薄層クロマトグラフィーによるα-ケト酸の分離.・定量
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(2) . ・. ７巻 第１号 第１. 昭和４１年９月. 北海道教育大学紀要 （第二部Ａ）. 薄層 クロ マ ト グラフィ ーに よ る α ‐ ケ ト酸の分離 ・定量. 渡. 俊. 部. 夫・橋. 本. 孝. 生＊. 北海道教育大学岩見沢分枝化学教室. ｉｏｎ ｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ Ｔｏｓｈｉｏ ＷｒＡＴＡＮＡＢＥ ａｎｄ Ｔａｋａｏ ＨＡＳＨＩＭＯＴＯ ： Ｓｅ ）ａｒａｔ １. ｌ ｄｓ ｂｙ Ｔｈｉｎ‐ ｆ α－Ｋｅｔｏ Ａｃ ｉ ａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ｏ. 緒. 言. α－ ケ ト酸 の 定 量 に つ い て は， 従 来 種々 の 方 法 が 試 み ら れ て い る。 な か で も ジ ニ ト ロ フェ ニ ル ヒ. ドラ ジ ン （ＤＮＰ） で， α－ ケ ト 酸 の ジ ニ トロ フエ ュ ル ヒ ドラ ゾ ソ （ＤＮＰＨ） を つ く り 定 量 す る 方 法 は広く用いられている 二種類以上の α－ケト酸の存在する場合に それらの ＤＮＰＨ を分離する. ，. 。. 方 法も， ペ ーパ ー ク ロマ ト グラ フ ィ ー や カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー を 用 い て 考 察 さ れ て き た。 しか し， ペ ー パ ー ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ る ＤＮＰＨ の分離では， 時間の点とその分離能の点に. 問題があり， またカラ ムでは分離の技術に問題が ある。 ） は α－ ケ ト酸 を ＤＮＰ で 処 理 し， 薄 層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ っ て 分 離 し ｉ 最近， Ｊ ｓ 等１ ， Ｄａｎｃ. 比色定量する方法を， ピル ピン酸および枝をもつ α‐ ケト酸について報告 している。 ）は， 鮭卵のけ 時化時の α－ ケ ト酸 を 測 定 し， α‐ ケ ト グ ル タ ル 酸， ピル ビ ン 酸 等 と と も 著者等２ に， グ リオ キ シル 酸 が 相 当 量 含 ま れ る こ と を 認 め た。 グ リ オ キ シ ル 酸 の ＤＮＰＨ については報告が 少なく， その異性体についてはあまりふれられていないので，グリオキツル酸を中心に，その他のお も な α－ ケト酸を， 薄層クロマ トグラフィーにより分離・定量する方法について検討を行なっ た。 実. 験. 方. 法. 薬 １， 試 ２，４‐ＤＮＰ お よ び グ リ オ キ シル 酸 ナ ト リ ウ ム は 小 宗 化 学， ピル ビン 酸 ナ ト リ ウ ムは 関 東 化 学， α－ ケ ト グ ル タ ル 酸 お よ び オ キ ザ ロ 酢 酸 は 第 一 化 学， α‐ ケ トイ ソ パ レ リ ア ソ 酸 お よ び α－ ケ トイ ソ カ ｌ の も の を 用 い た。 プロ ソ 酸 は ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａ. 薄層の吸着剤としては， Ｍｅｒｃｋ の シ リカ ゲ ル Ｇ お よ び和 光 純 薬 の ワ コ ー ゲ ル Ｂ‐１０ を 用 い た。 ２， 薄層クロマ トグラフィ ー用試料の精製 ａ. α－ ケ ト酸 の ＤＮＰＨ. α－ ケト酸の水溶液に，. 化. その５倍以上のモル数の ＤＮＰ が含まれる量の ＤＮＰ 溶液 （２Ｎ‐ＨＣＩ１ｏｏ. ｍｌ に ＤＮｐ ｌｏｏ ｍｇ を溶解） を加え， 水または ２Ｎ－ＨＣＩ で， 混合液をほぼ ＩＮ‐ＨＣＩ 濃度に調節 す る。 こ れ を３０分 間， ３０ｏＣに 保 ち ＤＮＰＨ 化を行なう。 グリ オ キ ツル 酸， ピル ビ ン酸， α‐ ケ ト グ ル タ ル 酸 お よ び α‐ ケ トイ ソ カ プ ロ ソ 酸 は， す べ て２５分. ＊現在 釧路市東中学校教諭 （３９）.
