Molecular allelo-karyotypingと小児急性リンパ性白血病

総 説

Molecular allelo-karyotypingと 小 児 急 性 リ ン パ 性 白 血 病

加 藤 元 博*1,小 川 誠 司*2

東 京 大 学 医 学 部 *1小 児 科, *2が ん ゲ ノ ミク ス

Molecular Allelo-Karyotyping of Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia Motohiro KATO *1 and Seishi OGAWA

*2

*1

Department of Pediatrics, *2 Cancer Genomics Project, Faculty of Medicine, University of Tokyo

Abstract Pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a malignant disease resulting from accumulation of ge-netic alterations, and various genomic abnormalities are reported. Although these gege-netic lesions are important in leu-kemia initiation, they are insufficient to elucidate an entire etiology. Recently, we have developed a novel algorithm, CNAG/AsCNAR, to detect copy number alteration and allelic composition using SNP-genotyping microarrays, without dependence on the availability of self germ-line DNA. This robust algorithm also enabled sensitive detection of loss of heterozygosity (LOH) even in the primary samples contaminated by 70-80% of normal cells by finding subtle dis-tortions in allele-specific signals (Molecular allelo-karyotyping). We examined 399 pediatric ALL samples using an

SNP-chip platform, and discovered a detailed profile of genomic abnormalities. Molecular allelo-karyotyping also showed that alterations of genes related to B-cell development and differentiation, including PAX5, contributed to leukemogenesis. 要 旨 小 児 急 性 リ ンパ 性 白血 病(ALL)は,さ ま ざ ま な ゲ ノ ム異 常 を背 景 と して 発 症 す る.し か し,こ れ ま で報 告 さ れ て い る ゲ ノ ム異 常 は 白血 病 細 胞 の 発 生 に 重 要 で は あ る が,小 児ALLの 病 態 の す べ て を 説 明 す る こ と は で きな い.一 方,近 年 の ゲ ノ ム解 析 技 術 の進 歩 は 目覚 ま し く,マ イ ク ロ ア レイ を用 い た解 析 に よ り, 網 羅 的 か っ 高 解 像 度 に ゲ ノ ム に生 じて い る異 常 を検 出 す る こ とが 可 能 とな っ た.さ らに わ れ わ れ が 開 発 した CNAG/AsCNARア ル ゴ リズ ムで 解 析 を 行 う こ とで,2本 の ア レル の そ れ ぞ れ にっ い て コ ピー 数 を推 定 す る こ と が で き,か っ 正 常 対 象 が 得 られ な い 検 体 や,正 常 細 胞 が70∼80%混 入 した 検 体 に お い て も高 精 度 な ア レ ル特 異 的 ゲ ノ ム コ ピ ー数 の 解 析 が 可 能 と な った(molecular allelo-karyotyping).こ の 手 法 を 用 い て小 児ALL 399例 を体 系 的 に解 析 した結 果,発 症 の 基 盤 とな る ゲ ノ ム異 常 の プ ロ フ ァ イ ル が 明 らか に な り,PAX5を は

じあ と したB細 胞 の分 化 に 関与 す る遺 伝 子 の 異 常 が 小 児ALLの 病 態 形 成 に重 要 で あ る こ とが 示 さ れ た.

