別添
輸送 米産 非遺伝子組換え大豆及び ン 種 非遺伝子組換え う
分別生産流通管理 指針
．農家 生産段階及びカン ベ タ 流通段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
種子 播種
種子証明書 た 種子名 番号 チ
収穫
非遺伝子組換え を他 混 い う収穫
農器具 機器
播種機 収穫機等 農機具 機器 非遺伝子組換え専用化 併用 場合
ニン
出荷又 集荷輸送 た 車両等
車両等 い 非遺伝子組換え専用利用 望 い 専用利用 い車
両等 あ ニン
保管施設及び搬出入施設
サ 等 保管施設及び搬出入施設 い 非遺伝子組換え専用利用 時期
を 使用 等専用利用 い保管施設及び搬出入施設 い あ
ニン 。2貨 管理主体
農家又 農家を管理 立場 あ カン ベ タ 等 集荷業者
。3貨 録
種子名 番号貨 出荷数量 出荷年月日 集荷 搬入農産物 種子名［番号が 購
入農家 数量 年月日 保管 品名 専用 場合を除 ビン番号 数量 年月日貨
入出庫 品名 専用 場合を除 ビン番号 数量 年月日貨 非遺伝子組換え専用利
用 い場合 ニン 実施確認
。4貨 確認主体
集荷業者 管理主体 上 管理方法 適正 管理 た を 録等 確
認
． ベ タ 流通段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
集荷輸送 た 車及び け
い 非遺伝子組換え専用利用 望 い 専用利用 い
及び 車 け あ ニン
保管施設及び搬出入施設
保管施設及び搬出入施設 い 非遺伝子組換え専用利用 専用利用
。2貨 管理主体
ベ タ
。3貨 録
集荷 搬入農産物 種子名お番号が 購入農家 数量 年月日 保管 品名 専用
場合を除 ビン番号 入出庫 品名 専用 場合を除 ビン番号 数量 年月日
ニン 実施確認
。4貨 確認主体
集荷業者 た 輸入業者等 管理主体 上 管理方法 適正 管理 た
を 録等 確認
． ポ ベ タ 及び日本 輸送段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
保管施設及び本船 積 込 施設
非遺伝子組換え専用利用 い保管施設及び搬出入施設 い あ
ニン
船艙 積 込
一 船艙内 異 品種 商品 を区分 搬入 場合 充分注意
他 混入 い う
本船 内航船 け 積 替え
非遺伝子組換え専用利用 い け及び搬出入施設 い あ
ニン 。2貨 管理主体
ポ ベ タ 及び港湾サ 管理者 く 管理 者
。3貨 録
入荷 入出庫 輸出入 品名 数量 本船名 チ番号 年月日 搬出入港
ニン 実施確認
。4貨 確認主体
輸入業者 管理主体 上 管理方法 適正 管理 た を 録等 確
認
．港湾サ 日本国内流通段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
サ ビン ベ タ 計量器 コンベ 等サ 搬出入非
遺伝子組換え専用利用 い港湾サ 及び機器 い あ
ニン
選別作業 ベ タ 原料タン 製品タン 石抜 機 真比
重選別機等
非遺伝子組換え専用利用 い選別機器 い あ ニン
。2貨 管理主体
。3貨 録
入荷 入出庫 ニン 実施確認
。4貨 確認主体
荷主 卸売業者 製造業者及び輸入業者等 管理主体 上 管理方法 適
正 管理 た を 録等 確認
．卸売業者 主 大豆 流通段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
サ 搬出入
輸送 場合 輸送
選別作業 ベ タ ビ セ タ 粗選別機 石
抜 機 真比重選別機 選別機器 袋詰 等
非遺伝子組換え専用利用 い保管施設 輸送車 選別作業 機器等 い
あ ニン
。2貨 管理主体 卸売業者 。3貨 録
原料購入 原料保管 保管箇所 入出庫 製品販売 袋詰 作業 品名 数
量 荷姿 年月日 ニン 実施確認
。4貨 確認主体
卸売業者 上 管理方法 適正 管理 た を 録等 確認
．加工業者 タ チ工場 流通段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
原料搬入
搬入機器を使用 前 空運転 残留物 い を確認
選別施設
選別機器を使用 前 空運転 残留物 い を確認
タ チ 製造 ン
従前 使用原料 不分別原料 あ た場合 製造施設 残留物 い を確
認 微粉状あ い 液状 残留 懸念 当該施設
ニン を行う
タ チ 保管 出荷
製品倉庫 不分別原料 保管場所を別
。2貨 管理主体
タ チ製造業者
。3貨 録
原料購入 原料 払 製造 保管場所 製品入出庫 渡 ニン 実施確
認
タ チ製造業者 上 管理方法 適正 管理 た を 録等 確認
．食品製造業者 製造段階
。1貨 チ ポ ン 及び管理方法
原料搬入
証明書 非遺伝子組換え農産物 確認
原料分別保管
不分別原料 明確 区分保管
製造 ン
非遺伝子組換え専用利用 い製造 ン い あ ニン
。2貨 管理主体 食品製造業者 。3貨 録
原材料購入 購入先 数量 製造 保管 出荷 ニン 実施確認
。4貨 確認主体
食品製造業者 上 管理方法 適正 管理 た を 録等 確認
．証明書 発行及び保存
流通 各段階 い 確認 行わ た旨 証明書を 引 相手方 発行
別添 全性審査済 遺伝子組換え食品 検査方法
1. 検体採 方法
1.1. 遺伝子組換え食品 検体採
1.1.1. 及び コ 穀粒 検体採
遺伝子組換え食品 不均一 分 い いう を前提 を代表
う 検体採 を行うた 対象 大 荷姿 包装形態 応
以 掲 検体採 を行う 検体採 際 他 穀粒 混入
い う十分配慮 使用 器具 容器包装等 使い捨 を使用
都度 十分 洗浄等を行い使用
検体採 た穀粒 均質 う十分 混合 た後 中 検査 必
要 一定量*を採 粉砕器等を用い 均質 粉砕
* 及び コ 穀粒 関 1検体 検体採 量1 kg う 500
gを粉砕 定量PCR検査 用い 残 500 g 穀粒 状態 保管 粒単 検
査法 際 残 500 g 穀粒 採
1.1.1.1. 袋積 場合
以 表 従 検体採 を行う
大 検体採 た 開梱数
検体採 量
kg 検体数
15 2 1 1
16 ～ 25 3 1 1
26 ～ 90 5 1 1
91 ～ 150 8 1 1
151 ～ 280 13 1 1
281 ～ 500 20 1 1
501 ～ 1,200 32 1 1
1,201 ～ 3,200 50 1 1
3,201 ～ 10,000 80 1 1
10,001 ～ 35,000 125 1 1
35,001 ～ 150,000 200 1 1
150,001 ～ 500,000 315 1 1
1.1.1.2. 積 場合
1.1.1.2.1. サ 搬入時
サ 搬入 際 1サ を1 全体を代表 検体
う サン 等を用い 検体採 を行う 適正 時間的
間隔を 15回 計10 kg以上を検体採 た を縮分 サ 毎 1検 体 1 kg以上
既 サ 搬入 た い 他 サ 移動 時 様
検体採 を行う
1.1.1.2.2. け搬入時
け 内航船を含 搬入 際 1 けを1 全
体を代表 検体 う サン 等を用い 検体採 を行う
適正 時間的間隔を 15回計10 kg以上を検体採 た を縮分
け毎 1検体 1 kg以上
1.1.1.2.3. け け 検体採
け 搬入 た い 検体採 を行う場合 1 けを1
全体を代表 検体 う上層 中層 層毎 各5カ所
計15カ所 計10 kg以上を検体採 た を縮分 け毎 1検体
1 kg以上
1.1.1.3.加工食品 検体採
加工食品 検体採 い 対象 大 応 以 表
従い検体採 を行う
及び コ 粉砕加工品 コ ン コ ン ワ コ
ン 等 穀粒を粉砕 た 検体採 い 1.1.1.1. 袋積 場合
従う
以外 加工食品
以 表 従 検体採 を行う
大 検体採 た 開梱数
検体採 量
g 検体数
䍺 15 2 120 1
16 ～ 50 3 120 1
51 ～ 150 5 120 1
151 ～ 500 8 120 1
3,201 ～ 35,000 20 120 1
35,001 ～ 500,000 32 120 1
䍻 500,001 50 120 1
1.1.2. 検体採
遺伝子組換え食品 不均一 分 い いう を前提 を代表
う 検体採 を行うた 対象 大 荷姿 包装形態 応
以 掲 検体採 を行う 検体採 際 他 穀粒 混入
い う十分配慮 使用 器具 容器包装等 使い捨 を使用
都度 十分 洗浄等を行い使用
1.1.2.1. 生鮮 検体採
生鮮 検体採 い 対象 大 応 以
表 従い検体採 を行う
大
検体採 た 開梱
数
検体採 量(個)
䍺 50 2 2
51 ～ 500 3 3
501 ～ 35,000 5 5
䍻 35,001 8 8
1.1.2.2. 加工品 検体採
加工食品 検体採 い 対象 大 応 以
表 従い検体採 を行う
大 検体採 た 開梱数
検体採 量 g
* 検体数
䍺 15 2 120 1
16 ～ 50 3 120 1
51 ～ 150 5 120 1
151 ～ 500 8 120 1
501 ～ 3,200 13 120 1
3,201 ～ 35,000 20 120 1
35,001 ～ 500,000 32 120 1
䍻 500,001 50 120 1
* 飲料製品 氷菓等製品 い 検体採 量を480 g