(3) . 薄層クロマトグラフィーによる α－ ケト酸の分離・定量. までには反応が完結する。 オキザロ酢酸および α－ ケ トイ ソ バ レ リ ア ソ 酸 は３０分 を 過 ぎ て も 反 応 は 僅かに進むが， 最も ＤＮＰＨ 化されにくいオキザロ酢酸 で， 反応時間が３ ０分か ら土５分ずれたとし て も， そ の 誤 差 は ３ ％ に と どま っ た。 ｂ. ＤＮＰＨ. 試料の精製. ＤＮＰＨ 化 した反応液を ％～輸 容の酢酸エチル溶液でくり返 し ＤＮＰ と ＤＮＰＨ の色がなくな ，. るまで抽出 する。 ＤＮＰＨ を未反応の ＤＮＰ と分離する為に 数回 炭酸ナトリウム一重炭酸ナトリウ ム溶液 （炭 ， ， 酸 ナ ト リ ウ ム ５ ｇ， 重 炭 酸 ナ ト リ ウ ム ０，５ｇ を 水 ｌｏｏ ｍｌ に溶解） で抽出する. 。 こ の抽出液を ２Ｎ－ＨＣＩ の少量 で微酸性に し， 酢酸エチルで数回抽出 し， 減圧乾固して， 薄層ク. ロ マ ト グラ フ ィ ー の 試 料 と す る。 α‐ ケ ト酸 の ＤＮＰＨ 化か ら， す べての操作を晴所で行ない， オキザロ酢酸の ＤＮＰＨ の分解を. 防ぐ。 ３ ． 分離および定量 ａ. 薄 層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ る 分 離. 薄 層 の プ レー ト は， シ リ カ ゲ ル Ｇ を ０，２５ｍｍ に 塗 布 し， １１ｏｏＣで １ 時 間 活 性 化 した 。 展 開 は 主 と し て， 石 油 エ ー テ ル‐蟻 酸 エ チ ル‐プ ロ ピオ ソ 酸 （６５：３５：０，５ｖ／ｖ） を 用 い た 。 また クロ ロ ホ ル ム「ブ タ ノ ー ルー酢 酸‐水 系 の 下 層 液， ベ ン ゼ ン‐ブ タ ノ ー ルー酢 酸‐水 系 の 上 層 液 ず ソ ア ，. ミルアルコールーアンモニア水系についても， それぞれ混合の割合を変えて試 した。 試料は少量の酢酸エチルで溶解 し， ミクロ ピペッ トで プ レートにつけた。. １２～１３ｃｍ 展開するために要 した時間は， ２ ００Ｃで約４０分である。. 展 開 終 っ た プ レー ト は 風 乾 して か ら， ス ポ ッ トの 部 分 の シ リ カ ゲル を け ず り と り ， 水 ３ ｍｌ ，２Ｎ‐ ＨＣ１ ３ ｍｌ を 加 え， さ らに 酢 酸 エ チ ル ３ ｍｌ を加え通気抽出する この抽出は適当 回数くりかえ. 。. す。. 抽 出後， 減圧乾固 して， 比色用の試料とする。 ｂ 比色定量 ０ こ の 試 料 に ＩＮ‐Ｎａ２Ｃ０３ ４ ｍｌ を加え ３ ０分間反応さ せて比色定量す る。 比色は平間光電 ， ０ Ｃで１ ＩＢ 型を用いて行なっ た。 また吸収曲線からの検討は 日立１３９型分光光電光度計によ 比色計 １ ， っ た。. この分離・抽出・乾固・発色までの操作も， 暗所で行ない， オキザロ酢酸の分解を防いだ 。. 