サ ル コ イ ドー シ ス 患 者 肺 胞 リ ン パ 球 の
Interleukin-2
receptor
α(IL-2R
α)mRNAの
発 現 に 関 す る 研 究
岡 山大 学 医学 部 第 二 内科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎 教 授)
西
崎
浩
(平成5年11月16日
受 稿)
Key words: sarcoidosis, interleukin-2 receptor ƒ¿,
reverse transcription-polymerase chain reaction, alveolar lymphocyte, Propionibacterium acnes
緒 言
サ ル コ イ ドー シ ス(サ 症)は 未 だ 原 因 不 明 の 疾
患 で あ る が,気 管 支 肺 胞 洗 浄
法(bron-choalveolar lavage; BAL)の 進 歩 と,こ れ に
よ り得 ら れ た 細 胞 等 の 免 疫 学 的 研 究 に よ り,そ の 病 態 は し だ い に 明 らか に さ れ つ つ あ る1,2).サ
症 患 者 の 肺 局 所 で はTリ ン パ 球,特 にhelper
T-cellが 増 加 し,組 織 学 的 に はT-cell alveolitis
よ り非 乾 酪 性 類 上 皮 細 胞 肉芽 腫 形 成 へ と進 展 し, サ 症 の 病 巣 形 成 に はTリ ン パ 球 が 中 心 的 な 役 割 を は た し て い る と考 え られ て い る3,4).こ れ らT リ ン パ 球 の 増 殖 に はInterleukin-2(IL-2)の 分 泌 と,細 胞 表 面 へ のInterleukin-2 receptor (IL-2R)の 発 現 が 必 要 と さ れ て い る5).今 回 著 者 はBALに よ り得 ら れ た 肺 胞 リ ンパ 球 をreverse
transcription-polymerase chain reaction
(RT-PCR法)を 用 い てIL-2Rα(p55)mRNA
の 発 現 を分 子 生 物 学 的 に 検 討 し た6,7,8).更に 本 症 病 巣 よ り高 頻 度 に 検 出 さ れ るPropionibacter
ium acnes(P. acnes)9)の 肺 胞 リ ン パ 球IL-2R
α mRNAの 発 現 へ の 関 与 に つ い て も検 討 し た. 対 象 と 方 法 1.対 象 対 象 は 未 治 療 サ 症 患 者8例,う ち 男 性3例, 女 性5例 で,年 齢 は23歳 か ら54歳 で あ っ た(Table 1).胸 部X線 病 期 は, I期6例, II期2例 で, 喫 煙 者 は3例 で あ っ た. 7例 が 経 気 管 支 的 肺 生 検 に よ り組 織 学 的 に サ 症 と 診 断 さ れ,残 りの1 例 は 臨 床 的 に サ 症 と診 断 し た, PPD皮 内 反 応 は 6例 が 陰 性,血 清 ア ン ギ オ テ ン シ ン 変 換 酵 素 (ACE)は8例 中5例 が 高 値 を示 し,平 均26.6± 7.8IU/Lで,血 清 リ ゾ チ ー ム 活 性 は 検 査 を行 っ た6例 全 例 が 高 値 を 示 し,平 均19.9±7.4μg/ml と上 昇 し て い た.対 照 と して 健 常 人5例 にBAL を 施 行 し た. 2.方 法 BALは 右 中 葉 気 管 支 に 気 管 支 鏡 を楔 入 し,生 理 食 塩 水50mlに よ る 洗 浄 を4回 繰 り返 し,合 計 200mlに て 洗 浄 を 行 っ た.得 ら れ た 有 核 細 胞 は RPMI 1640で 洗 浄 し た の ち プ ラ ス チ ッ ク シ ャ ー レ 中 で 反 応 後,付 着 細 胞 を 除 去 し,非 付 着 細 胞 を リ ン パ 球 分 画 と して 採 取 し た.採 取 し た リ ン パ 球 は リ ン酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(PBS)で 洗 浄 し た の ち3×105個 を用 い て, Kawasakiら の 方 法 に 従 っ てcytoplasmic RNAを 抽 出 し た8).す な わ ち0.5% Nonidet P-40, 10mM Tris-HCl (pH8.0),10mM NaCl, 3mM MgCl2, 0.1%
Diethylpolycarbonateを 含 むisotonic high-pH
buffer 100μl中 で 細 胞 膜 を融 解 し, 12,000G,
4℃, 2分 間,遠 沈 し て 核 を 分 離 し,さ ら に 上
清 を90℃, 5分 間 加 熱 し た 後,蛋 白 を 遠 沈 除 去
し てcytoplasmic RNAを 抽 出 し た.得 ら れ た
Table 1 Patients characteristics
* Angiotensin converting enzyme
Amplified
Molecule DNA size Primer sequences and primer location
Fig. 1 Primer sequences for amplification of IL-2R ƒ¿ and ƒÀ actin.