た 含有量 少 い加工品 い 実施 場合 製品分類
2. 全性審査済 遺伝子組換え食品 検査法
分別生産流通管理を実施 意 混入 く 遺伝子組換え食品 混入許容値
及び コ い 5% い 混入許容値を超え い
う 定 穀粒 関 ELISA及び定量PCR 行う た コ
穀粒 関 定量PCR又 チ タ PCRを用いた
ニン 検査を実施 混入許容値を超え い 能性 あ 定 た場合 粒
単 検査法又 検査法を実施 一方 及び コ 加工食品
関 遺伝子 加工遃程 DNA分解率 一定 いた 定量PCR及び
チ タ PCRを用いた ニン 検査 正確 定
い た 及び コ 加工食品 い タ PCRを用い
た定性PCRを実施 遺伝子組換え食品混入 有無 い 定 た
関 生鮮食品及び加工食品 タ PCRを用いた定性PCRを実施
遺伝子組換え食品混入 有無 い 定
2.1. 穀粒 検査法
国内 流通 遺伝子組換え 関 RoundupReady Soybean
40-3-2 以 RRS いう 唯一 あ た 2002年 認 い
サ ン 社 A2704-12系統 遺伝子組換え Liberty Link
Soybean Event A2704-12 以 LLS いう 及び2007年 認 た ンサ ン 社 Roundup Ready 2 Yield Event MON89788 以 RRS2 いう 収
穫 国内 流通 予想 い
2.1.1. ELISA法
試料中 CP4EPSPSタン 質を検知 手法 あ CP4EPSPSタン 質
RRS い 発現 い 法 検体中 RRS混入率 定量 能 あ
100 mesh 目 一目 長 150 µm ふ いを通遃 た粉 試料0.5 gを用い
SDI社製GMO Soya Test Kit Ver.2.1 説明書 載 た手法 従 試験
以 方法 い 述
試料又 標準品0.5 gをポ ン製遠沈管 15 mL容 正確 量 採
Soya Extraction 衝液 4.5 mLを加え サ を用い10秒間混合 た後 2,500ェg 15分間遠心 上清を 出液 Soya Assay 衝液 280 µL
出液 20 µLを加え撹拌 希釈液 Soya Assay 衝液 380 µL 希
釈液 20 µLを加え撹拌 試料液 作成 検量線 範 0
～2.5% あ 知検体 出液 い 検量線 範 内 定量値 内挿
う 別 10倍希釈 た試料液 準備 く 試料液を100 µL 加 え 37°C 1時間保温 後 Wash 衝液 3回洗浄 Reconstituted
and Diluted Soya Conjugate Mix 100 µLを加え 37°C 1時間保温
置 た後 Stop Solution 100 µLを加え 応を停 応停 後
を用い 450 nm 泅長 吸 度を測定 別途購入 た標準
試料を用い作成 た検量線 組換え体 含有量を 一 実験を2
行い 得 た値を 均
2.1.2. 定量PCR法
TaqMan Chemistryを応用 た定量PCR法を行う 法 対及び
蛍 チ を使用 当 対 増幅
塩基配列中 相補鎖を形成 う設計 い た
ポ タ ンチ 両色素 結合 DNAポ 増幅産物
伸長 応 伴い加水分解を け 蛍 を放射 蛍 強度 PCRサ 数
対 指数関数的 増強 た一定 蛍 強度 遉 サ 数 鋳型
DNA量 依存 た 一定 蛍 強度 遉 たPCRサ 数を比較
鋳型DNA量
遺伝子組換え食品 定量 非組換え体 組換え体を問わ 普遂的 存 遺伝
子 内 性遺伝子 を内標 用い 内 性遺伝子 コ 数 対 組換え遺伝
子 コ 数を 行う 本法 い 標準物質 標準
DNA溶液*1を使用 標準 DNA溶液 含 DNA 量 コ 数
規定 た 定量PCR 結 コ 数
を対象 た定量PCR法 い 普遂的 存 チン遺
伝子を内 性遺伝子 い 検査 際 チン遺伝子を標的
対 Le1-n02 Le1-Taq *2を使用 定量PCRを行い DNA試
料液中 チン遺伝子 コ 数を た 時 一DNA試料液
い 組換え遺伝子を標的 対 *3を使用 別 定量PCRを
行い 組換え遺伝子 コ 数を 組換え遺伝子 コ 数を チン遺伝子
コ 数 除 値をあ い 数 内標比*4 除
得 た値 100を乗 た 試料中 含 遺伝子組換え作物 含有量
重量 セン
以 定量PCR法 実際を述 定量PCR RRS検知法 ABI PRISM®
7700 ABI PRISM® 5700 ABI PRISM® 7900HT 96 well及び384 well ABI
PRISM® 7000 Applied Biosystems® 7500及びRoche LightCycler® System 又
等 性能を有 装置を用い 行う LLS検知法及びRRS2検知法 ABI
PRISM® 7900 HT 96 well 及びApplied Biosystems® 7500を用い 行う た
使用 機種 試薬 応液組成 応条件 手 並び 解析手法 異 た
検査 際 以 機種 載 た各 従い 必 使用 機種 適
た方法を用い PCR法 用い 水 特 断 書 い限 全 逆
*1 標準 DNA溶液
内 性遺伝子及び組換え遺伝子を標的 た特異的 対 増幅 た
増幅産物を 上 連結 た 標準 DNA を ColE1/TE溶
液 5 ng/µL 規定 コ 数 う 希釈 た溶液 本分析法 い
20 125 1,500 20,000 250,000コ 5段階希釈液 加え 標準
DNA 含 い いColE1/TE溶液 5 ng/µL を ン 試料液 NTC no
template control た 計6 い 検量線を作成 ColE1/TE溶
液 大腸菌由来 配列確認 い ColE1 を
TE 衝液 5 ng/µL 濃度 調製 た溶液 あ ニ ポン ン社又
社 購入 能 あ
RRS検知 GM RRS 陽性コン
LLS検知 GM LLS 陽性コン
RRS2検知 GM RRS2 陽性コン
*2 チン遺伝子を標的 対
Le1-n02［Le1n 02-5’ 5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’ &
Le1n 02-3’ 5’-GCCCATCTG CAAGCCTTTTT-3’ ］及び
Le1-Taq 5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC -TAMRA -3’
*3 組換え遺伝子を標的 対
RRS検知 RRS-01［RRS 01-5’ 5’-CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG-3’
& RRS 01-3’ 5’-GACTTGTCGCCGGGAATG-3’ ］及び
RRS-Taq 5’-FAM-CGCAACCGCCCGCAAATCC-TAMRA-3’ LLS検知 KVM175 5’-GCAAAAAAGCGGTTAGCTCCT-3’
SMO001 5’-ATTCAGGCTGCGCAACTGTT-3’ 及び
TM031 5’-FAM-CGGTCCTCCGATCGCCCTTCC-TAMRA-3’ RRS2検知 MON89788-F 5’-TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT-3’
MON89788-R 5’-TCGAGCAGGACCTGCAGAA-3’ 及び
MON89788-P 5’-FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-TAMRA-3’ *4 内標比
純粋 遺伝子組換え体 種子を対象 定量PCRを実施 得 組換え遺伝子
コ 数 内 性遺伝子 場合 チン遺伝子 コ 数 比を
た 内標比 各組換え作物系統 固有 あ 常 一定 値を示 考
え 各 対及び を用い 測定を行 た組換え作物系統
内標比 別紙1 規定 内標比 定量PCR法 使用 機種
異 た 混入率 算出時 必 使用 た機種 規定 い 内標比
を用い た 使用 試薬 影響を け 能性 考え た
2.1.2.1. ABI PRISM® 7700及びABI PRISM® 5700を用いた定量PCR
2.1.2.1.1. PCR用 応液 調製 ABI PRISM® 7700及びABI PRISM® 5700
PCR用 応液 25 µL/well 調製 組成 以 あ
TaqMan® Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific社 *1 12.5
µL 対象 対溶液 各 25 µmol/L 0.5 µL 対象 溶
液 10 µmol/L 0.5 µL 水9 µL 20 ng/µL DNA試料液2.5 µL 50 ng 又 検 量線用標準 DNA溶液2.5 µL 若 く 5 ng/µL ColE1/TE溶液 ン 試料液 NTC 2.5 µL 試験 1 DNA試料液当た 3 並行 行う
PCR用 応液 3 分を 時 調製 *2
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ TaqMan® Universal PCR Master Mix 対
象 対 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*3を先 調製
TaqMan® Universal PCR Master Mixを1 1.25 比率 混合 い
