マウス卵成熟過程におけるAktの発現,局在およびその機能に関する研究

マウス卵成熟過程におけるAktの発現,局在およびそ

の機能に関する研究

著者

星野 由美

号

858

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16065

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年月 日

学位授与の要件

研 究 科 専 攻

学 位 論 文 題 目

論 文 審 査 委 員

ほ し の ゆ み 星 野 由 美 博 士(農 学) 農 博 第858号 平 成18年3.月24日 学 位 規 則 第4条 第1項 該 当 農 学研 究科 応用 生命 科 学専攻 (博 士課程) マ ウス卵 成 熟 過 程 にお け るAktの 発 現,局 在 お よび そ の 機 能 に関す る研 究 (主 査)教 授 佐 藤 (副 査)教 授 西 田 教 授 内 田 助 教授 佐 々 田

英

明

朗

隆

史

比 呂志

論

文

内

容

要

旨

1.緒 言 多 くの哺 乳 動 物 にお い て,雌 性 生殖 細 胞 で あ る 卵 母 細 胞 は 卵 巣 内 で第 一 減 数 分 裂 前 期 の卵 核 胞 期(GV)で 停 止 して い る が,ゴ ナ ド トロ ピ ンの刺 激 によ り減 数 分 裂 を再 開 し卵 核 胞崩 壊(GVBD)を 引 き起 こす 。そ の後,卵 母 細 胞 は第 一 減 数 分 裂 中期(MI)を 経 て 第1極 体 を放 出 し第 二 減 数 分 裂 中期(MII)で 再停 止 し, 成 熟 卵 母 細 胞 とな る 。 一 般 に,こ の よ うな 第 一 減 数 分 裂 前 期 で 停 止 した 卵 母 細 胞 が 減 数 分 裂 を 再 開 し第 二 減 数 分 裂 中期 に いた る過 程 を 「卵 成 熟 」 と定 義 して い る。 現 在,卵 母 細 胞 を体 外 で 卵 成 熟 させ る技 術 は産 業 動 物 の改 良 ・増 殖 へ 貢 献 す る重 要 な もの と して 世 界 的 に広 く利 用 され て い る 。 す な わ ち,こ の 技 術 は 卵 巣 で 数 十 万個 生 産 され る も の の,そ の大 多 数 は卵 胞 発 育 過 程 で死 滅 す る卵 母 細 胞 の救 助 を可 能 にす る も ので あ り,卵 成 熟 させ た卵 子 を体 外 で 受 精 させ 発 生 培 養 し移 植 可 能 な胚 を生産 す る,い わ ゆ るIVMFCま た はIVPの 技術 の一 つ と して 開 発 さ れ て い る。 しか しな が ら,体 外 で 卵 成 熟 さ せ た 卵 子 に は産 子 へ の 発 生 能 が 低 いな どの 問題 点 が多 く残 され て いる 。 そ の 一 因 と して,卵 成 熟 を制 御 す る 機 構 に つ いて,魚 類,両 生 類 や ヒ トデ と い っ た 下 等 動 物 で研 究 が盛 ん に行 わ れ,卵 成 熟 促 進 因子(MPF)の 発 見,MAP キ ナ ーゼ(MAPK)の 活 性 化 や 減 数 分 裂 再 開 に お け るcAMP濃 度 低 下 な どの 制 御 因 子 の 知 見 が 報 告 され て いる もの の,哺 乳 動 物 の 卵 成 熟 機 構 の 詳 細 が未 だ 明 らか にな っ て いな い こ とが あ げ られ る 。 した が って,こ の 卵 成 熟 機 構 を 明 らか にす る こ とは,高 い発 生 能 力 の あ る胚 を体 外 で 生産 す る技 術 を 確 立 す る の み な' らず,ヒ トの 不 妊 治 療 とい った 補 助 生 殖 医 療 分 野 へ も貢 献 す る もの で あ る と考 え られ る。 以 上 の背 景 下,本 研 究 で は 哺 乳 動 物 にお け る卵 成 熟 に 関 わ る 分 子 を 明 らか に す る こ と を 目的 と し,マ ウス卵 成 熟 過程 に お け るAkt(proteinkinaseB)番 こつ い て,そ の意 義 を明 らか に しよ う と した 。 特 に,卵 成 熟 で は 染 色 体 数 が減 数 す る こ とが 必 要 で あ り,GV期 か らMII期 ま で の進 行 過 程 で 染 色 体 の 整 列 や 紡 錘 体 形 成 な どの 細 胞 骨 格 系 が 関 与 す る現 象 が 観 察 され るが,現 在 まで の と ころ, これ らを 制御 す る分 子 機 構 は 明 らか に され て いな い。 最 近,細 胞 骨 格 系 の構 築 に関 わ る シグ ナ ル伝 達 にphosphatidylinosito1-3-OH-kinase(PI3K)が 重 要 で