Key words: acute lymphoblastic leukemia, genomic microarray, genomics

1. は じ め に 小 児 急 性 リ ンパ 性 白 血 病(ALL)はt(12;21) [ETV6/ RUNX1]やMZL遺 伝 子 の再 構 成,hyperdiploidな ど,さ ま ざ ま なゲ ノ ム異 常 を 有 して い る こ とが 知 られ て お り, これ らの 異 常 は そ の 臨 床 像 と密 接 な 関 係 を持 って い る こ とか ら,診 断 に お け る指 標 と して 用 い られ る ほ か,予 後 因 子 と して 層 別 化 の指 標 と され て い るB).し か し,こ れ ま で報 告 され て い る ゲ ノム 異 常 は 白血 病 細 胞 の 発 生 に お い て重 要 な 役 割 を果 た す が,単 独 で は 白血 病 の 病 態 を十 分 に 説 明 す る こ とが で きず,小 児ALLの ゲ ノ ム 異 常 に つ い て よ り詳 細 に解 析 す る こ と は 白血 病 の 病 態 の理 解 に お い て 重 要 で あ る.さ ら に,異 常 な遺 伝 子 よ り生 じ る分 子 を 標 的 と した分 子 標 的 療 法 が 難 治 性 の 悪 性 疾 患 に お い て 劇 的 な成 果 を上 げて お り4),小 児 が ん に お い て も新 規 の が ん 関 連 遺 伝 子 を 同 定 す る こ とに よ る治 療 標 的分 子 の 探 索 は,さ らな る治 療 成 績 の 向上 お よ び 有 害 事 象 や 晩 期 障 害 の 回 避 と い う点 に お いて 注 目 を集 め て い る. 過 去10年 間 に お け る ゲ ノ ム科 学 ・ゲ ノ ム解 析 技 術 の 進 展 ・向 上 は め ざ ま し く,と くに近 年 で は,高 密 度 マ イ 2008年10月17日 受 理 別 刷 請 求 先:〒113-8655東 京 都 文 京 区 本 郷7-3-1 東 京 大 学 医学 部 小 児 科 加 藤 元 博

Reprint requests to Motohiro Kato, Department of Pediatrics, University of Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, 113-8655 Japan

324 日本 小 児 血 液 学 会 雑 誌 第22巻 第5/6号 (2008年12月) a 1 2 3 4 b a c b d ク ロ ア レ イ を 用 い る こ と に よ り,が ん に 生 じ た さ ま ざ ま な 種 類 の 複 雑 な ゲ ノ ム の 異 常 を 高 速 か っ 網 羅 的 に 検 出 す る こ と が 可 能 に な り つ つ あ る5-7).そ こ で 本 稿 で は,筆 者 ら が 行 っ て い る 超 高 密 度 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド ア レ イ を 用 い た 網 羅 的 ゲ ノ ム 解 析(molecular allelo-karyotyping)の 特 徴 に っ い て 概 説 し,小 児ALLを 対 象 と し た 解 析 の 結 果 に つ い て 報 告 す る. II. DNAマ イ ク ロ ア レ イ 1. マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い た 網 羅 的 ゲ ノ ム 解 析 現 在,網 羅 的 ゲ ノ ム 解 析 に 主 に 用 い られ て い る ア レ イ は,comparative genomic hybridization (CGH)ア レ イ と Fig. 1 Flowchart of Affymetrix GeneChip Mapping arrays

Restriction-enzyme digested DNA fragments are amplified by adaptor-mediated PCR. After being fragmented and biotin-labeled, the PCR fragments are subjected to hybridization on the microarrays, on which a set of SNP-specific probes are synthesized to detect each SNP type. Copy number (CN) is detected comprehensively by comparing array signals between tumor and reference.