タ 調製液量 余剰分を考慮 1 DNA試料液 3 分 当
た 81 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分 撹拌
撹拌後 軽く遠心 い タ を必要数*4 微量遠沈管
78.75 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を8.75
µL加え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心
う 調製 た混合溶液を25 µL/well 96 上
分注 分注操作終了後 真上 蓋*5を 片側 ゆ
た い う両側 交互 閉 い 専用 を用
い 完全 を密閉 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合
縁を軽く叩い 気泄を抜い く
*1 TaqMan® Universal PCR Master Mix
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う直前
必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心 溶
液を試料管 底 集 い 使用 た 分注 際
以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
対象 対濃度 1.25 µmol/L 対象 濃度 0.5 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*4 分注必要数
検量線用標準 溶液 5 及び ン 試料液 1 計6
DNA試料液 数を加えた数
*5 96 及び 蓋
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific社 及びMicroAmp® Optical 8-Cap Strips Thermo Fisher Scientific社 を使用
2.1.2.1.2. 情報 設定 ABI PRISM® 7700及びABI PRISM® 5700
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う
目 検体 配置 種類及び 特性 あ 具体的 新規 上
調製 た 配置 対応 う 気を付け 検体 種類
STND 検量線用標準 DNA溶液*1 NTC ン 試料液
UNKN DNA試料液 設定を行う 際 一 溶液 分注 た3
をReplicate 指定 *2 た 特性 関 STND
NTC UNKN い Reporter FAM Reference
ROX Quencher TAMRA う設定
*1 検量線用標準 DNA溶液 設定
検体 種類 設定 加え コ 数を設定 一 検量線用標準
DNA溶液を分注 た を選択 た状態 Quantity欄 コ 数を
入力
*2 Replicate 指定
一 溶液を分注 た 付けた名称 name欄 入力 一 名称
を replicate欄 入力
2.1.2.1.3. PCR ABI PRISM® 7700及びABI PRISM® 5700
装置 をセ 装置 蓋 温度 Cover temperature 105°C
付近 た を確認 た後 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 30秒 59°C 1分を1サ
40サ 増幅 応を行う Remaining time 0分
2.1.2.1.4. 検量線 作成 ABI PRISM® 7700及びABI PRISM® 5700
内 性遺伝子及び組換え遺伝子 以 操作 検量線を作成
サ 数 対 蛍 増加量 ΔRn を た増幅曲線
Amplification Plot 上 検量線用標準 DNA溶液及びDNA試料
液由来 蛍 指数関数的 増幅 い ΔRn部を選択 Threshold
line Th を引く 際 ン 試料液 NTC 出現 あ 非特
異的増幅曲線 交差 い う 注意 た Base Line Startを3
Endを15 設定 Th 検量線用標準 DNA溶液 蛍
交差 た をThreshold cycle Ct 値 各々 検量線用標準
DNA溶液 コ 数 対数値 x軸 対 Ct値 y軸 を
各Ct値 対 得 た近似直線を検量線 *
* 実際 Thを引いた後 Amplification Plot ン 上 あ Update
Calculations タンを 検量線 自動作成 検量線
Analysis タ Standard Curve を選択 表示 検量 線 い Corr. 値を確認 0.990以上 あ た場合 以降 コ
数 算出を行う
2.1.2.2. ABI PRISM® 7900HT 96 well及び384 wellを用いた定量PCR
2.1.2.2.1. PCR用 応液 調製 ABI PRISM® 7900HT 96 well
PCR用 応液 25 µL/well 調製 組成 以 あ
TaqMan® Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific社 *1 12.5
µL 対象 対溶液 各 25 µmol/L 0.5 µL 対象 溶
液 10 µmol/L 0.5 µL 水9 µL 20 ng/µL DNA試料液2.5 µL 50 ng 又 検 量線用標準 DNA溶液2.5 µL 若 く 5 ng/µL ColE1/TE溶液 ン 試料液 NTC 2.5 µL 試験 1 DNA試料液当た 3 並行 行う
PCR用 応液 3 分を 時 調製 *2
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ TaqMan® Universal PCR Master Mix 対
象 対 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*3を先 調製
TaqMan® Universal PCR Master Mixを1 1.25 比率 混合 良い
タ 調製液量 余剰分を考慮 1 DNA試料液 3 分 当
た 81 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分 撹拌
撹拌後 軽く遠心 い タ を必要数*4 微量遠沈管
78.75 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を8.75
µL加え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心
分注 分注操作終了後 真上 完全 を密閉
わ 寄 い う注意 専用 ン 用 タ を用い
行う*5 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合 縁を軽く
叩い 気泄を抜い く 確認後 MicroAmp® Optical Film
Compression Pad*6を茶色 面 上 う 上面 セ
*1 TaqMan® Universal PCR Master Mix
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う
直前 必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心
溶液を試料管 底 集 い 使用 た 分注
際 以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*3 対象 対 対象 混合溶液
対象 対濃度 1.25 µmol/L 対象 濃度 0.5 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*4 分注必要数
検量線用標準 溶液 5 及び ン 試料液 1 計6
DNA試料液 数を加えた数
*5 96 及び ン タ
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific社 及びMicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific社 を使
用 ン 細 い 製品付属 ニ を参考
*6 MicroAmp® Optical Film Compression Pad
MicroAmp® Optical Film Compression Pad Thermo Fisher Scientific社
を使用 20回以上 繰 返 使用 定量結 影響を及 能
性 あ た 避け
2.1.2.2.2. PCR用 応液 調製 ABI PRISM® 7900HT 384 well
PCR用 応液 20 µL/well 調製 組成 以 あ
TaqMan® Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific社 *1 10 µL
10 µmol/L 0.4 µL 水7.2 µL 20 ng/µL DNA試料液2 µL 40 ng 又 検量 線用標準 DNA溶液2 µL*2 若 く 5 ng/µL ColE1/TE溶液 ン
試料液 NTC 2 µL 試験 1 DNA試料液当た 3 並行 行う
PCR用 応液 3 分を 時 調製 *3