cytoplasmic RNAに50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH8.3), 4mM MgCl2, 1mM dATP
(Takara), 1mM dGTP(Takara), 1mM dCTP(Takara), 1mM dTTP(Takara), 2.5μM random hexamer(Takara), placental RNase inhibitor(Takara)(1u/μl), reverse
transcriptase(RAV-2, Takara)(0.3u/μl) を 加 え42℃, 1時 間 反 応 さ せ, cDNAを 合 成 し た. 95℃, 5分 間 加 熱 す る こ と に よ り 逆 転 写 酵 素 を 不 活 化 し た の ち, cDNA溶 液 を そ の ま ま 用 い てPCRを 行 っ た。 合 成 し たcDNA溶 液20 μlに そ れ ぞ れFig. 1に 示 す5'primer 50 pmoles, 3'primer 50pmoleとTaq DNA polymerase(Perkin Elmer Cetus)3uを 加 え, denatureを95℃ に て1分 間, annearingを55℃
に て1分 間, extendingを72℃ に て3分 間 行 い, こ れ を1 cycleと し て 計35cycleのPCRを 行 っ
た.最 後 に ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 に よ りPCR産 物
を得 た. IL-2R α primerと して, 2種 類 のprimer
を用 い た(Fig. 1). 1つ はCLONTECH Labo
ratories社 製 で, 5'側 はexon 4内 の25 base
が, 3'側 がexon 8か らexon 7内 の24 base
が 設 定 さ れ,塩 基 配 列 に よ り398 baseのcDNA
が 増 幅 さ れ る.も う1つ はDNA合 成 機(Applied
Biosystem)を 用 い て 作 製 し たprimerで, exon
1に 含 ま れ る20 baseと, exon 7内 の20 base
で, PCRに よ り777 baseのcDNAが 増 幅 さ れ る よ う に 塩 基 配 列 を 選 択 した.ま た 内 部 対 照 と し て β actinのmRNAを 検 出 す る た め, 319 baseのcDNAが 増 幅 さ れ る よ う なprimerも 合 成 し た(Fig. 1). PCR産 物 は1%ア ガ ロー ス ゲ ル 中(FMC)で 電 気 泳 動 し た 後,エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドで 発 色 した.電 気 泳 動 し た ア ガ ロ
を 用 い てGene screen plus(DuPont)に 転 写
した.転 写 後 α 32P dCTP(ICN)を 用 い, 32P
で 標 識 し たIL-2R α exon 4(320 base: Oncor)
と β actin(770 base: Oncor)をprobeと して
Southern blot法 に よ りhybridizationを 行 っ
た. Membraneは 洗 浄 し た 後, autoradiography
を24時 間 行 い 得 ら れ た シ グ ナ ル
をphotoden-sitometer(FAST SCAN; Molecular
Dynamics)に て 測 定 し, mRNAの 相 対 的 な 発
現 量 を 比 較 し た.ま た 採 取 し た サ 症 肺 胞 リ ン パ
球 の 一 部 を そ れ ぞ れ 同 一 条 下 で 無 刺 激 群, P.