single nucleotide polymorphism (SNP)ア レ イ に 大 別 さ れ る,い ず れ も ア レ イ 上 に 高 密 度 に プ ロ ー ブ が 貼 り 付 け ら れ て お り,標 識 後 の 試 料DNAを ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ た シ グ ナ ル が コ ピ ー 数 に 相 関 す る こ と を 利 用 し て, 全 ゲ ノ ム 領 域 に わ た り(=網 羅 的 に)数 十kb∼ 数kbの 解 像 度 で 高 精 度 な ゲ ノ ム コ ピ ー 数 の 解 析 を 行 う こ と が で き る.ま た,1日 に 数 十 検 体 以 上 と い う高 速 な 解 析 が 可 能 で あ り,多 数 の 検 体 を 解 析 す る こ と が 可 能 で あ る (Fig.1). SNPア レ イ の プ ロ ー ブ はSNP箇 所 に 限 定 さ れ, CGH ア レ イ に 比 ベ プ ロ ー ブ の 密 度 に 粗 密 の 差 が あ る た め,解 像 度 の 濃 淡 が 生 じ や す い.し か し,SNPア レ イ はSNP のhomozygosityの 連 続 性 か ら ヘ テ ロ 接 合 性 の 消 失 (LOH)を 検 出 す る こ と が で き る た め,コ ピ ー 数 変 化 を 伴 わ な いLOH(片 親 性 ダ イ ソ ミー: UPD)を 検 出 す る こ と が で き る.CGHア レ イ で はUPDを 検 出 す る こ と が で き な い た め,解 析 の 目 的 に 応 じて ア レイ の プ ラ ッ トフ ォ ー ムを 選 択 す る こ とが 望 ま しい. UPDは コ ピ ー数 減 少 を 伴 うLOHと 同様 に,残 存 ア レ ル の 遺 伝 子 に お け る機 能 欠失 変 異 と合 わ さ る こ と に よ っ て,正 常 な が ん 抑 制 遺 伝 子 の 消 失 を 引 き起 こ して が ん 化 に関 与 す る.そ れ だ けで な く,UPDの 残 存 ア レル に 存 在 す るが ん 原遺 伝 子 が 活 性 化 変 異 を 起 こ し,異 常 ア レル が 倍 加 す る こ とに よ っ て が ん 化 に 関 与 す る こ とが 知 られ て い る.ま た,先 天 的 なUPDは メ チ ル化 に よ る遺 伝 子 発 現 制 御(imprinting)の 異 常 を き た す こ とか ら,発 生 異 常 や 先 天 奇 形 と の 関 連 が 知 られ て き た が8-10),後天 的 なUPDに よ るimprintingの 破 綻 が が ん 化 に 関 与 す る こ と も報 告 さ れ て お り11),今 後SNPア レイ で の 解 析 が 行 わ れ る こ と に よ り,UPDと が ん 化 に つ い て は さ ら に解 明 が 進 む こ とが 期 待 さ れ る. 2. Molecular allelo-karyotyipng わ れ わ れ は高 密 度SNPア レイ か ら得 ら れ た デ ー タ の 解 析 の た あ に,CNAG/AsCNARア ル ゴ リ ズ ム を 開 発 し Fig. 3 Allelokaryotyping of pediatric ALL

Genetic clustering of 393 ALL samples. Genetic status of each chromosomal region is visualized. Vertical axis: chromo-somes, p: short arms, q: long arms. Horizontal axis: individual cases. CN: copy number of alleles. UPD: uniparental disomy.

326 日本 小 児 血 液 学 会 雑 誌 第22巻 第5/6号 (2008年12月)