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ TaqMan® Universal PCR Master Mix 対
象 対 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*4を先 調製
TaqMan® Universal PCR Master Mixを1 1.25 比率 混合 良い
タ 調製液量 余剰分を考慮 1DNA試料液 3 分 当た
66 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分 撹拌
撹拌後 軽く遠心 い タ を必要数*5 微量遠沈管
63 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を7 µL加
え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心 う
調製 た混合溶液を20 µL/well 384 上 分
注 分注操作終了後 真上 完全 を密閉
時 わ 寄 い う注意 専用 ン 用 タ を用い 行
う*6 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合 縁を軽く叩
い 気泄を抜い く
*1 TaqMan® Universal PCR Master Mix
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う
直前 必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心
溶液を試料管 底 集 い 使用 た 分注
以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 検量線用標準 DNA溶液
ABI PRISM® 7900HT 384 well を用いた試験 い 応液 添加
検量線用標準 DNA溶液 液量を2 µL い た 対応
コ 数 16 100 1,200 16,000 200,000 コ 数 設定
を誤 正確 測定 行え いた 注意
*3 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
対象 対濃度 1.25 µmol/L 対象 濃度 0.5 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*5 分注必要数
検量線用標準 溶液 5 及び ン 試料液 1 計6
DNA試料液 数を加えた数
*6 384 及び ン タ
MicroAmp® Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Thermo Fisher Scientific社 及びMicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher
Scientific社 を使用 ン 細 い 製品付属 ニ
を参考
2.1.2.2.3. 情報 設定 ABI PRISM® 7900HT 96well及び384well
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う
目 検体 配置 種類及び 特性 あ 特性 設定を
行う 特性 Detector Manager 面上 Reporter FAM
Quencher TAMRA う設定 *1 設定 たDetectorをSet upタ
録 た後 セ を用い 測定を行う
全 を指定 検体 配置 種類を指定 具体的 調製 た
配置 対応 う 気を付け 検体 種類 Standard 検量線 用標準 DNA溶液*2 NTC ン 試料液 Unknown DNA試
料液 をTask欄 い 指定 際 一 溶液 分注 た3 を
選択 た状態 名称を入力 く たPassive Referenceを ROX 設 定
*1 Detector 設定
Detector 各 セ 対 設定 く い
*2 検量線用標準 DNA溶液 設定
検体 種類 設定 加え コ 数を設定 一 検量線用標準
DNA溶液を分注 た を選択 た状態 Quantity欄 コ 数を
入力 2.1.2.2.2. 載 た う 96 を使用 場合 384
を使用 場合 液量 遊い コ 数 異 た 注意
2.1.2.2.4. PCR ABI PRISM® 7900HT 96 well及び384 well
装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 30秒 59°C 1分を1サ
9600 emulation チ を入 く た 96 384
応液量 異 あ た液量 設定を行う
Remaining time 0分 い を確認 応を終了 た後 測定結 解析を行う
2.1.2.2.5. 検量線 作成 ABI PRISM® 7900HT 96well及び384well
内 性遺伝子及び組換え遺伝子 以 操作 検量線を作成
サ 数 対 蛍 増加量 ΔRn を た増幅曲線
Amplification Plot 上 検量線用標準 DNA溶液及びDNA試料
液由来 蛍 指数関数的 増幅 い ΔRn部を選択 Threshold
line Th を引く 際 ン 試料液 NTC 出現 あ 非特
異的増幅曲線 交差 い う 注意 た Base Line Startを3
Endを15 設定 Th 検量線用標準 DNA溶液 蛍
交差 た をThreshold cycle Ct 値 各々 検量線用標準
DNA溶液 コ 数 対数値 x軸 対 Ct値 y軸 を
各Ct値 対 得 た近似直線を検量線 *
* 実際 Thを引いた時 検量線 自動作成 検量線 い
Corr. 値を確認 0.990以上 あ た場合 以降 コ 数 算出を行 う
2.1.2.3. ABI PRISM® 7000を用いた定量PCR
2.1.2.3.1. PCR用 応液 調製 ABI PRISM® 7000
PCR用 応液 25 µL/well 調製 組成 以 あ
TaqMan® Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific社 *1 12.5
µL 対象 対溶液 各 25 µmol/L 0.5 µL 対象 溶
液 10 µmol/L 0.5 µL 水9 µL 20 ng/µL DNA試料液2.5 µL 50 ng 又 検 量線用標準 DNA溶液2.5 µL 若 く 5 ng/µL ColE1/TE溶液
ン 試料液 NTC 2.5 µL 試験 1 DNA試料液当た 3 並行 行う
PCR用 応液 3 分を 時 調製 *2
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ TaqMan® Universal PCR Master Mix 対
象 対 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*3を先 調製
TaqMan® Universal PCR Master Mixを1 1.25 比率 混合 良い
タ 調製液量 余剰分を考慮 1 DNA試料液 3 分 当
た 81 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分 撹拌
78.75 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を8.75
µL加え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心
う 調製 た混合溶液を25 µL/well 96 上
分注 分注操作終了後 真上 完全 を密閉
わ 寄 い う注意 専用 ン 用 タ を用い
行う*5 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合 縁を軽く
叩い 気泄を抜い く 確認後 MicroAmp® Optical Film
Compression Pad*6を茶色 面 上 う 上面 セ
*1 TaqMan® Universal PCR Master Mix
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う
直前 必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心
溶液を試料管 底 集 い 使用 た 分注
以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*3 対象 対 対象 混合溶液
対象 対濃度 1.25 µmol/L 対象 濃度 0.5 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*4 分注必要数
検量線用標準 溶液 5 及び ン 試料液 1 計6
DNA試料液 数を加えた数
*5 96 及び ン タ
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific社 及びMicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific社 を使
用 ン 細 い 製品付属 ニ を参考
*6 MicroAmp® Optical Film Compression Pad