acnes PER(Propionibacterium acnes
pyridine extract residue)5μg/ml添 加 群,
PHA(Phytohemagglutinin P; BACTO)10 μg/ml添 加 群 に 分 け た 後, 12時 間 培 養 し,同 様 にIL-2Rα(p55)mRNAの 発 現 を検 討 し た. 結 果 1.気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 細 胞 成 分 サ 症8例 で はBALに よ り27.1±13.2×106個 の 有 核 細 胞 が 得 ら れ た.有 核 細 胞 の う ち リ ンパ 球 比 率 は28.6±20.3%と 健 常 人 に 比 し 著 明 に 増 加 し て い た.リ ン パ 球 サ ブ セ ッ トを み る とCD4 陽 性 リ ン パ 球 の 増 加 が 認 め ら れ, CD4/CD8は 8.53±4.86と 高 値 を 示 し て い た.健 常 人 で は 26.6±23.1×106個 の 有 核 細 胞 が 得 ら れ,リ ン パ 球 比 率 は6.6±3.6%で あ っ た(Table 2). 2. MT-1細 胞 に お け るIL-2R α mRNAの 検 出 IL-2R α を 恒 常 的 に 発 現 し て い るHTLV-1感 染 細 胞 株MT-1を 用 い てRT-PCR法 に よ りIL-2R α mRNAの 検 出 が で き る か 否 か に つ い て 検 討 し た. MT-1細 胞 の 細 胞 濃 度 希 釈 系 列 を 作 り, 398 baseのcDNAが 増 幅 さ れ るIL-2R α
primerと β actin primerを 用 い てRT-PCRを
行 っ た.ア ガ ロー ゲ ル 上 の バ ン ドとSouthern blot 法 でhybridizationし た 結 果 を 比 較 す る と,ア ガ ロ ー ス ゲ ル 上 の398 baseの バ ン ドに 一 致 し て hybridizationし,細 胞 数 に 比 例 し てmRNAの 発 現 の 増 加 が 認 め ら れ た(Fig. 2).し か し,陰 性 対 照 と し て 用 い たK-562細 胞 に は 発 現 が 認 め られ な か っ た.ま た 逆 転 写 反 応 を行 わ な か っ た 場 合 も シ グ ナ ル は 認 め られ ず, genomic DNAの 混 入 で な い こ と も確 認 さ れ た.ア ガ ロー ス ゲ ル 上 の バ ン ドはIL-2R α mRNA由 来 で あ り,発 現 陽 性 細 胞 数 とIL-2R α mRNA発 現 量 に 正 の 相 関 が 認 め ら れ た こ と よ り,本 法 に よ り同 一 条 件 下 でmRNAの 発 現 量 の 比 較 が 可 能 と考 え ら れ た.
Table 2 Cellular components of bronchoalveolar lavage fluid from patients with pulmonary sarcoidosis
Fig. 2 IL-2R ƒ¿ and ƒÀ actin gene expression of MT1 cells using RT-PCR. The intensities of IL-2R ƒ¿ gene expression were closely correlated to the cell numbers applied to RT-PCR.
Fig. 3 IL-2R ƒ¿ gene and ƒÀ actin gene expres sion of lymphocytes recovered from BALF of Case. 2 using RT-PCR.
3.ヒ ト肺 胞 リ ンパ 球 に お け るIL-2R α mRNA の 発 現 症 例2の 肺 胞 リ ン パ 球 を 用 い てIL-2R α mRNAの 発 現 をRT-PCRで 検 討 し た.ア ガ ロ ー ス ゲ ル 中 で,エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドに て 発 色 さ せ る と,用 い た2種 のIL-2R α primerに 対 応 して398 baseと777 baseの 部 位 に バ ン ドが 認 め ら れ た. Southrn blot法 を行 う と,ア ガ ロ ー ス ゲ ル 上 に 認 め ら れ た バ ン ドに 一 致 し て , IL-2R α mRNAの 発 現 が 認 め ら れ た.ま た 内 部 対
照 と し て 用 い た β actin primerも319 baseの