a b

a

b

Fig. 4 Ideograms on 9p and 12p

た.GC比 率 か ら推 測 さ れ るPCR効 率 を 用 い て 補 正 を 行 う こ と に よ り従 来 の ア ル ゴ リ ズ ム に 比 してsignal/ noise比 は 改 善 さ れ,そ の解 像 度 は 劇 的 に 改 善 し微 細 な 増 幅 や 欠 失 を 検 出 す る こ とが 可 能 とな っ た(Fig.2a)12). さ ら にCNAG/AsCNARで は,多 数 の 正 常 検 体 か ら適 切 なreferenceを 選 ぶ こ と に よ って,正 常 細 胞 が 得 られ な い検 体 に お いて も コ ピー 数 解 析 が 可 能 で あ る. ま た,臨 床 検 体 の解 析 にお いて 避 け られ な い正 常 細 胞 の混 入 は解 析 に お い て大 きな 障 壁 と な る.正 常 細 胞 は コ ピー数 の異 常 シ グ ナ ル を 減 弱 させ る だ け で な く,が ん細 胞 に お け るhomozygosityが 正 常 細 胞 に 由 来 す る heterozygosityに よ って マ ス ク さ れ る こ と に よ り,正 確 なLOH解 析 が 困 難 と な る.Fig.2bに み られ る よ う に, LOHの 部 位 に お い てSNPがhomozygosityを 示 す た め に は少 な く と も50%以 上 の 腫 瘍 含 有 割 合 が 必 要 で あ り, 従 来 の ア ル ゴ リズ ム で はLOHの 正 確 な 推 定 に は50∼70 %以 上 の 腫 瘍 細 胞 が 含 ま れ て い る こ と が 必 要 で あ っ た. し か し,CNAG/AsCNARで は,ヘ テ ロ 接 合 を 示 し た プ ロ ー ブ に つ い て ア レ ル 特 異 的 に コ ピ ー 数 の 推 定 を 行 う こ と に よ り,正 常 細 胞 が70∼80%混 入 し た 検 体 に っ い て も 正 確 なLOH解 析 や コ ピ ー 数 の 異 常 の 検 出 を 行 う こ と が で き る(Fig.2b)13). III.小 児ALLに お け る Molecular allelo-karyotyping 1.小 児ALLの ゲ ノ ム 異 常 プ ロ フ ァ イ ル わ れ わ れ は の と ,お よ び ドイ ッ と 共 同 研 究 を 行 い,

小 児ALL399例 に 対 し てAffymetrix Genechip 50K XbaI arrayを 用 い て 解 析 を 行 っ た14,15).結 果 をFig.3に 示 す. 横 軸 に は そ れ ぞ れ の 症 例 が 並 び,縦 軸 に は 染 色 体 の 位 置 が 示 さ れ て い る.多 数 の 増 幅(赤 系 統 の 色)と 欠 失(青 系 統 の 色),UPD(緑)が 検 出 さ れ て い る が,各 症 例 の ゲ ノ ム 異 常 を ク ラ ス タ リ ン グ す る こ と に よ り,小 児 ALLに 特 徴 的 な 異 常 が 浮 か び 上 が っ て く る.高 頻 度 に 反 復 し て 認 め ら れ た 異 常 はhyperdiploid(HD)(116例: 29.1%),9p欠 失(114例:28.6%),12p欠 失(86例: 21.6%)の3つ の 異 常 で あ っ た(Fig.3).9Pに み ら れ た 欠 失 領 域 の う ち,最 初 の 共 通 範 囲 は150kbに 絞 ら れ, こ の 領 域 に はp16INK4Aが 存 在 し,12pの280kbの 共 通 欠 失 領 域 に はETV6が 存 在 して い た(Fig.4).こ の2つ の 遺 伝 子 は そ れ ぞ れ の 欠 失 に お け る 標 的 で あ り,小 児 ALLの 発 症 に 関 与 す る ゲ ノ ム 異 常 と し てHDと と も に 重 要 で あ る こ と が 示 さ れ た. HD群 に お い て 増 加 し て い る 染 色 体 に は 偏 り が あ り, 4,10,11,17,18,21番 染 色 体 の 増 加 が 多 く,と く に21番 染 色 体 はHD群 の す べ て に お い て 増 加 して い た(Fig.3,5). 興 味 深 い こ と に,頻 度 は 少 な い が 予 後 不 良 と さ れ て い る hypodiploid群 に は21番 染 色 体 の 欠 失 は な か っ た.す な わ ち,21番 染 色 体 は 増 加 す る こ と に よ っ て の み 白 血 病 化 に 寄 与 す る 染 色 体 で あ る と考 え ら れ た.ま た,予 後 良 好 と さ れ て い るHD群 で あ る が,17番 染 色 体 お よ び18 番 染 色 体 の い ず れ も 有 し て い な い 症 例 の 予 後 は 不 良 で あ り,こ の2本 の 染 色 体 はHD群 の 予 後 良 好 性 の 鍵 と な っ て い る こ と が 推 測 さ れ た(Fig.6). UPDの 分 布 も 同 様 に 偏 り を も っ て い た.9pのUPDが 最 多 で あ り,多 く の 症 例 は 残 存 ア レ ル にp16領 域 の 欠 失 を 伴 い,ホ モ 欠 失 を 起 こ して い た(Fig.5). 2.B細 胞 の 分 化 に 関 与 す る 遺 伝 子 の 異 常 共 通 の 欠 失 領 域 はp16領 域 お よ びETV6領 域 以 外 に も 認 め られ た.PAX5やIKZF1,TCF3,BLNKな どB細 胞