MicroAmp® Optical Film Compression Pad Thermo Fisher Scientific社
を使用 20回以上 繰 返 使用 定量結 影響を及 能
2.1.2.3.2. 情報 設定 ABI PRISM® 7000
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う
目 検体 配置 種類及び 特性 あ 特性 設定を
行う 特性 Detector Manager 面上 Reporter FAM
Quencher TAMRA う設定 *1 設定 たDetectorをWell
Inspector 録 た後 セ を用い 測定を行う
全 を指定 検体 配置 種類を指定 具体的 調製
た 配置 対応 う 気を付け 検体 種類 Standard
検量線用標準 DNA溶液*2 NTC ン 試料液 Unknown
DNA試料液 をTask欄 い 指定 際 一 溶液 分注 た3 を選択 た状態 名称を入力 く たPassive Referenceを
ROX 設定
*1 Detector 設定
Detector 各 セ 対 設定 く い
*2 検量線用標準 DNA溶液 設定
検体 種類 設定 加え コ 数を設定 一 検量線用標準
DNA溶液を分注 た を選択 た状態 Quantity欄 コ 数を
入力
2.1.2.3.3. PCR ABI PRISM® 7000
装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 30秒 59°C 1分を1サ
45サ 増幅 応を行う 応条件 設定 い
9600 emulation チ を入 く Remaining time 0分
い を確認 応を終了 た後 測定結 解析を行う
2.1.2.3.4. 検量線 作成 ABI PRISM® 7000
内 性遺伝子及び組換え遺伝子 以 操作 検量線を作成
サ 数 対 蛍 増加量 ΔRn を た増幅曲線
Amplification Plot 上 検量線用標準 DNA溶液及びDNA試料
液由来 蛍 指数関数的 増幅 い ΔRn部を選択 Threshold
line Th を引く 際 ン 試料液 NTC 出現 あ 非特
異的増幅曲線 交差 い う 注意 た Base Line Startを3
Endを15 設定 Th 検量線用標準 DNA溶液 蛍
DNA溶液 コ 数 対数値 x軸 対 Ct値 y軸 を
各Ct値 対 得 た近似直線を検量線 *
* 実際 Thを引 Analyze タンを た時 検量線 自動作成
検量線 い Corr. 値を確認 0.990以上 あ た場合 以降
コ 数 算出を行う
2.1.2.4. Applied Biosystems® 7500を用いた定量PCR
2.1.2.4.1. PCR用 応液 調製
PCR用 応液 25 µL/well 調製 組成 以 あ
TaqMan® Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific社 *1 12.5
µL 対象 対溶液 各 25 µmol/L 0.5 µL 対象 溶
液 10 µmol/L 0.5 µL 水9 µL 20 ng/µL DNA試料液2.5 µL 50 ng 又 検 量線用標準 DNA溶液2.5 µL 若 く 5 ng/µL ColE1/TE溶液
ン 試料液 NTC 2.5 µL 試験 1DNA試料液当た 3 並行 行う
PCR用 応液 3 分を 時 調製 *2
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ TaqMan® Universal PCR Master Mix 対
象 対 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*3を先 調製
TaqMan® Universal PCR Master Mixを1 1.25 比率 混合 良い
タ 調製液量 余剰分を考慮 1 DNA試料液 3 分 当
た 81 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分 撹拌
撹拌後 軽く遠心 い タ を必要数*4 微量遠沈管
78.75 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を8.75
µL加え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心
う 調製 た混合溶液を25 µL/well 96 上
分注 分注操作終了後 真上 完全 を密閉
わ 寄 い う注意 専用 ン 用 タ を用い
行う*5 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合 縁を軽く
叩い 気泄を抜い く
*1 TaqMan® Universal PCR Master Mix
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う
直前 必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心
溶液を試料管 底 集 い 使用 た 分注
*2 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*3 対象 対 対象 混合溶液
対象 対濃度 1.25 µmol/L 対象 濃度 0.5 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*4 分注必要数
検量線用標準 溶液 5 及び ン 試料液 1 計6
DNA試料液 数を加えた数
*5 96 及び ン タ
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific社 及びMicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific社 を使
用 ン 細 い 製品付属 ニ を参考
2.1.2.4.2. 情報 設定 Applied Biosystems® 7500
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う
目 検体 配置 種類及び 特性 あ 特性 設定を
行う 特性 Detector Manager 面上 Reporter FAM
Quencher TAMRA う設定 *1 設定 たDetectorをWell
Inspector 録 た後 セ を用い 測定を行う
全 を指定 検体 配置 種類を指定 具体的 調製
た 配置 対応 う 気を付け 検体 種類 Standard
検量線用標準 DNA溶液*2 NTC ン 試料液 Unknown
DNA試料液 をTask欄 い 指定 際 一 溶液 分注 た3 を選択 た状態 名称を入力 く たPassive Referenceを
ROX 設定
*1 Detector 設定
Detector 各 セ 対 設定 く い
*2 検量線用標準 DNA溶液 設定
検体 種類 設定 加え コ 数を設定 一 検量線用標準
DNA溶液を分注 た を選択 た状態 Quantity欄 コ 数を
2.1.2.4.3. PCR Applied Biosystems® 7500
装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 30秒 59°C 1分を1サ
45サ 増幅 応を行う 応条件 設定 い
RUN Modeを9600 emulation 設定 RUN 終了を知 The run
completed successfully 表示を確認 応を終了 た後 測定結 解析 を行う
2.1.2.4.4. 検量線 作成 Applied Biosystems® 7500
内 性遺伝子及び組換え遺伝子 以 操作 検量線を作成
サ 数 対 蛍 増加量 ΔRn を た増幅曲線
Amplification Plot 上 検量線用標準 DNA溶液及びDNA試料
液由来 蛍 指数関数的 増幅 い ΔRn部を選択 Threshold
line Th を引く 際 ン 試料液 NTC 出現 あ 非特
異的増幅曲線 交差 い う 注意 た Base Line Startを3
Endを15 設定 Th 検量線用標準 DNA溶液 蛍
交差 た をThreshold cycle Ct 値 各々 検量線用標準
DNA溶液 コ 数 対数値 x軸 対 Ct値 y軸 を
各Ct値 対 得 た近似直線を検量線 *
* 実際 Thを引 Analyze タンを た時 検量線 自動作成
検量線 い Corr. 値を確認 0.990以上 あ た場合 以降
コ 数 算出を行う
2.1.2.5. Roche LightCycler Systemを用いた定量PCR
2.1.2.5.1. PCR用 応液 調製 Roche LightCycler System
PCR用 応液 20 µL/ 調製 組成 以
あ LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes*1 2 µL 対象
対溶液 各 25 µmol/L 0.4 µL 対象 10 µmol/L 0.4