ある こ とが 明 らか に され,こ のPI3Kの 下 流 にAktが 存 在 し,PI3K/Aktが 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 一 つ と して細 胞 の 生 存 や 増 殖 に 中心 的 な 役 割 を果 た し

て い る こ とが 示 され た 。 さ らに,ご く最 近,Aktは 魚 類 や 両 生 類 に お け る 卵 成

熟 で の研究 で卵 成 熟 に関 与 す る上 流 の 因子 で あ る 証拠 が報 告 され て い る。

そ こで 本研 究 で は,ま ず 卵 成 熟 過程 にお け るAktの 発 現,PI3K/Akt経 路 の

存 在 とAktの 役 割 を調 べ,次 にGv期 か らMII期 進 行 にお け る活 性 型Aktの 役

割 を明 らか に し、 最後 に卵 成熟 過 程 にお け る リン酸型Aktの 役 割 につ い て検 索

した 。

2.卵 成:熟週程 におけ るA勧 の発 現,P昭K/A舵 経路 の存 在 とA撹 の役 訂

卵母細胞 におけるAktの 発現 と卵成熟過程 にお ける動態

卵 巣 よ り 採 取 し たGV期 の 卵 母 細 胞 を 体 外 で 成 熟 培 養 し 卵 成 熟 過 程 に お け る

Aktの 発 現 と そ の 局 在 に つ い て,ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト解 析 お よ び 免 疫 蛍 光 染 色

に よ り 調 べ た 。 そ の 結 果,GV,Pro-metaphaseI(PMI),MIお よ びMII期 ま

で の 卵 成 熟 各 過 程 に お い てAktの 発 現 は 同 レ ベ ル で 認 め ら れ た(Fig.1A)。 さ ら

に,AktはGV期 で 卵 細 胞 質 全 体 に 均 一 に 存 在 し,PMI期 で は 核 周 辺 に,MIお

よ びMII期 で は 紡 錘 体 の 位 置 に 存 在 し た(Fig.1B)。 こ の よ う なAktの 発 現 は 体

細 胞 分 裂 中 期(STO細 胞 お よ びHela細 胞)で は 認 め ら れ ず(Fig.2),減 数 分 裂

特 異 的 に 局 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。

次 に,Aktは2カ 所 の リ ン 酸 化 部 位(Thr308お よ びSer473)を 持 ち,こ れ

ら が リ ン 酸 化 す る こ と で 活 性 型 と な る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で リ ン 酸 型

Aktの 局 在 を 調 べ た 結 果,Thr308リ ン 酸 型AktはMIお よ びMII期 の 中 心 小 体

周 辺 物 質(PCM)に,一 方,Ser473リ ン 酸 型Aktは 紡 錘 体 に 局 在 す る こ と が わ

か っ た(Fig.3お よ びFig。4)。

PI3K/Akt経 路 の 存 在 とAktの 役 割

GV期 卵 母 細 胞 に お け るPI3Kの 発 現 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 に よ り 解 析 し た

と こ ろ,卵 丘 細 胞 お よ び 卵 母 細 胞 で 発 現 が 認 め ら れ た(Fig.5)。 そ こ で,卵 成 熟

卵 丘 細 胞 一卵 母 細 胞 複 合 体(COCs)を 培 養 し た 。そ の 結 果,GVBD率 お よ びMII 期 へ の 成 熟 率 はLY294002濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ た(Table1)。 ま た,卵 丘 細 胞 の 膨 化 も 抑 制 さ れ た(Fig.6)。 _{こ れ に 対 し,.裸 化 卵 母 細 胞 くDOs)をFF-MAS} 添 加 培 地 で 培 養 し た と こ ろ,LY294002添 加 に よ りMII期 へ の 成 熟 率 は 有 意 に 低 下 し た が,GVBD率 に 影 響 は み ら れ な か っ た(Table2)。 こ れ ら の 結 果 か ら, マ ウ ス 卵 成 熟 過 程 に お い てPI3Kが 発 現 しGVBDお よ びMII期 へ の 進 行 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 次 に,PI3K/Akt経 路 の 存 在 を 調 べ る た め にLY294002存 在 下 で18時 間 体 外 成 熟 培 養 を 行 い,キ ナ ー ゼ ア ッ セ イ に よ るAkt活 性 の 測 定 お よ び 免 疫 蛍 光 染 色