Fig. 6 Prognostic impact of chromosomes 17 and 18 Absence of a gain of either chromosome 17 (upper panel) or chromosome 18 (middle panel) is associated with poor prognosis in patients with HD-ALL; concur-rent absence of a gain of both chromosomes 17 and 18 (lower panel) is associated with very poor prognosis. Tri/tetra 18 and 17: HD-ALL with trisomy or tetrasomy 18 or 17. Others: HD-ALL without gain of chromo-somes 17 and/or 18 (modified ref. 14).

328 日本 小 児 血 液 学 会 雑 誌 第22巻 第5/6号 (2008年12月)

5q33.3 19q13

7p12.2

10q24.1

a _b

Fig. 7 Ideograms showing common deleted region including genes associated with B-cell differentiation and development EBFJ, TCFJ, IKZFJ and BLNK are recurrently deleted in pediatric leukemia. Green lines under the chromosome indicate the deletion of individual cases.

の分 化 に関 与 す る遺 伝 子 が 共 通 欠 失 領 域 に含 ま れ て い た (Fig.7).Mullighanら の 小 児ALLを 対 象 と した 解 析 で も これ らの 遺 伝 子 の欠 失 は共 通 して 高 頻 度 にみ られ る異 常 で あ り6),小 児ALLの 発 生 に お い てB細 胞 の 分 化 に 関 与 す る遺 伝 子 の異 常 は中 心 的 な役 割 を 果 た して い る と 考 え られ た. 3.不 均 衡 転 座 の検 出 とPAX5遺 伝 子 1q領 域 に 増 幅 領 域 の集 積(13例)が み られ た が(Fig. 3),い ず れ も1q23.3領 域 を 増 幅 の 断 端 と して い た.こ の断 端 はPBX7遺 伝 子 に 正 確 に集 中 して お り,こ れ らの 症 例 は す べ てt(1;19)に 由 来 す るE2A/PBX1融 合 遺 伝 子 を有 して い た.従 来 は ゲ ノ ム コ ピー数 解 析 で は転 座 は検 出 で き な い と考 え られ て い た が,コ ピー数 異 常 の 断 端 が 共 通 す る領 域 は,そ の場 所 を 切 断 点 と す る不 均 衡 転 座 の 存 在 が 示 唆 され,未 知 の転 座 の 探 索 に も有 用 で あ る こ と が 明 らか に な っ た. そ の よ う な 視 点 か らmolecular allelo-karyotypingの 結 果 を 検 討 す る と,9p領 域 に 欠 失 断 端 が 集 中 して い た (14例)(Fig.4).こ の 領 域 に はPA.¥5遺 伝 子 が 存 在 して お り,転 座 の融 合 相 手 の探 索 を 行 っ た結 果,4種 類 の 融 合 相 手 が10例 に お い て 確 認 さ れ た(Fig.8).Luciferase assayを 用 い て こ れ ら の 融 合 遺 伝 子 に つ い て 転 写 機 能 の 解 析 を 行 っ た 結 果,検 出 さ れ た融 合 遺 伝 子 はdominant negativeに.PAX5遺 伝 子 の 転 写 活 性 を抑 制 す る こ とが 明