µL 水9.8 µL MgCl2溶液 25 mM 2.4 µL 10 ng/µL DNA試料液5 µL 50
ng 又 検量線用標準 DNA溶液5 µL*2 若 く 5 ng/µL
ColE1/TE溶液 ン 試料液 NTC 5 µL 試験 検量線用標準
DNA溶液 及びNTC 対 1 1 DNA試料液 対 2
並行 行う DNA試料液 対 PCR用 応液 2
分を 時 調製 *3
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
Probes MgCl2溶液 水並び 対象 対 対象 を加えた溶液
タ を調製 際 対象 対 対象
混合溶液*4を先 調製 LC-FastStart DNA Master
Hybridization Probes MgCl2溶液 水 混合液を8 7 比率 混合
い タ 調製液量 余剰分を考慮 1 当た 19.8
µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分 撹拌 撹拌
後 軽く遠心 い タ を必要数*5 微量遠沈管 分注
分注 液量 検量線用標準 溶液及びNTC 対 18 µL DNA試
料液 対 36 µL 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を6 µL
検量線用標準 溶液及びNTC 若 く 12 µL DNA試料液 加え
サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心 う
調製 た混合溶液を20 µL/ 分注 分注操作終了後 真
上 蓋を 完全 を密閉 最後 遠心操作*6を行い 混合液
を 充填
*1 LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes
LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe Roche Diagnostics 内包 い LC-FastStart Enzyme 1a red cap LC-FastStart Reaction
Mix HybProbe 1b colorless cap を混合 調製 調製 た
LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes 4°C 一逬間 保存 能
あ た 本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実
行わ う 注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場
合 あ
*2 検量線用標準 DNA溶液
Roche LightCycler Systemを用いた試験 い 応液 添加 検量線
標準 DNA溶液 液量を5 µL い た 対応 コ
数 40 250 3,000 40,000 500,000 コ 数 設定を誤
正確 測定 行え いた 注意
*3 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
た Roche LightCycler Systemを用いた定量PCR い 試験を検量
線用標準 DNA溶液 及びNTC 対 1 1DNA試
数 及び1度 応 内 性遺伝子並び 組換え遺伝子 両方を測定
1回 測定当た 測定 能 DNA試料液 最大数 5
*4 対象 対 対象 混合溶液
対象 対濃度 1.25 µmol/L 対象 濃度 0.5 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*5 分注必要数
検量線用標準 溶液 5 及び ン 試料液 1 計6
DNA試料液 数を加えた数
*6 遠心操作
遠心操作 破損を避け た 専用 カ セ 遠心機を使
用 行う 又 汎用 遠心機を使用 場合 700ェg以
条件 行う 遠心操作 如何 関わ 装置本体 セ 前
をカ セ 装填 際 破損 十
分注意 セ
2.1.2.5.2. 情報 設定 Roche LightCycler System
応 際 情報 設定を行わ け い 具体的
サン 作成 面上 調製 た 配置 カ セ 上
配置 対応 う 気を付け 検体 種類 Standard 検量線用標
準 DNA溶液*1 Negative ン 試料液 Unknown DNA試
料液 をType欄 い 指定 際 一 溶液 分注 た2
い Replicate あ を指定 *2 た Seek Temperatureを
30°C 設定 Maximum Position カ セ 装填 た 最
大 置番号を入力
*1 検量線用標準 DNA溶液 設定
検体 種類 設定 加え コ 数を設定 各検量線用標準
DNA溶液を分注 た 対 Concentration欄 コ 数を入力
対応 コ 数 40 250 3,000 40,000 500,000 あ
*2 Replicate 指定
例え 置番号 7 8 一 溶液を分注 た場合 番
号7 関 情報を設定 後 番号8 番号7 Replicate あ
2.1.2.5.3. PCR Roche LightCycler System
装置 カ セ をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 95°C 10分間 条件 加温 た タ 法
応を開始 た後 95°C 15秒 59°C 30秒 1°C /秒 *1を1サ
50サ 増幅 応を行う 増幅 応終了後 40°C 30秒 条件 保
タ 込 増幅 応 各サ 終了時 行わ う設定 *2
*1 加温 冷却速度
示 い 以外 加温 冷却 速度 20°C /秒
*2 タ 込 設定
タ 込 設定 実際 サ タ 面 い
59°C 30秒 設定 たカ い Acquisition Mode を Single 設 定
2.1.2.5.4. 検量線 作成 Roche LightCycler System
応 終了 い を確認 た後 解析を行う 解析 Fit Point法
を用い 行う 内 性遺伝子及び組換え遺伝子 以 操作 検
量線を作成 Base Line Proportional Number of Points 2 解析 検体 を選択 た状態 Noise Bandを0.1 設定 上
条件 検量線を作成 Error値* 0.2以 あ た場合 際 得
た数値を解析値
* 検量線 Error値 0.2以上 場合 以 検討を行う Crossing Line 調整幅 Crossing Lineを移動 範 を0.1 0.2 間 手動
Crossing Lineを移動 移動 検量線 Error値 最
う Crossing Lineを設定 時 得 数値を解析値 上
解析を行 検量線 Error値 0.2以上 場合 検量線 大
く外 い 検量線用標準DNA溶液1 を解析対象 外 様 解析を
行う 以上 解析を行 Error値 0.2以上 場合 解析条件 最 Error値を示 た時 数値を解析値
2.1.2.6. 他 タ PCR装置を用いた定量PCR
他 タ PCR装置［例え QuantStudio® 5 Real-Time PCR
System Thermo Fisher Scientific社 QuantStudioTM 12K Flex Real-Time PCR
System 96 well Thermo Fisher Scientific社 LightCycler® 96 Roche
Diagnostics社 及びLightCycler® 480 96 well Roche Diagnostics社 ］ い
限 た LightCycler® 96及びLightCycler® 480 96 well PCR用 応液 調 整 TaqMan® Universal PCR Master Mix 代わ Eagle Taq Master Mix
(Rox) Roche Diagnostics社 を用い
2.1.3. 試料 遺伝子組換え食品含有率 計算
知DNA試料液 検量線作成 用いたThを使用 Ct値を 内標遺伝
子及び組換え遺伝子 検量線 各3 * 内 性遺伝子 コ
数を内挿 得 値 均を内 性遺伝子 コ 数及び組換え
遺伝子 コ 数 式 従 対象遺伝子組換え食品含有率を
対象遺伝子組換え食品含有率 % =
［組換え遺伝子 コ 数／ 内 性遺伝子 コ 数ェ内標比 ］ェ100
* Roche LightCycler System を用いた場合 1 DNA試料液当た 各3
く 2 実施 2.1.2.5.4. 得 た2 分
タ 均値を内 性遺伝子 コ 数及び組換え遺伝子 コ 数
2.1.4. 結 定
3試料 各1回 出を行い ELISA法又 定量PCR法 得 たRRS
含有率 LLS 含有率 RRS2 含有率を加えた値 5%を越えた試料 い
不適 分別生産流通管理 行わ いた 能性 あ
2.2. コ 穀粒 検査法
コ 異 た発現タン 質を持 組換え系統 存 上 一
発現タン 質 発現 組換え系統 あ 組換え系統毎 タン 質 発現量
異 た 多種 遺伝子組換え コ 混入 い 穀粒 遺伝子組換
え コ 含有率を 目的 ELISA法を用い い た
タ PCR法 有効 分析手法 た 今般 コ 穀粒 一
粒中 複数系統 組換えDNA配列 存 タ 品種 多種開発 い
コ 穀粒を一粒単 又 単 検査 必要 あ
上述 う コ 分析対象 複数系統存 た 2.2.1.