に よ る リ ン 酸 型Aktの 検 出 を 行 っ た 。そ の 結 果,LY294002添 加 区 に お い てAkt

活 性 は 有 意 に 低 下 し た(Fig.7)。 各 リ ン 型Aktの 局 在 を 調 べ た と こ ろ,阻 害 剤 添 加 に よ りThr308リ ン 酸 型AktはPMI期 以 降 で 検 出 さ れ ず,Ser473リ ン 酸 型AktはMI期 で 異 常 を 示 し,MII期 で は 検 出 さ れ な か っ た 。 さ ら に,卵 成 熟 過 程 に お け るAktの 役 割 を 調 べ る た め,Akt特 異 的 活 性 阻 害 剤(SH-6)存 在 下 でCOCsを18時 間 培 養 し た 。 そ の 結 果,卵 丘 膨 化 に 影 響 は み ら れ ずGVBD率 も 対 照 区 と 有 意 差 は な か っ た が,MII期 へ の 進 行 が 阻 害 さ れ た(Table3)。 免 疫 蛍 光 染 色 で 微 小 管 と 核 相 を 解 析 し た 結 果,SH-6添 加 区 で は 紡 錘 体 の 形 成 と 染 色 体 の 整 列 に 異 常 が 観 察 さ れ た(Fig.8)。 以 上,本 章 の結 果,マ ウス 卵 成 熟過 程 にお い てAktが 発 現 し減 数 分 裂 特 異 的 な 局在 を示 し,PI3K/Akt経 路 と して 役 割 を果 た して い る こ とが 明 らか とな っ た 。 3.GV期 一MI1期 進 行 に お け る 活 性 型Aktの 役 割 前 章 の結 果 か ら,マ ウス 卵 成 熟 過程 に お い てAktが 減 数分 裂 特 異 的 に紡 錘 体 の 位 置 に 局 在 す る こ と が わ か り,SH-6添 加 で 紡 錘 体 の 形 成 と染 色 体 の 整 列1ヒ異 常 が み られMII期 へ の進 行 が 阻 害 され る ことが 示 され た。 そ こで 本章 で は,GV 期 か らMI1期 ま での 卵成 熟 進 行 にお け るAktの 役割 をSH-6添 加 成 熟 培地 で 調 べ た。

GVBD,MIお よ びMII期 _{進 行 に 及 ぼ す 影 響 ,} 卵 成 熟 各 過 程 ま で に 要 す る 体 外 成 熟 時 間 を,GVBDとMI期 ま で を そ れ ぞ れ8 お よ び10時 間,MII期 ま で を18時 間 と し た 。 核 相 の 判 定 をPropidiumiodide 染 色 で 行 っ た 。 そ の 結 果,減 数 分 裂 再 開 に お い て 核 相 を 見 る とGVBDを 起 こ し て い た も の の,核 膜 の 消 失 が 不 完 全 で あ っ た(Fig.9)。 ま た,体 外 培 養 を10時 間 ま で 継 続 し て も 核 膜 の 一 部 が 残 存 し,正 常 な 紡 錘 体 を 形 成 で き ず,MI期 へ の 進 行 は 有 意 に 抑 制 さ れ た(Fig.10お よ びTable4)。 一 方,体 外 成 熟10時 間 以 降 でSH-6を 添 加 す る と 第1極 体 を 放 出 しMII期 へ は 進 行 し た が,形 成 さ れ た 紡 錘 体 の 形 態 は 丸 く 小 さ い も の で あ っ た(Table5お よ びFig.11)。 受 精 後 のAktの 挙 動 お よ び 第2極 体 放 出 に お け るAktの 役 割 受 精 後 の リン酸 型Aktの 挙 動 を調 べ るた め,体 外 受 精 させ た 卵 母 細胞 を免疫 蛍 光 染 色 した と ころ,Aktは 第2極 体 放 出 と と も に極 体 側 に移 行 し,前 核 形 成 期 以 降 卵細 胞 質 内 に は存 在 しな い ことが 明 らか とな った(Fig,12)。 さ らに,SH-6処 理 した成 熟 卵 子 の 受精 能 を判 定す る た め,体 外 受精 を行 い精 子 侵 入 お よ び第2極 体 の放 出 を観 察 した 。 そ の結 果,精 子 侵 入 は確 認 され た も の の,第2極 体 放 出は 有 意 に抑 制 され,減 数 分 裂 を正 常 に完 了 で き な い こ とが 示 され た(Table6)。 以 上,本 章 の 結 果,Aktは 減 数分 裂 再 開 にお いて 卵 核 胞 崩 壊 時 の 核 膜 消 失 に 関 与 して い る こ と,さ らに,減 数 分 裂 後 期 で はMII期 の紡 錘 体 形 成 ・維 持,さ らに受 精 後 の第2極 体放 出 に機 能 し減 数 分 裂完 了 に関 与 して い る こ とが明 らか とな った 。 また,受 精 後 リ ン酸 型Aktは 第2極 体放 出 と とも に卵 細 胞 質 か ら放 出 され 前 核 形 成 期 以 降発 現 しな い こ とか ら,減 数 分 裂 特 異 的 にAktが 機 能 して い る こ とが わか った 。 4.卵 成 熟 週 程 に お げ る リ ン 酸 型A短 の 役 割 一 般 に_{,体 細 胞 で はAktは2っ の リ ン酸 化 部 位 が リ ン酸 化 す る こ とに よ り活} 性 型 とな り機 能 を もつ こ とが知 られて い る。 しか しな が ら,本 研 究 の結 果 か ら,