部 位 に 一 致 し て バ ン ドが 認 め られ た(Fig. 3). 本 法 に よ りサ 症 肺 胞 リンパ 球 はIL-2R α mRNA を 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れ た. BALに よ り 得 ら れ る 細 胞 数,特 に リ ン パ 球 数 に は 限 度 は あ る もの の, RT-PCR法 を 用 い れ ば 限 ら れ た 細 胞 数 で あ っ て も, mRNA発 現 の 検 討 が 可 能 と考 え ら れ た. 4.サ ル コ イ ドー シ ス 患 者 肺 胞 リ ン パ 球 に お け るIL-2R α mRNAの 発 現 8例 の サ 症 患 者 肺 胞 リ ンパ 球 を用 い て398 base のprimerに よ るRT-PCRを 行 っ た と こ ろ, mRNAの シ グナ ル の 発 現 強 度 に 差 は あ る もの の, 8例 全 例 にIL-2R α mRNAの 発 現 が 認 め ら れ た.し か し 対 照 健 常 人 は 同 数 の 肺 胞 リ ン パ 球 を 用 い て も発 現 は 認 め ら れ な か っ た(Fig. 4).β actinは サ 症 患 者,対 照 健 常 人 の い ず れ に も認 め ら れ た.即 ち 対 象 サ 症 患 者8例 と対 照 健 常 人5 例 の 肺 胞 リ ンパ 球 のIL-2R α mRNAの 発 現 は, サ 症 で は8例 全 例 にIL-2R α mRNA由 来
cDNA(398 base, 777 base)の 発 現 が 認 め ら れ
た が,健 常 人 で は5例 と も そ の 発 現 は 認 め られ
な か っ た(Table 3).な お 内 部 対 照 と し て 用 い
た β actinは サ 症 患 者,対 照 健 常 人 と も に 発 現
が 認 め ら れ,サ 症 患 者 に お い て は 健 常 人 に 比 し
Fig. 4 IL-2R ƒ¿ gene expression of lymphocytes recovered from BALF using RT-PCR. Southern blot analysis shows that patients with pulmonary sarcoidosis had increased expression of IL-2R ƒ¿ mRNA compared with healthy individuals.
Table 3 Gene expression for IL-2R ƒ¿ mRNA (777b and 398b) in Southern blot analy sis followed by RT-PCR of pulmonary sarcoidosis and healthy individuals
+: Expression was positive in Southern blot
analysis follwed by RT-PCR
-: Expression was negative
ND: Assay was not done
認 め られ た.
5.サ ル コ イ ドー シ ス 患 者 肺 胞 リ ン パ 球 に お け
るP. acnes刺 激, PHA刺 激 に よ るIL-2R
α mRNAの 発 現
サ 症 患 者 肺 胞 リ ン パ 球 で は,す で にIL-2R α
mRNAの 発 現 が 亢 進 して い る こ とが 認 め られ た
が,刺 激 に よ る 発 現 の 違 い を 比 較 す る た め サ 症
Fig. 5 IL-2R ƒ¿ gene and ƒÀ actin gene expression using RT-PCR of alveolar lymphocytes of case 6 incubated with PHA, P. acnes and stimulant for 12 hours.
患 者8例 中6例 で, RPMI 1640の み の 無 刺 激 群,
P. acnes PER 5μg/ml添 加 群, PHA10μg/ml
添 加 群 の3群 に 分 け12時 間 培 養 し た の ちcyto
plasmic RNAを 抽 出 し, RT-PCRを 行 いIL-2
R α(398 base)お よ び β actin mRNA由 来 の
cDNAを 増 幅 し電 気 泳 動,転 写 後, Southern
blot法 を行 い, photodensitometerに て 測 定 し
相 対 的 な 発 現 量 を 比 較 し た.症 例6に お け
るIL-2R α mRNAお よ び β actin mRNAの 発 現 を
Fig. 5に 示 し た.ま た こ れ ら6症 例 に お け るP .
acnes, PHA刺 激 時 のIL-2R α mRNAの 発 現
をphotodensitometerに て 測 定 し て,無 刺 激 時 と の 相 対 的 発 現 量 を 比 較 し た. そ の 結 果 無 刺 激 時 を1.0と した 場 合, P. acnes 刺 激 で は223±1.46と な り6例 中5例 で 発 現 が 増 加 し, PHA刺 激 で は2.14±0.61と4例 全 例 で 増 加 が 認 め ら れ た. P. acnes刺 激 した 場 合, PHA 刺 激 し た 場 合 と 同 程 度 の 発 現 の 増 強 が 認 め ら れ た(Fig. 6). 考 察 サ 症 は 原 因 不 明 の 全 身 性 肉 芽 腫 性 疾 患 で あ る.