結果および考察 １ ， 検量線の作成 各 α－ ケ ト酸 の ＤＮＰＨ を， 酢酸エチルで一定量と・ し， その一定量をピペッ トでとり， 乾固， 発. 色さ せて検量線を作成 した （第１図） 。. しか し， 実 際 に 用 い る 検 量 線 と して は， ＤＮＰＨ 化による損失を考えなければならない つまり 。 ， ケ ト酸の一定量から， これを ＤＮＰＨ 化した場合の比色値を第２図に示したが 定量の際はこ. α－. ，. れを基準と した。 前 記 の 通 り 発・色 さ せ， ３９０ ｍ” で ０，５ｃｍ の液槽で吸光度を測定した 。 α‐ ケ トイ ン パ レリ ア ソ 酸 の 場 合 に， ケ ト酸 か らと， そ の ＤＮＰＨ とからでは ， 吸光度にかなり 開 き が あ る の は， ＤＮＰＨ 化反応の速度のおそい点に一因があると考えられるが 同じ反応速 度の. ，. （４０）.
(4) . 渡 部 俊 夫・橋 本. 孝 ・生. 小さいオキザロ酢酸ではさほ どでなかっ た。 前者は後者よりも酢酸エチルにはかなりよく溶けるの で， 炭酸ナトリウム－重炭酸ナトリウム溶液に転溶するときの損失が， 反応速度の小さいことに加 わるものと考え られる。 な お， 各 ＤＮＰＨ の 吸 収 曲 線 の ピー ク は， 第 １ 表 に 示 した が， ほ と ん ど３７０ か ら３８０ ｍ” に ピー ク を も ち， グ リ オキ ツル 酸 の ＤＮＰＨ の 吸収 の 場 合 に ピー ク が ３７０ ｍ” の ほ か に， ４４５ ｍ” に も み られ る の で， こ の 点か らの 考 慮 も 加 え て， 測 定 は す べ て ３９０ｍ” で 行 な っ た。. ２， 展開溶媒についての検討 ） はイ ン ア ミ ル ア ル コ ー ル －０ ２５Ｎ ア ン モ ニ ア 水 （２０：１） を 用 い て α‐ ケ ト酸 の ｉ Ｊ ｓ 等１ ， Ｄａｎｃ ， ， ＤＮＰＨ を分離している この展開液について相互の割合をいろいろ変えて実施 した結果では α‐. 。. ，. ケ ト グ ル タ ル 酸， オ キ ザ ロ 酢 酸 が と も に 原 点 に と どま る こ と と， テ ー リ ン グ を 起 こ し や す い こ と 等. で， あまり良い結果は得 られなかっ た。 ） の 用 いた 石 油 エ ー テ ル‐蟻 酸 エ チ ループロ ピ オ ン 酸 で Ｐ， Ｒｏｎｋａ ｉｎｅｎ３ ，. １ ０ ‐. ０ ２ ，. 第１図. ３ ０ ．. ０４. １. メ小１. 検 量 線－１. ビ ル ソ ノ 酸 ◎ … …α一 ケ ト グ ル タ ル 酸. ザ. キ. 第. ロ. １ 表. 量 線－２. △……グ リ オ キ シ ル 酸 ０……α－ ケ ト イ ソ バ レリ ア ソ酸 □……α－ ケ トイ ソ カ プ ロソ酸. 