茶葉内の二次代謝物を対象にした質量分析イメージングの可能性の検討

茶葉内の二次代謝物を対象にした

質量分析イメージングの可能性の検討

Examination for the Potential of Mass Spectrometry Imaging

of Secondary Metabolites in Tea Leaves

鈴木利広

1,2

_{・内藤康秀}

1

_*

Toshihiro Suzuki and Yasuhide Naito

1

_{光産業創成大学院大学}

_{The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries, Hamamatsu, JAPAN}

2_鈴木園

_{Suzuki-en, Fujinomiya, SHIZUOKA, JAPAN}

The leaves of evergreen hardwoods such as tea tree （Camellia sinensis） are covered with thick wax, and overcoming this is a challenge in mass spectrometry imaging （MSI） of tea leaves. MSI experiments for secondary metabolites in tea leaves were conducted by matrix-assisted laser desorption/ionization （MALDI） using a liquid matrix and by DIUTHAME （desorption ionization using through hole alumina membrane）. The liquid matrix was applied by a manual operation using a pipette tip as a spatula. Despite this easy preparation for MALDI imaging, mass images that reflect the shapes and tissue structures of the tea leaves were acquired for m/z 175 presumably derived from theanine. In DIUTHAME imaging of tea leaf transverse sections, mass images were acquired for m/z 217 and m/z 291 presumably derived from caffeine and epicatechin, respectively, in addi-tion to that for m/z 175. In particular, for theanine, which is a palatable taste （umami） component of green tea, visualizaaddi-tion of the spatial distribution by MSI of tea leaves has not been reported so far. In the present study, the potential of MSI to analyze theanine translocation dynamics in tea leaves was demonstrated for the first time by MALDI imaging with liquid matrix and DIUTHAME imaging.

（Received December 22, 2020; Accepted January 8, 2021）

1.

 序   論

茶葉に含まれるカテキンなどの二次代謝物は，飲料とし ての茶葉独特の豊かな風味を与えているとともに，さまざ まな生理作用や健康上の利点をもたらすことが報告されて いる1） _（

_{Table 1}

_{）．チャノキ（}

_{Camellia sinensis}

_{）における}

それら二次代謝物の生物学的な意義や生合成経路の詳細に ついては，完全には解明されていない．二次代謝物の組織 内空間分布を知ることは，その解明の手がかりになるであ ろう．質量分析イメージングはその情報を与える有望な ツールである．しかし，茶葉をはじめとして植物組織に質 量分析イメージングを適用した例は，動物組織への適用例 と比較してきわめて少ない．常緑広葉樹であるチャノキ は，近縁種のツバキなどと同様に，葉の表面が太陽光や乾 燥などの刺激によるダメージを防ぐために厚いワックスで 覆われている．葉組織中の成分を質量分析イメージングの 対象にするには，ワックス層（「クチクラ」とも呼ばれる） を克服しなければならない． 代表的な質量分析イメージング技術であるマトリックス 支援レーザー脱離イオン化（

MALDI

）イメージングを植 物の葉に適用した例として，ピアス病菌に感染した柑橘類 について抗菌性二次代謝物の組織内空間分布を可視化した 研究がある2）_{．柑橘類の葉も厚いワックスで覆われてお} り，パラフィン包埋した葉をクライオミクロトームでスラ イスし断面の切片を得て

MALDI

イメージングしている． 包埋法による切片作製では，包埋材による汚染が常に課題 になる．上記の研究例では，アルミホイルで覆った葉のサ ンプルをパラフィン包埋することで汚染を防ぐ工夫をして いる．一方，葉組織の断面ではなくそのままの表面の

MALDI

イメージングは，シロイヌナズナやタバコの葉な ど，きわめて限られた例しかない3）∼6）_{．表面のワックス} 層は，組織内成分をマトリックス結晶に取り込む際の障壁 になることに加えて，マトリックス溶液を撥ねて均一なマ トリックスコーティングの阻害にもなる．茶葉については 表面と断面切片のいずれの場合も