らか に な った(data not shown).ま た,PAX5の み を 含 ん だ 微 細 な欠 失2例 を 含 め て 計38例 に欠 失 が確 認 され, 計62例(15.5%)がPAI¥5遺 伝 子 の 異 常 を有 して い た. Mullighanら の 解 析 で はPAX5の 点 変 異 も14例/242例 (5.8%)に 検 出 さ れ て い る が,わ れ わ れ の 解 析 で は 点 変 異 の 頻 度 は きわ め て 低 く,正 確 な 頻 度 は今 後 の解 析 が さ ら に必 要 で あ ろ う. IV.ま と め

小 児ALLに 対 し てmolecular alleio-karyotypingを 行 う こ と に よ り,小 児ALLの ゲ ノ ム 異 常 の 正 確 な プ ロ フ ァ イ ル が 明 ら か に な っ た.t(12;21)[ETV6/RUNX1]やMLL 遺 伝 子 の 異 常,hyperdiploidな ど は 小 児ALLに 特 徴 的 で あ り,成 人 に 発 症 す るALLと は 異 な る ゲ ノ ム 異 常 が 基 盤 と な っ て い る こ と は 以 前 よ り知 ら れ て い た が,網 羅 的 な ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た 結 果 か ら も 成 人ALL(data not shown)と 小 児ALLは 異 な る 特 徴 的 な プ ロ フ ァ イ ル を も っ こ と が 確 認 さ れ た. Molecular allelo-karyotypingの 特 徴 は 解 像 度 の 高 さ と 解 析 の 網 羅 性 を 両 立 さ せ た 点 に あ り,従 来 の ゲ ノ ム 解 析 で は 正 確 な 同 定 が 困 難 で あ っ た 微 細 な 異 常 を 検 出 し,そ の領 域 を詳 細 に絞 り込 む こ と が で き る.小 児ALLの 解 析 に よ りPAX5遺 伝 子 の 異 常 な ど,B細 胞 の分 化 に関 与 す る遺 伝 子 の 異 常 が 発症 に 関与 す る こ とが示 唆 さ れ た が, そ の ほか に もFHIT,ATM,BTG1やERGな ど の が ん 関 連 遺 伝 子 の 領域 に も異 常 は共 通 して 認 め られ,ゲ ノ ム異 常 の探 索 が未 知 の が ん 関 連 遺 伝 子 の 探 索 に有 効,か っ 強 力 な ツ ー ル で あ る こ と が 確 認 さ れ た.同 時 期 に らは の 小 児ALL 242例 に お い て 解 析 を行 って い る6).こ の 報 告 で も小 児ALLの ゲ ノ ム プ ロ フ ァイ ル は 同 様 の 傾 向 を も って お り,全 体 の40 %以 上 の 症 例 に お い てB細 胞 の分 化 に関 与 す る遺 伝 子 の 異 常 が 検 出 さ れ た と報 告 して い る.ま た,し か し,欠 失 の 頻 度 や 遺 伝 子 異 常 の 頻 度 に つ い て は異 な る点 もあ り, さ ら に解 析 を 進 め る こ と に よ っ て,小 児ALLの 発 症 分 子 機 構 に お け る よ り詳 細 な基 盤 は 明 らか に な る と思 わ れ る. 網 羅 的 ゲ ノ ム 解 析 は 小 児ALLの み な らず 多 様 な小 児 が ん にお い て な さ れ て お り7,11,16),新た な が ん 関 連 遺 伝 子 と疾 患 と の関 係 が証 明 され て い る.さ ら に,先 天 奇 形 症 候 群 の 原 因 遺 伝 子 の 探 索 に お い て も有 効 で あ る と考 え ら れ,今 後 の解 析 に よ り新 た な知 見 が得 られ る と期 待 され る. ゲ ノ ム解 析 技 術 の 進 歩 は さ らに進 み,よ り高 密 度 に プ ロー ブを 配 置 さ せ た タイ リ ング オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドア レ イ,免 疫 沈 降 と組 み 合 わ せ て エ ピゲ ノ ム の 解 析 を 行 う MeDIP-on-Chip,超 高 速 リ シ ー ク エ ンサ ー の登 場 な ど に よ り,今 後 さ らに解 析 技 術 の幅 は広 が る と考 え られ る. これ らの 技 術 を駆 使 して 生 み 出 さ れ る多 様 か っ 多 量 の ゲ ノ ム 情 報 を統 合 的 に整 備 す る こ と に よ り,小 児 が ん の 病 態 の 解 明 が 進 み,治 療 成 績 の 向 上 へ と寄 与 す る こ とが 望 ま れ る. 引 用 文 献