Fig. 6 Relative intensity of IL-2R ƒ¿ gene expression of lymphocytes from patients with pulmonary sarcoidosis after 12 hours incubation with PHA, P. acnes and no stimulant.
そ の 多 く に 肺 病 変 の 合 併 が 認 め ら れ,肺 局 所 で
は リ ン パ 球,特 にhelper T-cellが 増 加 し, T-cell
alveolitisを 経 て 類 上 皮 細 胞 肉 芽 腫 形 成 に 至 る と 考 え ら れ て い る2,3,4).これ らT細 胞 の 増 殖 に は, IL-2の 産 生,分 泌 亢 進 と リ ンパ 球 表 面 へ のIL-2Rの 増 加 が 必 要 と さ れ て い る5).活 性 化T細 胞 表 面 に は 高 親 和 性 お よび 低 親 和 性IL-2Rが 検 出 さ れ る が,高 親 和 性IL-2Rは, IL-2R α(p55, Taq抗 原)な ら び にIL-2Rβ(p70-55)が 非 共 有 結 合 性 に 会 合 し て 形 成 さ れ るヘ テ ロ ダ イ マ ー と考 え ら れ,α 鎖 の 発 現 が β鎖 に 比 べ は る か に 多 い た め β鎖 と会 合 し な か っ た α鎖 そ の も の が 低 親 和 性IL-2Rと し て 検 出 さ れ る. IL-2R α の 発 現 はT細 胞 活 性 化 刺 激 に 依 存 し,高 親 和 性IL-2R 形 成 のon/offス イ ッ チ と し て 機 能 し, IL-2R β は 構 成 的 に 発 現 しIL-2に 対 す る 増 殖 シ グナ ル の 伝 達 を 担 っ て い る と推 定 さ れ て い る10).こ の よ う にIL-2R α はT細 胞 が 活 性 化 し増 殖 す る場 合 重 要 な 役 割 を は た し て い る.著 者 ら は こ れ ま で サ 症 肺 胞 リ ン パ 球 のIL-2産 生,分 泌 が 亢 進 し,さ ら にIL-2Rの 発 現 も亢 進 して い る こ と を報 告 し て き た11).こ れ らの 現 象 が 細 胞 内 に お い て い か な る段 階 で の 亢 進 か を検 討 す る た めIL-2R α に 注 目 し, mRNAの 発 現 を 分 子 生 物 学 的 に検 討 した. 細 胞 内 のmRNAの 発 現 を 見 る に は 一 般 に Northern blot法 が 行 な わ れ て き た12,13)が,近 年 PCRを 用 い て 微 量 のDNAを 検 出 す る 方 法 が 開 発 さ れ,さ ま ざ ま な 分 野 で 応 用 が な さ れ る よ うに な っ た7).さ ら に 逆 転 写 酵 素 を 用 いmRNA を 鋳 型 と し てcDNAに 変 換 し た の ち, PCRに よ り増 幅 させ る 方 法(RT-PCR法)が 提 唱 さ れ た14).本 法 を用 い れば,少 な いサ ンプ ル か らmRNA の 発 現 を検 出 可 能 で あ る と考 え,気 管 支 肺 胞 洗 浄 に よ り得 られ た 肺 胞 リ ン パ 球 か らIL-2R α mRNAの 検 出 を 試 み た. RT-PCRを 行 う場 合
もtotal RNA,さ ら に はmRNAに ま で 精 製 し
て 行 う の が 一 般 的 で あ る が,本 実 験 で はNP-40
に よ り細 胞 膜 を 融 解 してcytoplasmic RNAを
取 り 出 し,逆 転 写 酵 素 に よ りmRNAを 直 接
cDNAに 変 換 し,こ のcDNAをIL-2R α primer
を用 い てPCRに よ り 目 的 のDNAを 増 幅 さ せ た.そ し てRT-PCR法 に よ れ ばBALF中 リ ン パ 球IL-2Rα mRNAの 検 出 が 十 分 行 え る こ と が 確 認 で き た. 本 法 で は2回 の 酵 素 反 応 を 行 い 増 幅 さ せ,ま た 用 い た 材 料 も 培 養 細 胞 な ど に 比 較 し て 不 均 一 な た め,発 現 の 定 量 性 に は 問 題 が 残 る.最 近 の RT-PCR法 に お け るmRNAの 定 量 に 関 して も, 相 対 的 定 量 に よ る 比 較 が 試 み ら れ て い る が,諸 家 の 報 告 は さ ま ざ ま で あ る15,16).