MALDI

イメージングし た例はない． 植物サンプルの質量分析イメージングでは脱離エレクト ロスプレーイオン化（

DESI

）が比較的よく利用されてい る．

DESI

はマトリックスが不要であり，大気圧下でイオ ン化するので水分を多く含んでいるサンプルも扱える．し かし，厚いワックスに覆われた葉の場合，

DESI

イメージ ングでもインプリントを用いるなどの特殊な処理が必要に なる7），8）_．

_Liao

_{らはチャノキの葉表面と根断面について}

DESI

イメージングを行っている9）_{．葉表面については多} 孔質テフロンシートへのインプリントに対する間接的な

DESI

イメージングであり，これによりカテキンの分布を 可視化している．彼らの研究では葉からテアニンは検出さ

* Correspondence to: Yasuhide Naito, the Graduate School for the Creation of New Photonics Industries, 1955‒1 Kurematsu-cho, Nishi-ku, Hamamatsu 431‒1202, Japan

れず，（テアニンが多く蓄積している）根についてのみテ アニンの検出と分布の可視化に成功している．われわれが 知る限り，これまでに茶葉についてのテアニンの質量分析 イメージング報告例はない． 本研究は，液体マトリックスを用いた

MALDI

および貫 通孔ポーラスアルミナ薄膜を用いたレーザー脱離イオン化 （

DIUTHAME

）により，茶葉の断面切片について質量分 析イメージングを試みた．

DIUTHAME

は質量分析イメー ジングに適用可能なマトリックスフリーのレーザー脱離イ オン化技術である10），11）_{．また，茶葉表面について液体マ} トリックスを用いた

MALDI

イメージングを試みた．二次 代謝物の茶葉組織内分布を液体マトリックスの

MALDI

お よび

DIUTHAME

によって可視化できる可能性が見いださ れたので報告する．

2.

 実   験

2.1

 サンプル作製 食品として流通している茶葉（荒茶）は，茶園での採取 直後に酵素の働きを止めるため熱処理・乾燥などの工程を 経ているが，本研究では低温で輸送・保存した生葉を用い た．茶葉断面の切片は，

2

枚重ねた剃刀の刃を用いて葉を 細く裁断することで得た．このときの断面切片の厚さは， 刃先間ギャップの約

80 µm

になっていると考えられる．ま た，茶葉の厚さは

0.2 mm

程度であるが一定ではなく，茎 の近くの主脈は

0.5 mm

以上の厚みがある．さらに，主脈 は非常に多くの水分を含むため，茶葉表面の測定用サンプ ル は主 脈 を 除 去 し た． ス ラ イ ド ガ ラ ス（

ASLAB Super

White Glass 1-3345-01,

アズワン）に貼り付けたアルミ導 電性両面テープ（

AL-25DC, 3M

）の上に茶葉切片をセッ トした．その上からスライドガラスを押し当てて，切片と テープとの密着が均等になるように切片を固定した．

MALDI

用の液体マトリックスは，α

-

シアノ

-4-

ヒドロキシ ケイ皮酸（

CHCA

）と

3-

アミノキノリン（

3AQ

）の混合物 を用 い た．

1 mg

の

CHCA

と

4 mg

の

3AQ

を

40 µL

の メ タ ノールで溶解させて液体マトリックスとした．茶葉切片へ の液体マトリックス塗布はピペットを用いた．フラットタ イプのゲルローディングチップ（

4815, Corning, New York,

USA

）で切片上にマトリックスを滴下し，ヘラ状のピペッ トチップ先端を使ってマトリックスを薄く延ばした．

DIUTHAME

チップは，有効面Φ

10 mm

の製品（

A13331

‒

10

‒

_1,

浜松ホトニクス）を用いた．

DIUTHAME

チップを 切片上にセット後，植物関連サンプルの

DIUTHAME

イ メージングで実績のあるアセトンを抽出用溶媒として滴下 した．茶葉表面の測定に用いた大面積の切片は水分を多く 含んでいるため，イオン源にサンプル導入した後の装置の 真空度回復に時間が掛かり，半日程度放置する必要があっ た．