酢 酸. α‐ ケ ト 酸 ＤＮＰＨ の 吸 光 度 吸収種大における 吸 度 光. ＤＮＰＨ. 検. ０ ３ ．. 各 α－ケト酸を ＤＮＰＨ 化し， ＩＮ‐Ｎａ２Ｃ０３ ４ ｍｌ で３ ０℃，１ ０分間発色， ０ ，５ｃｍ 液糟で ３９０１ １ １” で測定。. 金…… ピ. 圏……オ. ０ ２ ． ，. 第２図. 各 α－ケト酸の ＤＮＰＨ を直接 ＩＮ‐Ｎａ２Ｃ０３ ４ｍｌ で３ ０℃，１ ０分間発色， ０，５ｃｍ 液槽で ３ ９０ｍ” で測定。. プ ロ ピオ ン 酸 を や や 増 し. （波長 ｎｗ）. ３ ９０ｍ口 における吸光度. （３７２）. ０ ，４４１ ０．５８９. 酸. ０，５１０ ， ０ ，５９９ ０ ，５４０. 酸. ０ ．４０３. （３７０）. α－ ケ ト イ ソ バ レ リ ア ソ 酸. ０ ．５１０ ０．３９５. （３７９）. ピ. ル. α－ ケ. オ グ. ビ. ト. キ リ. グ. ザ オ. ン ル. タ. ロ キ. 酸 ル. 酢 シ. ル. 酸. α－ ケ ト イ ソ カ プ ロ ソ 酸. 各. （３８１） （３７３）. （３７５）. ＤＮＰＨ ０，２ 〆Ｍ を ＩＮ－Ｎａ ２Ｃ０３ ４ｍｌ で発色， ０．５ｃｍ の液槽で測定。. （４ヱ）. ０，４７３ ０ ，３４８ ０，４７８ ０，３５７.
(5) . 薄層クロマトグラフィーによる α‐ ケト酸の分離・定量. た方が， バ ン ドは少 し広がるが Ｒｆ が大きくなり， 都合のよい結果を得た。 薄 層 ク ロマ ト グラ フ ィ ー に お い て， Ｒｆ はその 度に多少異なるが， 各 ＤＮＰＨ の相対的位置は一 定 して い る。 ブ タ ノ ー ルー酢 酸‐水 の 下 層 液 や， ベ ン ゼ ン‐ブ タ ノ ー ルー酢 酸－水 の 上 層 液 で ま た，・ ，クロ ロ ホ ル ム もかなり良い結果を得た これらの溶媒 では ブタノールを増すと Ｒｆ は大 きくなる。. ，. 。. ３， ＤＮＰＨ の異性体についての検討. シソーアンチ異性体の分離. ａ. ４～７ ） α－ ケ ト 酸 の ＤＮＰＨ の シ ソーア ン チ 異 性 体 に つ い て の 報 告 は 多 く 提 出 さ れ て い る ） 。 薄 層 ク ロ ） は ピル ビ ン酸， フェ ニ ル ピ ル ビ ン 酸， α－ ケ トイ ソ ｉ ｓ 等１ マ ト グラ フ ィ ー に よ る 分 離 で も， Ｊ ， Ｄａｎｃ ） は 吸 着 剤 に セ ル ロ ー ス を 用 い’ ｌ ａｒｄ８ カプロソ酸についての異性体を検 討しており， Ｈ，Ｓ， Ｂａｃｈｅ. オキ ザロ酢酸の両 異性体を得ている。 シリカゲルで行なっ た本実験では， 展開溶媒に石油エーテル‐蟻酸エチル‐プロ ピオソ 酸 を 用 い て， グリオキシル酸のみに両異性体が得られ， クロロホルムーブタノールー酢酸－水を用いた場合に は， グ リオ キ シ ル 酸， ピル ビ ン 酸 お よ び α‐ ケ トイ ソ カ ブ ロ ン 酸 に そ れ ぞ れ 両 異 性 体 が 得 られ た。 ） はピル ビン酸について， そのモル比を検討し， ピル ビン酸は Ｒｆ の小さい異性体 ｉ Ｊ ｓ 等１ ， Ｄａｎｃ が９６％ で， 大 き い 方 は 無 視 しう る と して い る。 本 実 験 に お い て も， 石 油 エ ー テ ル－蟻 酸 エ チ ル‐プ. ロ ピオソ酸を用いた場 合に異性体の分 離 を み ず， 異性体の存在による誤差は無視 しうるものと し たｏ α‐ ケ トイ ソ カ プ ロ ソ 酸 は Ｒｆ の小さい方の 異性体が極く少なく， 溶媒によっ ては分離しなかっ た。 な お， α－ ケ ト酸 の ＤＮＰＨ の異性体については， 一般に Ｒｆ 大のものを異 性体１， Ｒｆ の 小 の も の を 異 性 体 ２ と 呼 ん で い る。 た だ し本 実 験 で， ピル ビ ン 酸 に つ い て は， ペ ー パ ー ク ロ マ ト グラ フ ィ ー と 薄 層 クロ マ ト グラ フ ィ ー で は， 両 異 性 体 の Ｒｆ が逆になることを見出 した。 つまり， あらかじ め ＩＮ‐ＮａＨＣ０３ に 浸 し風 乾 した 櫨 紙 で， ブ タ ノ ー ルーエ タ ノ ー ル‐０，ＩＮ‐重 炭 酸 ナ ト リ ウ ム （４：１：２. ｖ／ｖ） の上層 液で分離した場合と， クロロホルム‐ブタノールー酢酸－水で薄層で分離を行なっ た場合 と で， Ｒｆ の大小と吸収曲線を比較すると全く逆になる。 グ リ オ キ ツ ル 酸 の ＤＮＰＨ の異性体. ｂ. グ リオ キ ツ ル 酸 の ＤＮＰＨ は， その両異性体の Ｒｆ の大小が， 癌紙による分離 と薄層による分離. とで変わらない ことを確かめたので， Ｒｆ の大きいものを異性体１と し， 小さいものを異性体２と した。 第 ２ 表 ＼＼＼ ＼＼. α－ ケ ト 酸 ＤＮＰＨ の Ｒｆ. ‐蟻酸ェ 展開溶媒 石油エーテル チループロピオソ酸 「 －＼＼ ＼＼＼ ＼. ＤＮＰＨ. ６５：３５：０ ．５ ｖ／ｖ. イ ン アミ ルア ル コー ル. クロロ ホ ル ムーブタノールー酢酸‐ 一○ ２５Ｎ ７ ソモ ニ ア水 ， １００；１〇：１α１ｏｏ 水１００；５：５：１００ ２０：ｌ ｖ ／ｖ ／ ｖｖ. キ ザ ロ 酢 酸. ０ ，０５. ０．０３. α‐ ケ ト グ ル タ ル 酸. ０．１５. ０ ．０７ ０，２０ ０，３１. オ. グ リ オ キ シ ル 酸. 葺 き ｛８ 二. 酸. ０．４１. ル ケ トイ ソ バ レリ ア ソ酸. ０，４３. ピ. ル. ビ. ン. α－ケ ト イ ソ ．カ ブロ ソ酸. － Ｌ. ４ ０ ２ ． Ｏ ６６ ． ０．７１ ０ ，６７. ０ ．４４. （４２）. ｆ １. ０．０５. ０. ０ ，１０ ｏ ．２３ ０ ，３３. ０. 写 曇 ｛８ ： ０．７９ ０，７３. ｇ 基 ｛８ ： ｇ ８ ｛８ ： ０，４０. 琶 琵 ｛８ ：.