今回 は 内 部 対 照 と して β actin mRNAの 検 出 を 同 時 に 行 い, こ れ ら を 比 較 す る こ と に よ り, IL-2R α mRNA の バ ン ドが 検 出 さ れ な か っ た 場 合 の 反 応 の 良 否 を 決 定 した. サ 症 患 者 お よ び 対 照 健 常 人 に 気 管 支 肺 胞 洗 浄 を 行 い,得 られ た 肺 胞 リ ンパ 球 を 用 い てRT-PCR 法 に よ りIL-2R α mRNAの 発 現 の 検 討 を 行 っ た と こ ろ,サ 症 患 者8例 全 例 に 発 現 が 認 め られ た が 対 照 健 常 人5例 に は 認 め ら れ な か っ た.理 論 的 に は 対 照 健 常 人 で もIL-2R α mRNAは 量 的 に 少 な く て も 存 在 して い る と考 え ら れ る が 本 法 で は 検 出 で き な か っ た.ま た 内 部 対 照 と し て 用 い た β actinは サ 症 患 者,対 照 健 常 人 の い ず れ に も 認 め ら れ て お り,サ 症 肺 胞 リ ン パ 球 で は spontaneousにIL-2R α mRNAが 発 現 し て い る こ とが 確 認 で き た. Muller-Quernheimら13)も
Northern blot法 に よ り,サ 症 肺 胞 リ ン パ 球 に IL-2R α mRNAがspontaneousに 発 現 し て い る こ と を 報 告 し て お り,さ ら にKonishiら12)は サ 症 末 梢 血 の リ ン パ 球 に もIL-2R α mRNAが spontaneousに 発 現 して い る こ と を 認 め て い る. 活 動 期 サ 症 で は, IL-2R α mRNAを 有 す る リ ン パ 球 が 肺 局 所 よ り末 梢 血 に 移 行 し,さ ら に 肺 に 再 び 戻 っ てIL-2に よ り,更 に 増 殖 し て い る可 能 性 が あ る12). 今 回 検 討 し た サ 症8例 は,い ず れ も 肺 胞 リン パ 球 のCD 4/CD 8が 高 値 の 症 例 で 活 動 期 と考 え ら れ る症 例 で あ る.活 動 期 サ 症 の 肺 胞 リ ンパ 球,特 にCD 4陽 性Tリ ンパ 球 は 非 刺 激 下 で もIL-2を 産 生 し て い る こ と が 報 告 さ れ て お り17),その 結 果autocrineにIL-2R陽 性 細 胞 が 増 殖 し て い る と考 え ら れ る.こ れ ら の こ と は, soluble IL-2Rが 肺 局 所 に 増 加 して い る こ とか ら も裏 付 け ら れ る18,19). IL-2R分 子 を構 成 す る サ ブ ユ ニ ッ トの な か で も, IL-2R α の 発 現 は 抗 原 な どT細 胞 活 性 化 刺 激 に 依 存 し,迅 速 か つ 一 過 性 に 発 現 し高 親 和 性 IL-2Rを 形 成 し機 能 す るこ とが 知 られ て い る10,20). 今 回 の サ 症 肺 胞 リン パ 球 の 増 加 とIL-2R α の mRNAレ ベ ル で の 発 現 の 増 強 は,何 ら か の 外 的 刺 激 を 受 け て 肺 胞 リン パ 球 が 活 性 化 さ れ る こ と が 推 察 さ れ る. サ 症 の 病 因 は 不 明 で あ る が,あ る種 の 細 菌, ウ イ ル ス な ど に よ る外 的 病 因 説 が あ る.本 間 ら を 中 心 と した 文 部 省 サ ル コ イ ドー シ ス 研 究 班 は サ ル コ イ ドー シ ス 病 巣 か ら 細 菌 の 分 離 培 養 を行 い,高 頻 度 か つ 高 濃 度 にP. acnesを 分 離 しサ 症 病 態 へ の 関 与 を推 察 し て い る9).こ の 嫌 気 性 細 菌 は 生 体 常 在 菌 で 細 胞 壁 に ミ コ ー ル 酸 を有 し, ア ジ ュ バ ン ド活 性 を示 す こ とが 知 ら れ て お り, サ 症 免 疫 機 構 に お い て 有 力 な 感 作 抗 原 と し て 想 定 さ れ て い る21).中 田 ら は 未 治 療 サ 症 の 肺 胞 リ ン パ 球 にP . acnes PERを 混 合 培 養 す る と リ ン パ 球 の 幼 若 化 が 亢 進 す る こ と を報 告 して い る22,23). 更 に 著 者 ら は サ 症 肺 胞 リン パ 球 はP. acnes刺 激 に よ りIL-2の 産 生 分 泌 が 亢 進 さ れ11),リ ン パ 球 増 殖 反 応 が 亢 進 す る こ と を認 め22),本 症 の 病 態 へ のP. acnesの 関 与 を 報 告 し て き た.