卵 母 細胞 で はAktが 減 数分 裂 特 異 的 に紡 錘体 に局在 し,2つ の リン酸型Aktは 異 な る局在 性 を示 す こ とが 明 らか とな り,リ ン酸 型Aktは そ れぞ れ が独 立 して 機 能 して い る可 能 性 が 示 唆 され た 。 そ こで 本 章 で は,片 方 の リ ン酸 化 部位 の リ ン酸化 を阻 害す る ことで 他 方 の リ ン酸 型Akt9)機 能 を調 べ る方 法 を 用 い,卵 成 熟 にお け る2種 類 の リ ン酸 型Aktの 役 割 を調 べ た 。 MII'か に ぼ リ ン1Ak:tお よ び ペ プ チ"の 膨 リン酸 型Aktの 機 能 を阻害 す るた め に,リ ン酸 型Akt抗 体 あ る い は 阻害 ペ プ チ ドをマ イ ク ロイ ン ジ ェ ク シ ョ ン法 に よ り卵 細 胞 質 に 注 入 した 。 体 外 成 熟 培 養 後10時 間 にMI期 卵 母 細胞 に片 方 の リ ン酸 型 抗 体 あ る い は阻 害 ペ プチ ドを注入 し,も う一 方 の リン酸 型Aktを 免 疫 蛍光 染 色 によ り観 察 した 。そ の結 果,Thr308 ある い はSer473リ ン酸 型Aktを 阻害 した 卵 母細 胞 いず れ で も紡 錘 体 が 小 さ く 丸 くな る 傾 向 で あ っ たが,MII期 へ の進 行 は認 め られ,リ ン酸 型Aktが 検 出 さ れ た(Fig.13)。 これ らの結 果 は,減 数分 裂 期 にお い て は一 方 の リン酸 型Aktの み で も機 能 で き る可能 性 を示 した。 受 精 お よ び第2極 体 放 出 に及 ぼす リン酸 型Akt阻 害 の 影響 体外 成 熟 培養 後15時 間でMII期 卵 母 細 胞 に リ ン酸 型Akt抗 体 と阻害 ペ プチ ドをマ イ ク ロイ ンジ ェ ク シ ョ ン法 に よ り注 入 し,体 外 成熟 培 養 後18時 間 に体 外 受 精 を行 い,受 精 後 の 第2極 体 放 出お よ び前 核 形 成 を免 疫 蛍 光 染 色 に よ り観 察 した 。 そ の 結 果,Thr308リ ン酸 型Akt抗 体 あ る い は 阻害 ペ プ チ ドを注 入 した 場 合 、 第2極 体 が放 出 され た も の の,そ の後 卵 細 胞 質 内 で新 た な紡 錘 体 様 の も の が 構 築 さ れ,減 数 分裂 が 正 常 に完 了 で き な い こ とが わ か っ た 。一・方,Ser473 リ ン酸型Aktの リン酸化 を阻 害 す る と,第2極 体 の放 出が起 こ らな い ことが示 され た(Fig.14)。 以 上,本 章 の 結果,減 数 分 裂 期 にお い てAktの 機 能 は,異 な る役 割 を もつ2 つ の リ ン酸型Aktに よ る紡 錘 体 の維 持 と受 精後 の第2極 体 の放 出,す な わ ち減 数 分 裂 の完 了 に機能 して い る こ とが 明 らか とな っ た。