2.2

 質量分析イメージング 窒素レーザー（波長

337.1 nm

）を備えたレーザー脱離 イオン化飛行時間型質量分析計

ultraflex

（

Bruker, Bremen,

Germany

）を用いた．正イオンリフレクトロンモードでマ ススペクトルを取得した．レーザー照射スポット径は，こ の装置で達成できる最小集光径の約

20 µm

とした．レー ザ ー強 度 は 過 大 に な ら な い よ う に 注 意 深 く 調 整 し，

MALDI

測定のレーザー強度（アッテネーターの設定値） は

35

％，

DIUTHAME

測定では

40

％に設定した．すなわ ち，

DIUTHAME

では約

1.14

倍高いレーザー強度を用いて い る． レ ー ザ ー 照 射 ス ポ ッ ト 毎 に

MALDI

で は

150

回，

DIUTHAME

では

30

回マススペクトルを積算してデータと した．質量分析イメージングを行うため，装置付属の測定 用ソフトウエア（

flexControl, Bruker

）を自作プログラム で機能拡張してラスタースキャンの装置制御をした12）_． ラスター間隔（サンプルステージ移動量）は，茶葉断面の 切片に対しては

50 µm,

茶葉表面の切片に対しては

200 µm

と し，そ れ ぞ れ

7

×

7 mm

（

141

×

141

ピ ク セ ル），

25

×

25 mm

（

126

×

126

ピクセル）の方形領域をラスタースキャンし た．マススペクトル解析には装置付属のソフトウエア （

flexAnalysis, Bruker

）のバッチ処理を用い，自作のデータ処 理プログラムを併用して質量イメージの可視化を行った12）_．

3.

 結果と考察

3.1

 茶葉断面の

MALDI

イメージング

Figure 1A

に液体マトリックス

MALDI

測定で取得したマ ススペクトルを示す．強度の大きいピークのほとんどは液 体マトリックスに由来している．茶葉の成分は弱いピーク として観測されている．テアニンの［

M

＋

H

］＋_{に相当する}

m/z 175

±

0.5

の質量窓で抽出した質量イメージを

Figure 1C

に示す．サンプルの光学画像（

Figure 1B

）と比較して， 茶葉切片が存在する箇所のみが質量イメージを与えている ことが見て取れる．すなわち，液体マトリックスは切片の 外側まで塗布されているにもかかわらず，テアニンに相当 するイオンは切片上のみから生成しており，このイオンが

Table 1. Typical secondary metabolites（food functional ingredients）in tea leaves

Metabolites Formula MW Taste Major functions and health claims2

Catechin1

（Epicatechin） C15H14O6 290.26 Astringent Antioxidant activity, Anti-allergic effect, Anti-carcinogenic effect, Suppression of blood pressure rise, Atherosclerosis suppression, Improvement of lipid metabolism Caffeine C8H10N4O2 194.19 Bitter Excitatory effect, Awakening, Diuretic, Antipyretic analgesia, Cardiac stimulant

Theanine

（l-theanine） C7H14N2O3 174.2 Palatable Excitement suppression, Relaxation, Blood pressure relief, Sleep improvement, Antican-cer drug enhancement, Improvement of memory/learning ability 1.  Catechins in tea leaves include epigallocatechin （EGC）, epicatechin gallate （ECG）, and epigallocatechin gallate （EGCG） other than

epicate-chin （EC）.

茶葉の成分であることを示している．一方，カテキンの ［

M

＋

H

］＋_{に相当する}

_{m/z 291}

_±

_0.5

_{の質量窓で抽出した質量} イメージ（

Figure 1D

）は，ピーク強度が低かったため非 常に疎らな画像になっているが，切片の外まで質量イメー ジが広がっている．したがって，このイオンは茶葉の成分 ではなく，液体マトリックスなどに由来している可能性も あるが，液体マトリックス塗布の際にカテキンが流出した 可能性も否定できない．むしろ，液体マトリックスの塗布 方法を考えると，テアニンに相当する質量イメージが茶葉 切片の形状を留めていることは予想外であった．今回の測 定で検出された

m/z 175

がテアニンであると断定はできな いが，テアニンはチャノキ中のアミノ酸では最も多く，茶 葉にも豊富に含まれ，

MALDI

でテアニン標品が良好にイ オン化し容易に［

M

＋

H

］＋_{が得られることから，テアニン} の可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ る． こ の こ と か ら，