定量PCR又 2.2.2. チ タ PCR法を用いた ニン
検査を実施 タ 品種 混入 た場合 ニン 検査 実際
コ い 混入率 5%を超え 能性 あ 場合 2.2.3. 粒単 検査
法又 2.2.4 検査法を実施
本法 混入率 5%以 あ 結 明 た場合 当該 コ 分
別生産流通管理 適 実施 た 扱う
2.2.1. 定量PCR法
上述 う コ 分析対象系統数 多数存 た 多く
系統 共通 持 Cauliflower mosaic virus由来 35S promoter P35S
を持た い系統 特異的 応を用い ニン を実施 結 定を行
う 内 P35S 複数 入 い 系統 い 混入率 遃大
算出 コ 場合 コ 普遂的 存 内 性遺伝子
タ チ ンタ IIb SSIIb 遺伝子を用い 遺伝子を標的
対SSIIb-3 SSIIb-Taqを使用 得 た 遺伝子 コ 数 分
析対象 組換え遺伝子を標的 対 を使用 得 た
対象遺伝子 コ 数を 場合 2.1.2. 参照 様 算出 2.1.3. 示
た式 基 対象遺伝子組換え コ 含有率を
2.2.1.1. Cauliflower mosaic virus由来 35S promoter 組 込 た組換え系統 定量
組換え コ 系統Event176 Bt11 T25 NK603 MON863 TC1507
MON810 DAS-59122-7 MON88017及びMON89034 共通
Cauliflower mosaic virus由来 35S promoter P35S 配列 組 込 い た
配列含量を指標 系統 混合物 い 大 含量を
推定 能 あ 分析方法 用い 対 を除
定量PCR法 示 た方法 一 あ 内 性遺伝子 タ チ
ンタ IIb SSIIb 遺伝子を用い 遺伝子を標的 対SSIIb-3
SSIIb-Taq*1を使用 た 検量線用標準 DNA溶液
GM コ セ を使用 対象遺伝子 対
P35S-1 P35S-Taq*2 あ 別紙1 規定 た内標比を用い 最終
的 P35S配列 組 込 た遺伝子組換え コ 含有率を算出
*1 SSIIb遺伝子を標的 対
SSIIb-3［SSIIb 3-5’ 5’-CCAATCCTTTGACATCTGCTCC-3’ &
SSIIb 3-3’ 5’-GATCAGCTTTGGGTCCGGA-3’ 及び
SSIIb-Taq 5’-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA-3’
*2 P35Sを標的 対
P35S-1［P35S 1-5’ 5’-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3’ &
P35S-Taq 5’-FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-TAMRA -3’
P35Sを用いた際 内標比 MON810を対象 算出 た を用い
系統 組換え遺伝子中 P35S配列 1コ 存 い 遺伝子
組換え コ 含有率を遃 評価 能性 い P35S-Taq
他 半分 濃度 終濃度 0.1µmol/L 使用 た 応液
調製 際 留意 定量機器 Roche LightCycler Systemを用い 場合
当た 他 濃度 使用
2.2.1.2. GA21 MIR604 MIR162 定量
組換え系統GA21 MIR604 MIR162 P35S配列 組 込 い い
た 本系統 含有率を確認 た P35S配列を分析 一
DNA試料液 い 別 GA21 特異的 応 MIR604 特異的 応
MIR162 特異的 応を用い 2.2.1.1. 様 方法 各系統 含有率を
GA21 分析 対GA21-3 GA21-Taq*を 検量線用標
準 DNA溶液 GM コ セ を用い
MIR604 分析 対MIR604-1 MIR604-Taq*を 検量線
用標準 DNA溶液 GM コ MIR604 セ
を用い MIR162 分析 対MIR162-1 MIR162-Taq*
を 検量線標準 DNA溶液 GM コ MIR162
セ を用い MIR604 分析を行う際 MIR604特異的 応及び
SSIIb特異的 応 両方 タ PCR 応温度条件を以
50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 15秒 60°C 1分を1サ 45サ
増幅 応を行う
* 組換え遺伝子を標的 対
GA21検知 GA21-3［GA21-3-5’ 5’-GAAGCCTCGGCAACGTCA-3’ & GA21-3-3’ 5’- ATCCGGTTGGAAAGCGACTT-3’ ］及び
GA21-Taq 5’-FAM-AAGGATCCGGTGCATGGCCG-TAMRA- 3’
MIR604検知 MIR604-1［MIR604 primer F 5’-GCGCACGCAATTCAACAG-3’ & MIR604 primer R 5’-GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT-3’ ］及び
MIR604 probe 5’-FAM- AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG-TAMRA- 3’ MIR162検知 MIR162-1［MIR162-f1 5’-GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG-3’ & MIR162-r1 5’-TGCCTTATCTGTTGCCTTCAGA-3’ ］及び
2.2.1.3. 結 定
3試料 各1回 出を行い 得 たDNA試料液 い 定量PCRを
行 た結 P35S配列 組 込 た遺伝子組換え コ 含有率
GA21 MIR604 MIR162 含有率を加えた値 4.5%を越え 場合 粒単 検査
法又 検査法を実施
2.2.2. チ PCR法
2.2.1 定量PCR法 代わ 簡便 チ PCR法 混入率
5%を超え 能性 あ を 定 ニン 能 あ 本法
コ 普遂的 存 内 性遺伝子 starch synthase IIb SSIIb 遺伝
子 遺伝子組換え コ 広く共通 存 組換え配列
Cauliflower mosaic virus由来 35S promoter P35S 及びAgrobacterium
tumefaciens由来 nopaline synthase遺伝子 terminator TNOS を 時 検出
チ タ PCR法 行う 本法 複数セ
対 をPCR液 添加 複数 標的遺伝子を 時 検出
通常 ン タ PCR法 比 一度 多検体を処理
本 ニン 検査 SSIIbを検出 VIC 標識
い P35S TNOSを検出 FAM 標識 い
た 遺伝子量 合計 P35S+TNOS 相当 蛍 値 得 混入
率 5%を超え 能性 あ う 定 標準試料を用いたΔCq法 行
う ΔCq法 内 性遺伝子 け Cq値*1 標的遺伝子 本法 組換え遺伝子
け Cq値 差［ΔCq = Cq(標的遺伝子) – Cq(内 性遺伝子)］を用い 行う ΔCq
値 混入率 対数値 負 相関 あ 混入率 高い ΔCq値 く 得
た分析試料 ΔCq値 定基準 標準試料 ΔCq値以上 あ 場合 分析試料
け 遺伝子組換え コ 混入率 5%以 あ 定 分析試料
ΔCq値 標準試料 ΔCq値 い場合 分析試料 け 遺伝子組換え
コ 混入率 5%以上 あ 能性 あ 定 標準試料 4%(w/w)
MON810粉 試料*2 出 たDNA溶液 20 ng/µL を用い 分析試料 時 測定
*1 Cq値
ABI PRISM® 7900HT 96 well Ct値 LightCycler® 96 及びLightCycler®
480 Cq値 表 い 本法 表 をCq値 統一
*2 4%(w/w) MON810粉 試料
Maize GMO Standard ERM-BF413gk (10% MON810) IRMM/ERM Sigma-Aldrich社 購入 能 0.4 g Maize GMO Standard ERM-BF413ak (Blank
MON810) IRMM/ERM Sigma-Aldrich社 購入 能 0.6 gを混合 分析
2.2.2.1. ABI PRISM® 7900HT 96 wellを用いた ニン
2.2.2.1.1. PCR用 応液 調整 ABI PRISM® 7900HT 96 well
PCR用 応液 10 µL/well 調製 組成 以 あ
FastStart Universal Probe Master (Rox) Roche Diagnostics *1 5 µL 対象 SSIIb 3-5’ 50 µmol/L 0.016 µL*2 SSIIb 3-3’ 50 µmol/L 0.016 µL*2 P35S 1-5’ 50 µmol/L 0.05 µL*3 P35S 1-3’ 50 µmol/L 0.05 µL*3 NOS ter 3-5’ 50 µmol/L 0.06 µL*4 NOS ter 2-3’ 50 µmol/L 0.06 µL*4 対象 SSIIb-TaqV 10 µmol/L 0.08 µL*5 P35S-Taq 10 µmol/L 0.1 µL*6 NOS-Taq 10 µmol/L 0.12 µL*7 水3.448 µL 20 ng/µL DNA試料液1 µL又 蒸留水 ン 試料液 NTC 1 µL 試験 1 DNA試
料液当た 3 並行 行う PCR用 応液 3 分を 時 調
製 *8
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ FastStart Universal Probe Master (Rox)
対象 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*9を先 調製
FastStart Universal Probe Master (Rox)を1 1.25 比率 混合 良
い タ 調製液量 余剰分を考慮 1 DNA試料液 3
分 当た 34 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分
撹拌 撹拌後 軽く遠心 い タ を必要数*10 微
量遠沈管 30.6 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を
3.4 µL加え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心
う 調製 た混合溶液を10 µL/well 96 上
分注 分注操作終了後 真上 *11 完全 を密閉
わ 寄 い う注意 専用 ン 用 タ
を用い 行う 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合
縁を軽く叩い 気泄を抜い く 確認後 MicroAmp® Optical Film
Compression Pad Thermo Fisher Scientific社 を茶色 面 上 う
上面 セ *12