総 括 本研 究 で は 哺 乳 動 物 の 卵 成 熟 に 関 わ る 分 子 を明 らか にす る こ と を 目 的 と し, マ ウ ス卵 成熟 過 程 にお けるAktの 役割 につ いて, 1.AktはGv期 卵 母 細胞 に存 在 し,PI3K/Akt経 路 が機 能 す る ことで 卵 成 熟 が進 行 す る こと, 2.AktはMIお よびMII期 の 紡錘 体 に局在 し,そ のThr308リ ン酸 型 はPCM に,一 方,Ser473リ ン酸 型 は紡 錘体 に存 在 し,受 糟 後 第2極 体 放 出 と と も に極体 側 に移行 し,前 核 形 成 期 以降 発 現 しな い こと, 3.Aktの 局 在 は体 細 胞 の分 裂 中期 で は観 察 され な い こ とか ら,Aktが 減 数 分 裂 特 異 的な 機能 を持 つ こ と, 4.Aktは 減 数 分裂 再 開 にお いて,卵 核 胞 崩 壊 時 の核 膜 の消 失 と減 数 分 裂 後 期 の紡 錘 体 形 成 ・維 持,さ らに受 精 後 の 第2極 体 放 出 に機 能 し,減 数 分裂 の 再:開と完 了 に関 与 す る こ と, 5。2つ の リン酸型Aktは 独 立 して機 能 す る こ と,す な わ ち,Thr308リ ン酸 型 Aktは 減 数 分裂 中期 紡 錘体 維 持 と受 精 後 の 第2極 体 放 出 か ら減 数 分裂 の完 了 に関与 し,一 方,Ser473リ ン酸型Aktは 減 数 分裂 中期 紡 錘 体 維 持 と第2 極体 放 出 に機 能 す る こ と を 明 ら か に し た 。 本 研 究 で得 られ た知 見 は,マ ウス の 卵 成 熟 過 程 にPI3K/Aktが 関 与 し,Akt が 減 数 分 裂 の 再 開 と完 了 に機 能 して い る こ とを 明 らか に した初 め て の もの で あ る。 さ らに,Aktの2つ の リ ン酸 型Aktは そ れぞ れが 独 立 して 機 能 す る こ とを 明 らか に し,本 研 究 で得 られ た成 果 は,マ ウ ス だ けで な く,他 の哺 乳 動 物 に お け る卵 成 熟 機 構 の 解 明 に 貢 献 す る も の で あ る 。

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.L.一三 ' 蒙 」 騨 ■.、. マ.`. 雲. C 』 墜 _. D F置9・1・De￠ecti叩ofAktdurfngmeiotiG maturationinmouseoocytes.(A)Westernblot analysisfortotal,".ktexpressionin5000cytesat eachstage.(t3)lmmunofluorescencelocalization oftotalAkt.GreenandredcolorsshowAktand nuclearstatus,respectively.Oocytesat prometaphaseI(PMI),MIandMIIwerecoileded at8,10and18hrafterculture,respectively. Fig.2.CeMulaピ 置o￠a置izatio纐ofAk奪in somaticcellsatmetaphase.PanelAand BshowSTOcells.PanelCandDshow Fielacells.BandDarenegativeconfrols. GreenandredcolorsshowAktand nuclearstatus,respectively.The arrowheadsindicatethemetaphasecells. Bar=10Nm. Fig.3.Cellularlocalizationof Thr308-phosphorylatedAktduring meioticmaturation.Oocytesat prometaphaseI(PMI),MIandMII werecollectedat8,10and18hr afterculture,respectively.The meioticstagesareprometaphaseI (A-C),metaphasei(D-F)and metaphaseII(G-1),respectively. Nuclearstatusandmicrotubules (B,E,H)werevisualizedbycounter-staining,andmerged(C,F,1)with stainingofThr308-phosphorylated Akt(A,D,G).Green,redandblue colorsshowAkt,nuclearstatusand microtubules,respectively.The arrowheadsindicatethefirstpolar body.

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A B C 〆.1;薪 .髄 甲 D E F 「. .チ モ .r