3AQ-CHCA

液体マトリックスを用いた

MALDI

により，茶葉の 他の成分については困難であるが，テアニンについては質 量分析イメージングが期待できる．

Figure 1.  Measurement results obtained from a transverse section of a tea leaf by MALDI imaging using a liquid matrix（CHCA/3AQ）. A） Resultant mass spectrum summed for all pixels. The prominent peaks on the mass spectrum are derived from the liquid matrix. B） Optical image of the tea leaf tissue section coated with the liquid matrix. Mass images for C） m/z 175, D） m/z 291 and E） m/z 303, presumably attributed to ［M＋H］＋ _{of theanine, epicatechin and quercetin, respectively.}

Figure 2.  Measurement results obtained from transverse sections of a tea leaf by DIUTHAME imaging. A） Resultant mass spectrum summed for all pixels. The prominent peaks on the mass spectrum are derived from the tea leaf components. B） Layout of the tea leaf tissue sections. Mass images for C） m/z 175, D） m/z 217 and E） m/z 291, presumably attributed to ［M＋H］＋ _{of theanine,}

3.2

 茶葉断面の

DIUTHAME

イメージング

Figure 2A

に

DIUTHAME

測定で取得したマススペクト ルを示す．マトリックス由来イオンに妨害されることがな いので，茶葉の成分は良好に検出できている．特に，テア ニンの［

M

＋

H

］＋_{に相当する}

_{m/z 175}

_{が顕著なピークとし} て観測された．また，カフェインの［

M

＋

H

］＋_{は検出でき} なかったが，［

M

＋

Na

］＋_{に相当する}

_{m/z 217}

_{が顕著なピー} クとして観測された．

Figure 2B

はイメージング領域にお ける茶葉切片の配置図である．テアニン，カフェイン，カ テキンに相当する質量窓で抽出した質量イメージを

Figure

2C

∼

2E

に示す．いずれの質量イメージも茶葉切片の形状 を留めており，アセトン抽出による成分の拡散は顕著では ない．しかし，十分薄い切片にできなかったため，ポーラ スアルミナ薄膜のひび割れの影響を一部蒙っている．これ らのイオンがそれぞれテアニン，カフェイン，カテキンで あると断定するにはさらなる検証が必要であるが，液体マ トリックス

MALDI

ではイメージング対象がテアニンに相 当 す る

m/z 175

に限 定 さ れ て い た の と 対 照 的 に，

DIUTHAME

では複数のイオン種をイメージング対象にで きた．この結果は，低質量域のイメージングにおける

DIUTHAME

の

MALDI

に対 す る 優 位 性 を 示 し て い る．

DIUTHAME

を利用した茶葉中の二次代謝物についての複 数成分イメージングが期待できる．

3.3

 茶葉表面の

MALDI

イメージング

DESI

イメージングによる先行研究では，茶葉表面の ワックス層を克服するため複雑な前処理工程を経て測定 し，それでもテアニンは茶葉から検出できていなかっ た9）_{．本研究で用いている富士山麓で生育されるチャノキ} の茶葉は上質であり，きわめて薄手かつ表面のワックス感 がない．そこで，ワックス層克服のため工夫する主旨から はいったん離れるが，この茶葉であれば表面からでもテア ニンを検出できるかもしれないと考え，

MALDI

イメージ ングによる茶葉表面でのテアニン分布の可視化を試みた．

1

枚の茶葉から主脈を除去して四分割し，向軸面と背軸面 それぞれ二つずつ標本を準備して液体マトリックスを塗布 し測定した．

Figure 3

に葉元側（茎に近い側）の測定結果 を示す．テアニンに相当する

m/z 175

のイオンは向軸面と 背軸面で全体として同程度の強度で検出されているが，分 布はかなり異なっている．背軸面（

Figure 3E

）では主脈 近傍に比較的多く分布しているのに対して，向軸面（

Fig-ure 3F

）では強い分布が主脈から離れた領域で見られ，葉 の端部でも多く分布している箇所がある．また，それぞれ の光学画像（

Figures 3A, 3B

）と見比べると，側脈の走り 方と

m/z 175

のイオン分布には相関があるように見える． 葉先側の結果（

Figure 4

）についても同様のことが言える． 葉先側では全体として

m/z 175

のイオンの強度が葉元側よ りも低い． チャノキの根で生合成されたテアニンは，茎から葉脈を 通って運ばれ葉全体に行き渡る．また，葉脈は背軸面側に ある主脈から葉の端に行くほど向軸面側に側脈が延びてい る．これらの茶葉構造から予想されるテアニン分布と