ま た モ ル モ ッ トにP. acnesを 経 気 道 的 感 作 す る こ と に よ り,肺 肉 芽 腫 症 を 作 製 す る こ とが で き,本 動 物 実 験 で も ヒ トサ 症 と 同 様 にBAL液 中 に リ ン パ 球 が 増 加 しIL-2産 生 の 亢 進 す る こ とか らサ 症 の 病 因 と し て の 可 能 性 を示 唆 して い る24).そ し て 今 回 の 検 討 で,肺 胞 リ ン パ 球 は す で にmRNA の レベ ル で 活 性 化 さ れ て い る こ とが 明 ら か に な っ た.更 にP. acnes, PHA刺 激 で 肺 胞 リ ン パ 球 を 培 養 し た 後RT-PCRを 用 いIL-2R α mRNAの 相 対 的 な 発 現 量 を 比 較 し た が,そ の 結 果PHA刺 激 に よ っ て 肺 胞 リ ン パ 球 が 活 性 化 さ れ る の と 同 様 にP. acnes刺 激 に よ っ て も サ 症 肺 胞 リ ンパ 球 は 活 性 化 さ れIL-2R α mRNAの 発 現 は 無 刺 激 時 よ り さ ら に 増 強 す る こ とが 判 明 し た.す な わ ち,サ 症 患 者 で はP. acnesが 経 気 道 的 に 抗 原 刺 激 と な り肺 胞 リ ン パ 球 を 活 性 化 しIL-2R mRNAレ ベ ル で の 発 現 が 増 強 して い る 可 能 性 が 推 察 さ れ た. し か し, P. acnesは ヒ トに お い て は 常 在 菌 で あ り,一 方 サ 症 発 症 の 頻 度 は き わ め て 低 い こ と か ら 内 的 免 疫 異 常 の 関 与 が 考 え ら れ る.サ 症 患 者 で は 病 因 物 質 と な り う る抗 原 刺 激 に 暴 露 さ れ,さ らに 免 疫 応 答 の 異 常 が あ っ て は じめ てIL-2の 産 生, IL-2Rの 発 現 が お こ りT細 胞 の 増 殖 を 引 き起 こ し,一 連 の サ 症 の 病 態 を 形 成 して い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る. こ の よ う に 遺 伝 子 レ ベ ル で の 解 明 は サ 症 発 症 の 原 因 物 質 へ 一 歩 近 づ け る も の と考 え ら れ, P. acnesと 他 の サ イ トカ イ ン のmRNAへ の 関 与 に つ い て も検 討 中 で あ る. 結 論 サ 症 患 者 肺 胞 リン パ 球 に お け るIL-2R α(p55) mRNAの 発 現 をRT-PCRを 用 い て 検 討 した. さ らにP. acnes刺 激 に よ る 発 現 強 度 の 比 較 も 試 み 以 下 の 成 績 を得 た. 1. IL-2R α を 恒 常 的 に 発 現 し て い るMT-1 を 用 い て,実 験 に 用 い た 細 胞 数 とRT-PCR法 に よ るIL-2R α mRNAの 発 現 強 度 を 比 較 し た. こ の 結 果,細 胞 数 に 比 例 し てmRNAの 発 現 が 認 め ら れ,本 法 に よ れ ば 同 一 条 件 下 でmRNAの 発 現 量 の 比 較 が 可 能 と考 え ら れ た. 2.サ 症 患 者8例 と健 常 者5例 でRT-PCR法 に よ り気 管 支 肺 胞 洗 浄 に よ り得 ら れ た 肺 胞 リ ン
パ 球 のIL-2R α mRNAの 発 現 を 検 討 し た と こ ろ,サ 症 患 者 で はIL-2R α mRNAの 発 現 は 検 討 し た8例 全 例 に 認 め ら れ た が,健 常 者5例 で は 認 め ら れ ず,サ 症 患 者 肺 胞 リ ン パ 球IL-2R α はmRNAレ ベ ル で 活 性 化 さ れ て い る こ と が 判 明 し た. 3.サ 症 患 者 肺 胞 リ ン パ 球 をP. acnes添 加 培 養 す る と, IL-2R α mRNAの 発 現 の 増 強 が 認 め ら れ, P. acnesの サ 症 病 態 へ の 関 与 が 窺 わ れ た. 以 上 よ り活 動 期 サ 症 肺 局 所 で は リ ン パ 球 が 活 性 化 さ れ て お り, T-cell alveolitisを 来 た し, さ ら に は 類 上 皮 細 胞 肉 芽 腫 へ と 進 展 し て い く と 考 え ら れ た. 本 論 文 を擱 筆 す る に あ た り,御 懇 篤 な る御 指 導 な らび に 御 校 閲 を賜 っ た恩 師 木 村 郁 郎 教 授 に 深 甚 の 謝 意 を表 し ま す.ま た,終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 を 賜 っ た 片 岡幹 男 講 師,大 熨 泰 亮 助 教 授,医 療 短 期 大 学 部 中 田安 成 教 授 に 深 謝 し ます.
文