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温二. G ,i _i Fig.4.CellularlocalizationofSer473-phosphorylatedAktduringmeiotic maturation.OocytesatprometaphaseI (PMI),MIandMIIwerecollectedat8,10 and18hrafterculture,respectively.The meioticstagesareprometaphaseI(A-C), metaphaseI(D-F)andmetaphaseII(G-1), respectively.Nuclearstatusand microtubules(B,E,H)werevisualizedby counter-staining,andmerged(C,F,1)with stainingofSer473-phosphorylatedAkt (A,D,G).Green,redandbluecolorsshow Akt,nuclearstatusandmicrotubules, respectively.Bar=10Nm. (kDa) 1 2 3 150 0 5 0 7 響 1 50 ㍉■■■幽■■一 ノー ■一 一rr¥■ ■ ■■「 ((85kDa Fig.5.DetectionofPI3Kinmouseoocytesandcumuluscells. Lane1;Helacellswereusedasapositivecontrol,lane2and3; oocytesandcumuluscells.Thesampleswerecollectedfromfifty cumulus-oocytecomplexes. Fig.6.EffectofLY2940020n cumulusexpansion.COCswere culturedfor18hr.Thestatusof cumulusexpansioninhypoxanthine (A),FSH(B)or10NMLY294002(C)一 supplementedmedium.

Table1.EffectofLY2940020nFSH-inducedmeioticmaturationofcumulus-oocytecomplexes(COCs) Maturationmedium S叩Plemen量edwith LY294002 added (μM) No.ofCOCs examined Percentageofoocytesprogressedto: GVBD MII Hx Hx+FSH Hx+FSH Hx+FSH 0 0 10 100 77 159 156 183 27.Of3.08 88.2t2.3b 78.3土3.8b・0 60.1t3.8d 0士oa 75.Ot2.2b 58.7士9.5c 26.3t4.4d ValuesaremeantS.E,M.ofthreereplicates.Datawereanalyzedbyone-wayAAIOVAfollowedbyFisher'sPLSD.

劇Valuesw㎞df短r㎝tsupp陪c巾 おw㎞inea{泊columaresign而ca崎d蒔 他rent(P《0 _.05).

Table2.EffectofLY2940020nFF-MAS-inducedmeioticmaturationindenudedoocytes(DOs) Maturationmedium supplementedwith LY294002 added (NM) No.ofDOs examined Percentageofoocytesprogressedto: GVBD MII Hx Hx+FSH Hx+FF-MAS Hx+FF-MAS Hx+FF-MAS 0 0 0 10 100 96 55 108 27 121 17.7t1.3a 25.7t1.2a 62.7t9.2b 59.Ot4.9b 50.7t1.8b 0:上oa OtO8 38.Ot6.5b 21.7±4gc・d 15.7t1.2d ValuesaremeantS.E.M.ofthreereplicates.Datawereanalyzedbyone-wayANOVAfollowedbyFishesPLSD. e-dValueswithdifferentsuperscriptswithineachcolumnaresignificantlydifferent(P<0_.05). M 唱 z 3 4 5 s (kDa) _ヒ と r 80一 ・1 L. 60一.1 . .i i... L、. 501. _野 f 40-1 } 詞 30一

ト

く. ( 20一 Fig.7.AktactivityinLY294002treatedmouse ooc1幽s.Lane.1;Helace睡sasapositivecon㎞lglane2; GVoocytes,lane3and4;MIandMIIoocyteswithout treatment,lane5and6;MIandMIIoocytestreatedwith 10NMLY294002.Onehundredofoocyteswereloaded ineachlane. Table3.EffectofSH-60nFSH-inducedmeioticmaturationinmousecumulus-oocytecomplexes SH-6 added (NM) No.of .oocytes examined Percentageofoocytesshowing:

PMI MI M髄 Abnomal曹 Others

0 20 40 43 44 45 0士03 0±oa 3.1t3.1a OtOｰ 19.5t6.7b 12.1.士9.5a 98.6t1.48 14.Ot9.8ｰ 0士 伊 0士oa 62.5t13.6a 67.1t9.48 1.4tO.38 4.0士4.Ob 17.7t6.9b ゆ紬n。 ㎜ 置融sof面mmso8冊and耐 併o加bule酬Mon . ValuesaremeantS.E.Moffivereplicates.Datawereanalyzedbyone-wayANOVAfollowedbyFisher'sPLSD. a《へ1aluesw醜hdi挽rentsuperscrip偽w薩hineachcoklmnaresign面can鱈yd瀞erent(Pく0 _.05).