(6) . 渡 部 俊 夫・橋. 本 孝 生 グ リ オ キ シ ル 酸 の ＤＮＰＨ は 炭 酸 ナ ト リ ウ. ム溶液に溶かすと， 第３図に示 す よ う に， ３７０ ｍ〆 と４ ４５ｍ” に吸収極大を示す。 薄 層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ り， 両 異 性 体. ０ｍ” を分離して吸収を測ると， 異性体１は３７ の み に 極 大 を 示 し，，異 性 体 ２ は３７０ｍ” と４４５ ｍ” に ピー ク を も つ。 こ の こ と か ら， 炭 酸 ナ ト リ ウ ム で 発 色 さ せ. ３００. 第３図. ５ ３ ０. ０ ０ ４. 帖０. 比色するまでの間に， ２から１への異性化の 起っ ていることが考えられる。 分離した 異性. 鱒ｏ ｍ〆. 体２の炭酸ナトリウム溶液を４時間放置して. グリオキシル酸 ＤＮＰＨ の吸収曲線. から吸収を測ると， ４４５ｍｇ の ピー ク は ほ と ん ど認め難くなる。 つまり， 定量までの処理条件が影響すると考えなければならない。 そこで， 薄層につける前の試料と， 薄層にょ ・り分離してか ら， 両異性体のスポッ ト部分を混ぜて 抽 出 ・ 発 色 さ せ た も の と を， ３７０ ｍβ と ４４５ｍ” の 吸 光 度 に つ いて 比 較 した。 ま た， 実 際 の 測 定 に 用. いた３９０ｍ” の吸光度についても相互の比を求めた （第３表～第５表）。 この結果から， 薄層による分離後に両異． 性体を混ぜて抽出・発色を行なっ ても， 異性化による誤 差は極く少ないことが 示された。 異性化による誤差は， 発色後の時間に注意することによっ て防ぎ 第３表. ＼ ＼ 選 試き１. 波 長. Ａ. グリオキシル酸 ＤＮＰＨ の吸光度の波長による比較. １. Ｂ. Ｃ. Ｉ. Ｄ. ｆ. Ｆ. Ｅ. 誉 驚 Ｅ登 川暮 萱 葺審 字 室 塁 ８１暮 三 一書 馨. ０ ，５５８ ０ ，４９３ ０ ．４７０. 試料 Ａ， Ｂ， Ｃ……グリオキシル酸 ＤＮＰＨ を発色。 試料 Ｄ， Ｅ， Ｆ……グリオキシル酸 ＤＮＰＨ を薄層で処理してから， 両異性体を混ぜて抽出・発色。 第 ４ 表. グリオキシル酸 ＤＮＰＨ，の二つの吸収極大における吸光度の比 Ａ. Ｂ. Ｃ. Ｄ. Ｅ. Ｆ ，. 試料 Ａ～Ｆ……第３表に同じ。. 爵 長 官 波. 比. 第 ５ 表. グリオキシル酸 ＤＮＰＨ の二つの吸収極大および ３ ９０ｍ” における吸光度の各試料間の比. １. Ｂ／Ａ. Ｃ／Ａ ｃ. Ｄ／Ａ. Ｅ／Ａ. Ｆ／Ａ. １ ，２０ １ ．１９ １ ．１６. １ ，４４ １ ，４２ １，３８. １，３０ １ ．２８. １ ．２０ １ ，２１. １ ，３６ １，３８. １，２３. １ ．２２. １ ，３８. ３ ７０ ｍ〆 ３ ９ ０ ｍ” ４ ４ ５ ｍ”. 試料 Ａ～Ｆ……第３表に同じ。 （４３）.