MALDI

イメージングで得られた

m/z 175

のイオン分布の 間には一貫性があり，

m/z 175

の質量イメージがテアニン 分布を可視化していると考えても矛盾を生じない．しかし

Figure 4.  Measurement results obtained from intact surface specimens of tea leaf sections close to tip by MALDI imaging with the liquid matrix. Optical images of the A） abaxial side and B） adaxial side specimens coated with the liquid matrix. TIC images obtained from the C） abaxial side and D） adaxial side specimens. Mass images for m/z 175, presumably attributed to ［M＋H］＋ _of

the-anine, obtained from the E） abaxial side and F） adaxial side specimens.

Figure 3.  Measurement results obtained from intact surface specimens of tea leaf sections close to stem by MALDI imaging with the liquid matrix. Optical images of the A） abaxial side and B） adaxial side specimens coated with the liquid matrix. TIC images obtained from the C） abaxial side and D） adaxial side specimens. Mass images for m/z 175, presumably attributed to ［M＋H］＋ _of

ながら，テアニンは日照による異化作用で消失するため， 向軸面で乏しいことを予想していたが，それとは異なる結 果が得られた．チャノキ栽培では，旨味成分であるテアニ ンを増強させるために遮光栽培し，玉露や白茶などが生産 されている．一方で，富士山麓のように日照があまり強く ならない栽培環境では，遮光しなくてもテアニンが十分保 たれると考えられる．もし，今回検出された

m/z 175

がテ アニンであるならば，今回の測定結果は，日照はむしろテ アニン異化産物のカテキンの分布に影響を与えている可能 性を示唆している．このことを確かめるには，茶葉抽出物 の

LC/MS

測定とともに，カテキン分布の質量分析イメー ジングが有効であろう．

DIUTHAME

イメージングはカテ キン分布の可視化の可能性を有している．しかし残念なが ら，茶葉表面は葉脈による起伏が激しくポーラスアルミナ 薄 膜 が 簡 単 に 割 れ て し ま う た め， 今 回 使 用 し た

DIUTHAME

チップは適用できない．現在，サンプルのイ ンプリントを扱えるように割れにくくしたブロッティング 用

DIUTHAME

チップも製品化されているので，その適用 を検討している． 文 献 1） 食品機能性の科学 編集委員会編，“食品機能性の科学”， 産業技術サービスセンター，東京（2008）．

2） M. S. Soares et al., Phytochemistry, 115, 161‒170（2015）． 3） R. Shroff, F. Vergara, A. Muck, A. Svatos, and J. Gershenzon,

Proc. Natl. Acad. Sci., 105, 6196‒6201（2008）．

4） V. Vrkoslav, A. Muck, J. Cvacka, and A. Svatos, J. Am. Soc.

Mass Spectrom., 21, 220‒231（2009）．

5） A. J. Ibanez et al., Plant Methods, 6, 14（2010）．

6） A. A. Lopes et al., Chem. Commun., 49, 9989‒9991（2013）． 7） J. Thunig, S. H. Hansen, and C. Janfelt, Anal. Chem., 83, 3256‒

3259（2011）．

8） R. G. Hemalatha and T. Pradeep, J. Agric. Food Chem., 61, 7477‒7487（2013）．

9） Y. Liao, X. Fu, H. Zhou, W. Rao, L. Zeng, and Z. Yang, Food

Chemistry, 292, 204‒210（2019）．

10） Y. Naito, M. Kotani, and T. Ohmura, Rapid Commun. Mass

Spectrom., 32, 1851‒1858（2018）．

11） K. Kuwata, K. Itou, M. Kotani, T. Ohmura, and Y. Naito, Rapid

Commun. Mass Spectrom., 34, e8729（2020）．

12） Y. Naito, M. Kotani, and T. Ohmura, Supporting Information,

J. Am. Soc. Mass Spectrom., 31, 2154‒2160（2020）．

Key words: Mass spectrometry imaging, Camellia sinensis, Theanine, MALDI, Liquid matrix, DIUTHAME, Plant biology