの 条件 で、 野 生型 のウ イ ルス 粒子 よ りも 小さな構造体（T＝1構 造 ） が 形 成 さ れ る こ と が 見 出 さ れ た 。 さ ら に 、野 生 型の ウイ ル ス粒 子の 構 造安 定性 に と っ て 重 要 な 因 子 で あ るCa2゛ 濃 度 を 高 め る と 、VP1の 凝集 が起 こ るこ とが わ かっ た。 こ れ ら の 条 件 を 利 用 し 、 血u鰤 で のVP1再 集 合 系 を 用 い た 金 ナ ノ 粒 子 の 内 包 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 ア ニ オ ン 性 の 電 荷 を 有 す る金 ナ ノ粒 子で の み再 集合 に よる 金ナ ノ 粒 子 の内 包が 行 われ 、T〓1sロuctuI・eの 内 径よ り小 さ な金 ナノ 粒 子で のみ内包可能で あるこ と が明 らか と なっ た。
第3章 で は 、VPl表 面 の ア ミ ノ 酸 残 基 の 分 布 に 着 目 し 、 金 ナ ノ 粒 子 を 核 と し た 疑 似 ウ イ ル ス 粒 子 の 作 製 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 キ ャ プ シ ド タ ン パ ク 質VP1のS01vent acceSsibiliけ を 計 算 す ると 、 内側 表面 の シス テイ ン 残基97番 目 のみ が溶 媒 と接 して い る こ と が 推 察 さ れ た 。 金 ナ ノ 粒 子 表 面 を 低 分 子 で あ るBSPPゆisけSulfoIlatophenyl） phenylphoSphme） で 保 護 し た 場 合 、 金 ナ ノ 粒 子 の 粒 径 に 依 存 せ ず 金 ナ ノ 粒子 表 面にVP1 が 集 合 化 し て い る 様 子 が 観 察 さ れ た 。 集 合 化 の 相 互 作 用 を バ ッ フ ァ ー 条 件、XPS、 夕 ン パ ク 質 の 点 変 異 等 に よ り 検 証 し た 結 果 、AuとSの 相 互 作 用 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 こ れ は 金 ナ ノ 粒 子 表 面 の 金 原 子 に シ ス テ イ ン 残 基97番 目 が 直 接 結 合 し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。VPl被 覆 の 金 ナ ノ 粒 子 を 用 い て 細 胞 取 り 込 み の 実 験 を し た 結 果 、ICP‐AESに よ りVPl被 覆 の 金 ナ ノ 粒 子 はBSPP金 ナ ノ 粒 子 よ り も 取 り 込 み 量 が 高 く 、 粒 径 が40m の 金 ナ ノ 粒 子 に お い て 最 も 取 り 込 み 効 率 が 高 い こ と が 分 か っ た 。 さ ら に 、VP1被覆 の 金 ナ ノ 粒 子 が 取 り 込 ま れ た 細 胞 に 強 い 光 を 照 射 する と 、照 射ス ポ ット 内に お いて 細胞 死 が 選 択的 に誘 導 され るこ と が見 出さ れ た。
第4章 で は 、JCウ イ ル ス の シ ア ル 酸 認 識 能 を 利 用 し 、 ウ イ ル ス 粒 子 表 面 にお ける 金 ナ ノ 粒 子 の 三 次 元 集 合 化 を 行 っ た 。 シ ア ル 酸 を 提 示 し た 金 ナ ノ 粒 子 とJCウ イ ル ス カ プ セ ル を 高 濃 度 デ キ ス ト リ ン 溶 液 中 で 共 存 条 件 に おく と 、金 ナノ 粒 子の 集合 化 に伴 い吸 収 ス ベ ク ト ル に お い て 、 お よ そ251unの レ ッ ド シ フ ト が 見 ら れ た 。 電 子 顕 微 鏡 では 直径15nm の 金 ナ ノ 粒 子 に お い て 、JCウ イ ル ス 粒 子 を 核 とし た 金ナ ノ粒 子 の集 合化 が 観察 され た 。 こ の 結 果 か ら 、 シ ア ル 酸 提 示 金 ナ ノ 粒 子 を 用 いた 本 系は 溶液 中 にお ける ウ イル スセ ン シ ン グヘ の貢 献 が期 待さ れ る。