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二篭 1:1,.・.・ 薦 弁 2σ ミ葺 蘭 玉レ、.団.∫.「 .幾ε E .1.で:どこ 40μ 簾 碁妻夢 Fig.8.EffectofSH-60nFSH-induced meioticmaturationinmouseCOCs. COCswereculturedfor18hrinthemedium containing200r40NMSH-6.Greenand redcolorsshowmicrotubulesandnuGear status,respectively. ;嵐.::...「._..:覧 .. .7 =鑑 ∵ =ξ.ご A B C 夕・・塩 ・ 箋 =憩』」 . .{ 争 ジ _≒こノ. D E F Fig.9.CellularlocalizationofLamin8 duringmeioticma加rationinmo団se oocytestreatedwith20itMSH-6for8hr. Top(A-C)andbottom(D-F)panelsshow controlandSH-6treatedoocytes, respectively.LaminB(AandD),microtubules andnudearstatus(BandE),andmerged(C andF).Green,redandbluecolorssh◎wAkt, nuclearstatusandmicxotubules,respectively. 響 、_{㌃ 軍.'}

撃

罷一一 A B C ξ'㌃ 馬 ご.セ. `㌃ 胤 .・.⊃をプ;ζ.= _{・ .乙} d E F Fig.10.CellularlocalizationofLaminB duringmeioticma加rationinmouse oocytestreatedwith20NMSH-6for10hr. Top(A-C)andbottom(D-F)panelsshow controlandSH-6treatedoocytes, respectivelソ,LaminB(AandD),耐c耐ubules andnudearstatus(BandE),andmerged(C andF}.Green,redandbluecolorsshowAkt, nuGearstatusandmicrotubules,respectively.

Tablea.EffectsofSH-60nGVBDandprogresstoMIin mouseGVoocybes SH-6 added (NM) No.ofoocytes examined at8hr/10hr Percentageofoocyteswith GVBDat8hr MIat10hr 0 20 40 53/35 47/35 47/35 98.3t1.7a 95.4t2.3a 95.7t2.2a 97.7t2.2a 72.2t4.Oe 27.8t4.Ob ValuesaremeantS.E.M.ofthreereplicates.Datawereanalyzedby one-wayANOVAfbllowedbyFisheドsPLSD.a・bValuesv甜 聰dif陀rent superscriptswithineachcolumnaresignificantlydifferent(P<0.05). Table5. oocytes 日 鳳ofSH崎onpro9陀sstoMI置inmouseMl A 鞠! マ .:知 SH-6 added (NM) No.ofMl oocytes examined Percentageofoocytes progressedtoMII B .露. マ..}.

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0 20 40 66 64 60 99.Ot1.08 93.4t3.4b 93.3t1.7b ValuesaremeantS.E.M.ofthreereplicates.Datawereanalyzedby one-way州0》A董bIlowedbyFlsheドsPLSD.亀bValues蝸 甜1d侮rer撹 suPe隠c巾 鮎w醗hinaoolumnaresigni寵can廿yd恥re耐(Pく0.05》. Fig.11.Organizationofmicrotubules andalignmentofchromosomesin mouseMIoocytesculturedwithSH-6. Mostofthetreatedoocytesreachedto MII.PanelA;control,PanelB;oocytes culturedwith20NMSH-6.Redandblue colorsshownuclearstatusand microtubules,respectively.The arrowheadsindicatethefirstpolarbody. .! ・'藤 .. 毒 雛. 響 .1 / .A. _..一 オ .」.一.

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ド ジ 1 E .∫ F G 『 H .夢. .拶 i .、群 J 渉. 露. K 事 L Fig.12.Distributionof Thr308-andSer473-phosphorylatedAkt immediatelya偽er伽 γ伽o fertilization.Top(A-D), middle(E-H)andbottom(1-L) panelsshowmicrotubules, Thr308一,andSer473-phosphorylatedAkt, respediveiy.IVFOhr(A,E, 1),IVFlhr(B,F,J),IVF2hr (C,G,fnandIVF4hr(D,H, L).Greenandredcolors showmicrotubulesor phosphorylatedAktand nuclearstatus,respectively. 9

Table6.EffectsofSH-60nspermpenetrationandsecondpolarbody

●

(2PB)extrusioninmouseoocytestreatedwithSH-6 SH-6 added (μM) No.of oocytes examined Percentageofoocyteswith Spempenet恰 セion 2PB 0 20 如 0 9 7 7 響 F O 5 89.5t2.7a 85.6tO.9a 84.Ot1.4a 87.3t4.Oa 18.7t1.3b O士oc Valuesaremean±S且M.of廿lreereplicates.Datawereana呼zedbyone。wayANOVA 掴IowedbyFisher'sPLSD.制Va如eswithdiflbrentsupersc巾tswi量hineachcolumnare significantlydifferent(P<0.05). ・む 難 蝦 鰐

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Fig.14.EffectofThr308-or Se"473-phosp臨ory艦atedAkt 董nhibito可pept董deon8econd PO曜arbodyextrUsiona髄er亙 η 脳漕 ◎ 箆r甑lization.PanelAand B;oocytesreceivedwithThr308 peptide,PanelCandD;oocytes receivedwithSer473peptide. PanelBandDshowmerged figures.Greenandredcolors showmicrotubulesandnuclear status,respectively.The arrowheadsindicatethesecond polarbody.