(7) . 薄層クロマトグラフィーによる α‐ ケト酸の分離・定量. うるものと思われる。 また， 測定を中間の３９０ｍ” で行なうことは， この誤差を少なくする為に 役立つ。 ４ ， 薄層クロマ トグラフィ ーによる回収率 各 α‐ ケ ト酸 の ＤＮＰＨ に つ い て 薄 層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー で 展 開 後， 抽 出 した も の に つ い て 回 収. 率を試 した。 回収率は第１図の 検量線より求めた。 第６表に示したように， 迅速な定量法と して， また， 薄層による分離が著しくす ぐれていること を考え合わせれ ば， 満足 しうる結果といえよう。 α－ ケト酸 ＤＮＰＨ の薄層クロマトグラフィ ーによる回収率. 第 ６ 表. 数. ル. 比. 較. 酸. ｄ ０，１６８”ｈ. ０，３６８. 酸. ０ ，１１０. ０，３２４. 酸. ０，１９５. ０ ，４６０. 酸. ０．２６１. ０ ，４５５. α‐ ケ ト イ ソ バ レ リ ア ソ 酸. ０．１００. ０．２４０. α‐ ケ ト イ ソ カ プ ロ ソ 酸. ０，１４５. ０，２６０. ビ. α‐ ケ. オ. ピ. ル. キ. グ ，リ. グ. ト. ル. ザ. オ. ン. タ. 酢. ロ. キ. ル. シ. ル. 度. 光. 吸 モ. 液. 回. 収 ０ ，３３０ ０ ．３３４ ０ ．３３２ ０，３３４ ０ ．３１６ ０，３１８ ０，４２８ ０ ，４４２ ０ ，４３７ ０ ．４４２ ０ ，４４５ ０ ，４３６ ０．２２２ ０．２３２ １ ０．２３ ０，２４７ ０ ．２５９ ０ ，２５１. 後 ８９．９ ％. ９９ ，６. ９４ ，８. ９６ ，９. ９４ ．７. ９７ ，３. 約. 要. グ リ オ キ シ ル 酸， ピル ピ ン 酸， オ キ ザ ロ 酢 酸， α‐ ケ ト グ ル タ ル 酸， α－ ケ トイ ソ バ レ リ ア ソ 酸， α【 ケ トイ ソ カ プロ ソ 酸 の， 薄 層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ る 分 離 ・ 定 量 を 試 み， 次 の 結 果 を 得 た。 １， ３０分 間， ３０ｏＣで ＤＮＰＨ 化 を 行 な っ た が， こ の 操 作 に おい て， α‐ ケ トイ ソ バ レ リ ア ソ 酸 の 損 失 が 大 き か っ た。 しか し， 用 い た α‐ ケ トイ ソ バ レ リ ア ソ 酸 の モ ル 数 と， ＤＰＮＨ 化 して 測 定 し. た吸光度とからは， 直線的な関係が得られた。 ２， 展 開 溶 媒 に つ い て は， 石 油 エ ー テ ル‐蟻 酸 エ チ ル…プ ロ ピオ ソ 酸 （６５：３５：０，５）， ク ロ ロ ホ ル ム‐ブ タ ノ ー ルー酢 酸－水 （１００：１０：１０：１００） の 下 層 液 で 充 分 な 分 離 が で き た。 ３， α‐ ケ ト酸 ＤＮＰＨ の シ ソーア ン チ 異 性 体 に つ い て は， ペ ー パ ー ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に お い て も， 薄 層 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に お い て も， 一 般 に Ｒｆ の大小によ り異性体１， ２と呼んでいるが， ピル ビン 酸 ＤＮＰＨ の異性体 は， 瀬紙で分離した時と 薄層で分離した時とで， Ｒｆ の大小が逆にな る こ と を 認 め た。 ４，. グ リ オ キ シ ル 酸 ＤＮＰＨ の異性体は， どちらもかなりの量で分離され， Ｒｆ 小の方の異性体. は炭酸ナトリウム溶液中で不安定である。 しかし， 発色操作を注意 して行なうことによって， 異性 体の存在による誤差およ び， 異性化のための誤差を防く こ と が で き る。 ５． 薄層クロマ トグラフィ ーは， この操作自体を 通しての損失は少なく， その分離能と所要時間 （４４）.