1) Greaves MF, Wiemels J: Origins of chromosome translocations in childhood leukaemia. Nat Rev Cancer 3: 639-649, 2003

2) Pui CH, Relling MV, Downing JR: Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 350: 1535-1548, 2004 3) Pui CH, Evans WE: Treatment of acute lymphoblastic

leukemia. N Engl J Med 354: 166-178, 2006

4) Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, et al: Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic mye-loid leukemia. N Engl J Med 355: 2408-2417, 2006 5) Garraway LA, Widlund HR, Rubin MA, et al:

Integrative genomic analyses identify MITF as a lineage survival oncogene amplified in malignant melanoma. Nature 436: 117-122, 2005

330 日本 小 児 血 液 学 会 雑 誌 第22巻 第5/6号 (2008年12月)

6) Mullighan CG, Goorha S, Radtke I, et al: Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia. Nature 446: 758-764, 2007

7) Mosse YP, Laudenslager M, Longo L, et al: Identifica-tion of ALK as a major familial neuroblastoma predispo-sition gene. Nature 455: 930-935, 2008.

8) Nicholls RD, Knepper JL: Genome organization, func-tion, and imprinting in Prader-Willi and Angelman syn-dromes. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 153-175, 2001

9) Monk D, Moore GE: Intrauterine growth restriction: Genetic causes and consequences. Semin Fetal Neonatal Med 9: 371-378, 2004

10) Saitoh S, Buiting K, Rogan PK, et al: Minimal definition of the imprinting center and fixation of chromosome 15q11-q13 epigenotype by imprinting mutations. Proc Natl Acad Sci USA 93: 7811-7815, 1996

11) Suzuki M, Kato M, Yuyan C, et al: Whole-genome pro-filing of chromosomal aberrations in hepatoblastoma using high-density single-nucleotide polymorphism genotyping microarrays. Cancer Sci 99: 564-570, 2008 12) Nannya Y, Sanada M, Nakazaki K, et al: A robust

algorithm for copy number detection using high-density oligonucleotide single nucleotide polymorphism genotyping arrays. Cancer Res 65: 6071-6079, 2005 13) Yamamoto G, Nannya Y, Kato M, et al: Highly sensitive

method for genomewide detection of allelic composition in nonpaired, primary tumor specimens by use of affymetrix single-nucleotide-polymorphism genotyping microarrays. Am J Hum Genet 81: 114-126, 2007 14) Kawamata N, Ogawa S, Zimmermann M, et al:

Molecular allelokaryotyping of pediatric acute lymphoblastic leukemias by high-resolution single nucleotide polymorphism oligonucleotide genomic microarray. Blood 111: 776-784, 2008

15) Kawamata N, Ogawa S, Zimmermann M, et al: Cloning of genes involved in chromosomal translocations by high-resolution single nucleotide polymorphism genomic microarray. Proc Natl Acad Sci USA 105: 11921-11926, 2008

16) Deshmukh H, Yeh TH, Yu J, et al: High-resolution, dual-platform aCGH analysis reveals frequent HIPK2 amplification and increased expression in pilocytic astrocytomas. Oncogene 27: 4745-4751, 2008