献
1) The BAL Cooperative
Group Steering Committee:
Bronchoalveolar
lavage constituents
in healthy
individuals,
idiopathic pulmonary fibrosis, and selected comparison group. Am Rev Respir Dis (1990)
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2) 長 井 苑 子:サ ル コイ ドー シ スの 臨 床 と検 査 所 見; BALF所 見-病 態 生 理 学 的考 察.最 新 医 学(1988)43,
1507-1515.
3) Huminghake
GW and Crystal RG: Pulmonary
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A disorder mediated
by excess helper
T-lymphocyte
activity at sites of disease activity. N Engl J Med (1981) 35, 429-434.
4) Thomas
PD and Hunninghake
GW: State of art;
Current concepts
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of patients with sarcoidosis
Hiroshi NISHIZAKI
Second Department of Internal Medicine,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. I. Kimura)
T-lymphocytosis was detected in bronchoalveolar lavage fluid of patients with sarcoidosis. To clarify the mechanism of this phenomenon, interleukin-2 receptor (IL-2R) ƒ¿ gene expres sion of lymphocytes recovered from bronchoalveolar lavage fluid was investigated in 8 patients with sarcoidosis and 5 healthy individuals, using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Cytoplasmic RNA derived from alveolar lymphocytes was reverse transcribed by RAV-2 reverse transcriptase to cDNA. The cDNA produced by reverse transcription was subjected to PCR. The primers of IL-2R ƒ¿ were utilized and a template derived from IL-2R mRNA was amplified by PCR. Southern blot analysis using 32P labeled cDNA probe for IL-2R ƒ¿ was performed followed by PCR. The intensities of IL-2R mRNA expression in Southern blot analysis were closely correlated to the cell numbers determined in RT-PCR.
All patients with sarcoidosis had higher expression of IL-2R ƒ¿ mRNA transcript in alveolar lymphocytes compared with healthy individuals. Moreover, the expression increased after stimulation by Propionibacterium acnes in 5 of 6 patients with sarcoidosis.
These findings suggest that alveolar T-lymphocytes in the patients with sarcoidosis were activated and played a central role in the pathogenesis of sarcoidosis.