論 文 審 査 結 果 要 旨

体 外 成 熟 さ せ た 卵 子 の 産 子 へ の 発 生 能 は 低 い 。 そ の 一 因 と し て,哺 乳 動 物 の 卵 成 熟 機 構 の 詳 細 が 未 だ 明 ら か に な っ て い な い こ とが あ げ られ る 。し た が っ て,卵 成 熟 機 構 を 明 らか に す る こ と は 重 要 で あ り, そ の 解 明 は,高 い 受 精 能 ・発 生 能 の あ る 胚 を 体 外 で 生 産 す る 技 術 の 確 立 に 貢 献 す る 。 特 に 卵 成 熟(GV 期 か らMH期)過 程 に お け る 染 色 体 の 整 列 や 紡 錘 体 形 成 な ど を 制 御 す る 分 子 機 構 は 明 らか に さ れ て い な い 。 最 近,細 胞 骨 格 系 の 構 築 に 関 わ る シ グ ナ ル 伝 達 にphosphaddylinosito1-3-OH-kinase(PI3K)が

重 要 で あ る こ と が 明 ら か に され,こ のPI3Kの 下 流 にAktが 存 在 す る こ と,ま た,PI3K/Aktが 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 一 つ と して 細 胞 の 生 存 や 増 殖 に 中 心 的 な 役 割 を 果 た し て い る こ とが 示 され た 。 こ の よ う な 背 景 下,マ ウ ヌ を 材 料 と し卵 成 熟 過 程 に お け るAkt(proteinkinaseB)の 生 理 的 役 割 を 明 ら か に し よ う と し た 。 本 研 究 で は,ま ず 卵 成 熟 過 程 に お け るAktの 発 現,PI3KlAkt経 路 の 存 在 とAktの 役 割 を 調 べ,次 にGV期 か らMH期 進 行 に お け る活 性 型Aktの 役 割 を 明 ら か に し,最 後 に 卵 成 熟 過 程 に お け る リ ン 酸 型Aktの 役 割 に つ い て 解 析 し,次 の こ と を 明 ら か に し た 。(1)AktはGV期 卵 母 細 胞 に 存 在 し,PI3K/Akt経 路 が 機 能 す る こ とで 卵 成 熟 が 進 行 す る,(2)AktはMIお よ びMH期 の 紡 錘 体 に 局 在 し,そ のThr308リ ン酸 型 はPCMに,一 方,Ser473リ ン酸 型 は 紡 錘 体 に 存 在 し,受 精 後 第2極 体 放 出 と と も に 極 体 側 に 移 行 し,前 核 形 成 期 以 降 発 現 し な い,(3)Aktの 局 在 は 体 細 胞 の 分 裂 中期 で は 観 察 さ れ な い こ と か ら,Aktが 減 数 分 裂 特 異 的 な 機 能 を 持 つ と推 察 され る,(4)Aktは 減 数 分 裂 再 開 に お い て,卵 核 胞 崩 壊 時 の 核 膜 消 失 と減 数 分 裂 後 期 の 紡 錘 体 形 成 ・維 持,さ ら に 受 精 後 の 第2極 体 放 出 に 関 与 し,減 数 分 裂 の 再 開 と完 了 に 関 わ る,(5)2つ の リ ン 酸 型Aktは 独 立 して 機 能 す る,す な わ ち,Thr308リ ン 酸 型Aktは 減 数 分 裂 中 期 紡 錘 体 維 持 と受 精 後 の 第2極 体 放 出 か ら減 数 分 裂 の 完 了 に 関 与 し,一 方,Ser473リ ン 酸 型Aktは 減 数 分 裂 中 期 紡 錘 体 維 持 と第2極 体 放 出 に 機 能 す る 。 本 研 究 で 得 られ た 知 見 は,マ ウ ス の 卵 成 熟 過 程 にPI3K/Akt経 路 が 関 与 し,Aktが 減 数 分 裂 の 再 開 と完 了 に 関 わ る こ と を 明 らか に し た 初 め て の も の で あ る 。 さ ら に,Aktの2つ の リ ン 酸 型Aktは そ れ ぞ れ が 独 立 して 機 能 す る こ と を 示 した 。 本 研 究 は 応 用 動 物 科 学 に お い て 高 く 評 価 さ れ る 。 よ っ て 博 士(農 学)の 学 位 を 授 与 で き る も の と判 定 した 。