第5章 で は 、 シ ア ル 酸 ポ リ マ ー を 合 成 しJCウ イ ル ス を 核 と し た 金 ナ ノ シ ェ ル 型 構 造 体 の 作 製 を 行 っ た 。 金 イ オ ン を キ レ ー ト す る ポリ ヒ スチ ジン を 主鎖 とし 、 数残 基に シ ア ル 酸 を 提 示 し た 。 ス ク 口 ー ス 密 度 勾 配 遠 心 、 イム ノ ブ口 ッテ ィ ング によ ル ウイ ルス 粒 子 と シ ア ル 酸 ポ リ マ ー の 相 互 作 用 が 起 き て い る こと が 明ら かと な った 。金 イ オン を添 加 す る と 、 金 イ オ ン の 添 加 量 に 応 じ て ナ ノ シ ェ ル 型 構 造 体 の 粒 径 増 加 が 観 察 さ れ た 。 第6章 で は 、 第2章 か ら 第5章 ま で の 本 学 位 論 文 に お け る 総 括 を 行 っ た 。 以 上 よ り 、 ウ イ ル ス キ ャ プ シ ド タ ン パ ク 質VP1に よ る 金 属 ナ ノ 構 造 体 を 構築 する こ と で 、 光 温 熱 療 法 の 薬 剤 お よ び ウ イ ル ス 検 出 の 材料 へ 応用 でき る こと を示 し た。 本研 究 の 成 果 は 今 後 の 生 物 医 学 に お け る 金 属 ナ ノ 粒 子 の利 用 に有 用な 知 見を 与え る もの であ る 。
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Conjugation of gold nanoparticle with viral capsid proteins forbiomediCalappliCationS
（生物医学的応用を目指したウイルスキャプシドタンパク質と 金ナノ粒子のコンジュゲーション）
博士学位論文審査等の結果について（報告）
近年、金属ナノ粒子はそのサイズに依存した光学あるいは磁気特性が注目され、細胞 内への遺伝子薬剤の送達キャリヤーとして、また腫瘍組織に対する治療ツールとしての 研究が盛んに行われている。これまでに核酸を表面に修飾したナノ粒子あるいは合成チ オール化合物によって被覆されたナノ粒子が開発されている。しかし、これらの場合多 くは血清中における高分散性、標的物に対する特異 性、簡便な合成方法といった点で 個々の機能は優れているものの、全てを網羅した機能性分子の開発には及んでいない。
本論文は、単独で高い標的性を持ち、かつ血清中でも高い分散能を有するウイルスキ ヤプシドタンパク質に着目し、金ナノ粒子にウイルスキャプシドタンパク質の機能を付 与させた機能性ナノ材料としての展開に関して報告している。タンパク質の内側にのみ 分布しているシステイン残基を利用して、タンパク質被覆による分子認識能を有した金 ナノ粒子を作製し、疑似ウイルスとして金ナノ粒子を細胞内へ効率よく導入する手法を 確立した。疑似ウイルスは粒径が制御可能であることから、細胞内導入における疑似ウ イルスの最適粒子径が見出され、さらに光照射により選択的に細胞を死滅させることが 明らかとなった。また、ウイルスキャプシドタンパク質の糖鎖認識能を利用する事で、
糖鎖提示金ナノ粒子のウイルス表面における三次元集積化を誘起し、水溶液中における 高 感 度 な 光 学 的 ウ イ ル ス セ ン シ ン グ の 系 を 確 立 す る こ と が で き た 。 これらの結果は、生体内における金属ナノ粒子の薬剤としての利用あるいは病原体の 高感度検出といった生物医学的応用に関してウイル スキャプシドタンパク質 VP1 の有 用性を他に先駆けて見出したことを意味している。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格のあるものと認める。
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