(8) . 渡 部 俊 夫・橋 本 孝 生. からみて， 何種類かの α－ ケ ト酸の混っ ている試料について， 有効な分離および測定の手段といえ るｏ. Ｓｕｍｍａｒｙ Ｔｈｅ ｓｅ ｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｒｎｉｎａｔ ｉｏ． ｆ ｔｈｅ ２， ４－ｄｉｎｉｔｒｏｌ ） ａｒａｔ ｌｏ ｉ ． ）ｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅＳ ｏｆ ｇｌｙｏＸｙ． ｉｄ ｃ ａｃ ， ． ｄ ｋ ｌ ｄ ｉ ｉ ｉ ｉ ｉ ｄ ｋ ｌ ｔ ｉ ｕ ｖ ｔ ｔ ｉ ｄ ｏ ｘ ｃ ｃ － ｒ ． ｃ ｋ ｄ ｏ ｕ ａ ａ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ａｃ ， ｐｙ ｓ。ｃａｐｒ。ｉｃ ， α ｅ ｇ ａｒｃ ａｃ ， α－ ｅ ｏｓｏｖａｅｒｃ ａｃ ， ａｎ α一 ｅｔｏｉ ｉ ｄ ａｒｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ． Ｔｈｉｎ‐ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｒ ｌ ｉ ａｃ １ ｎａｔｏｇｒａｐｈｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｐｐ ｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔ ｄｉｎｉ ｌ ｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅＳ ｉｏｎｉ ｉｄ （ ） ６５：３５：０，５ ｃａ ｃ ． ） ａｎｄ ， Ｐｅｔｒｏｅｕｒｎ ｅｔｈｅｒ－ｅｔｈｙｌ ｆｏｒｍａｔｅ－ｐｒｏ ｌｏｗｅｒ ｌａｙｅｒ ｏ ｆ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｂｕｔａｎｏｌ‐ａｃｅｔｉｃ ａｃ ｉ ｄ－ｗａｔ １００： １０：１０： １００ ｅｒ（ ） ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｅｍｐｌｏｙｅｄ Ｅ ｉｍｅｎｔｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｌｙｏｘｙ ． ｓ ｐａｐｅｒ ｓｈｏｗ ｔｈａｔｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇ ｉ ｎ ｔｈｉ ｉ ｄｉ ｃ ａｃ ， ｘｐｅｒ ｓ ｈ ｄ ｉｎｉ ｉｂｌ ｉｄ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｔ ｓ ｅ ｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ ｏｆ ｔｈｉ ｓ ａｃ ｐｏｓ ， ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｓｏｍｅｒｓ 。ｆｔ ｅ ｂｏｔｈ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，. 文 １ ） ２ ） ３ ） ４ ） ５ ） ６ ） ７ ） ８ ）. 献. ｌ ｔ Ｊ ｏｃ粥川， βお汐勿ｓ １９６３ ｅ ｒａｎｄ Ｍ． Ｌｅｖｉ ｚ； βＺ ｓ ｚ ） ， ＡＣ紹，７８， ８５ （ ，Ｄａｎｃｉ ，Ｊ ， Ｈｕｔ ，. 渡部俊夫， 西田秀夫， 橋本孝生， 藤田陽一：未発表. Ｐ， Ｒｏｎｋａ ｉ １９６３ ？ ｏｇ ） ｎｅｎ：ノ αｆ ， Ｃ無 惨’ ， ， ，１１， ２２８ （. １ 香月格彦， 金行広雄：光電比色法， 各論１， 南江堂 （ ９５８ ）ｐ ，９５ ．. 日， Ｋａ ｉ ｉｗａｋ ｉａｎｄ ｓ ｔ ｓｕｋ ｚｕ １９５８ ） ， Ｔａｎａｋａ； ～のとげβ ， Ｋ，Ｓｕｍｉ ， Ｔ． Ｍｏｒ ， ，１８１， ６３９ （ Ｆ ｉ １９５４ ｃｋｓｈａｎｋ： ～の ″” ｓｈｅ ｒｗｏ。ｄ ａｎｄ Ｄ， 日， Ｃｒｕ ） ・ Ａ，ｌ ， ，１７３，１２１ （ Ｆ １９５５ ） ｓｈｅＭｏｏｄ ａｎｄ Ｌ ｓ： Ｎｑ加 川 １７６， ４１９ （ ， Ａ．ｌ ，Ｊｏｎｅ ， ｄ： Ａ● Ｈ，Ｓ ｌ １９６５ “〆， βどの 加川， ｃｈｅ ａ ｒ ） ， Ｂａ ， ，１２，８ （. （４５）.
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