*1 FastStart Universal Probe Master (Rox)
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う直前
必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心 溶
液を試料管 底 集 い 使用 た 分注 際
以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 SSIIb 3-5’及びSSIIb 3-3’
SSIIb 3-5’ 5’-CCAATCCTTTGACATCTGCTCC-3’ SSIIb 3-3’ 5’-GATCAGCTTTGGGTCCGGA-3’
代わ 対象 対 SSIIb-3 25 µmol/L 0.032 µLを用い い
*3 P35S 1-5’ 及びP35S 1-3’
配列 以 あ
P35S 1-5’ 5’-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3’ P35S 1-3’ 5’-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3’
代わ 対象 対 P35S-1 25 µmol/L 0.1 µLを用い い
*4 NOS ter 3-5’及びNOS ter 2-3’
配列 以 あ
NOS ter 3-5’ 5’-GCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGAC-3’ NOS ter 2-3’ 5’-CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGT-3’
*5 SSIIb-TaqV
蛍 色素 VIC 標識 い 配列 以 あ
5’-VIC-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA-3’ *6 P35S-Taq
蛍 色素 FAM 標識 い 配列 以 あ
5’-FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-TAMRA-3’ *7 NOS-Taq
蛍 色素 FAM 標識 い 配列 以 あ
5’-FAM-AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-TAMRA-3’ *8 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*9 対象 対 対象 混合溶液
SSIIb 3-5’ 0.2 µmol/L SSIIb 3-3’ 0.2 µmol/L P35S 1-5’ 0.625 µmol/L P35S 1-3’ 0.625 µmol/L NOS ter 3-5’ 0.75 µmol/L NOS ter 2-3’ 0.75 µmol/L
SSIIb-TaqV 0.2 µmol/L P35S-Taq 0.25 µmol/L NOS-Taq 0.3 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 た後 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避
け
標準試料液 1 及び ン 試料液 1 計2 DNA試料液 数を 加えた数
*11 96 及び ン タ
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific社 及びMicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific社 を使
用 ン 細 い 製品付属 ニ を参考
*12 MicroAmp® Optical Film Compression Pad
MicroAmp® Optical Film Compression Pad Thermo Fisher Scientific社
を使用 20回以上 繰 返 使用 定量結 影響を及 能
性 あ た 避け
2.2.2.1.2. 情報 設定 ABI PRISM® 7900HT 96 well
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う
目 検体 配置 種類及び 特性 あ 具体的 新規 上
調製 た 配置 対応 う 気を付け 検体 種類
NTC ン 試料液 Unknown DNA試料液 設定を行う
際 一 溶液 分注 た3 を選択 た状態 名称を入力 く
た 特性 関 SSIIb Reporter VIC Quencher
TAMRA P35S+TNOS Reporter FAM Quencher TAMRA
う 設定 * Passive Referenceを ROX 設定
* 蛍 色素 Detector を 録 際 SSIIb VIC P35S+TNOS
FAM 設定
2.2.2.1.3. PCR ABI PRISM® 7900HT 96 well
装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 30秒間 59°C 1分30秒
間を1サ 40サ 増幅 応を行う 応条件 設定
い 9600 emulation チ を入 く Remaining time 0分
い を確認 応を終了 た後 測定結 解析を行う
2.2.2.1.4. PCR結 解析 ABI PRISM® 7900HT 96 well
サ 数 対 蛍 増加量 ΔRn を た増幅曲線
Amplification Plot 上 DNA試料液由来 蛍 指数関数的 増 幅 い ΔRn部を選択 Threshold line Th を引く* た Base Line
均Cq値 3 分 を算出 SSIIb け 均Cq値 P35S け 均Cq値 差［ΔCq = Cq(P35S+TNOS) – Cq(SSIIb)］を算出
* 通常 Th値 0.2 設定 た Th や指数関数的 い増幅曲
線 交わ 場合 交わ い うThを適宜設定
2.2.2.2. LightCycler® 96及びLightCycler® 480を用いた ニン
2.2.2.2.1. PCR用 応液 調整 LightCycler® 96及びLightCycler® 480
PCR用 応液 10 µL/well 調製 組成 以 あ
FastStart Universal Probe Master (Rox) Roche Diagnostics *1 5 µL 対象 SSIIb 3-5’ 50 µmol/L 0.016 µL*2 SSIIb 3-3’ 50 µmol/L 0.016 µL*2 P35S 1-5’ 50 µmol/L 0.05 µL*3 P35S 1-3’ 50 µmol/L 0.05 µL*3 NOS ter 3-5’ 50 µmol/L 0.06 µL*4 NOS ter 2-3’ 50 µmol/L 0.06 µL*4 対象 SSIIb-TaqV 10 µmol/L 0.08 µL*5 P35S-Taq 10 µmol/L 0.1 µL*6 NOS-Taq 10 µmol/L 0.12 µL*7 水3.448 µL 20 ng/µL DNA試料液1 µL又 蒸留水 ン 試料液 NTC 1 µL 試験 1 DNA試
料液当た 3 並行 行う PCR用 応液 3 分を 時 調
製 *8
実際 調製 応液 調製及びPCR 生 誤差を減少 た 以
手 従 行う あ FastStart Universal Probe Master (Rox)
対象 対象 を加えた溶液 タ を調製
際 対象 対 対象 混合溶液*9を先 調製
FastStart Universal Probe Master (Rox)を1 1.25 比率 混合 良
い タ 調製液量 余剰分を考慮 1 DNA試料液 3
分 当た 34 µL 適当 あ 混合時 サ を用い 十分
撹拌 撹拌後 軽く遠心 い タ を必要数*10 微
量遠沈管 30.6 µL 分注 分注後 各微量遠沈管 対応 DNA溶液を
3.4 µL加え サ を用い 十分 混合 た後 軽く遠心
う 調製 た混合溶液を10 µL/well 96 上
分注 分注操作終了後 真上 *11 完全 を密閉
わ 寄 い う注意 専用 ン 用 タ
を用い 行う 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合
縁を軽く叩い 気泄を抜い く
*1 FastStart Universal Probe Master (Rox)
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う直前
液を試料管 底 集 い 使用 た 分注 際
以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 SSIIb 3-5’及びSSIIb 3-3’
配列 以 あ
SSIIb 3-5’ 5’-CCAATCCTTTGACATCTGCTCC-3’ SSIIb 3-3’ 5’-GATCAGCTTTGGGTCCGGA-3’
代わ 対象 対 SSIIb-3 25 µmol/L 0.032 µLを用い い
*3 P35S 1-5’ 及びP35S 1-3’
配列 以 あ
P35S 1-5’ 5’-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3’ P35S 1-3’ 5’-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3’
代わ 対象 対 P35S-1 25 µmol/L 0.1 µLを用い い
*4 NOS ter 3-5’及びNOS ter 2-3’
配列 以 あ
NOS ter 3-5’ 5’-GCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGAC-3’ NOS ter 2-3’ 5’-CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGT-3’
*5 SSIIb-TaqV
蛍 色素 VIC 標識 い 配列 以 あ
5’-VIC-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA-3’ *6 P35S-Taq
蛍 色素 FAM 標識 い 配列 以 あ
5’-FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-TAMRA-3’ *7 NOS-Taq
蛍 色素 FAM 標識 い 配列 以 あ
5’-FAM-AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-TAMRA-3’ *8 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存
氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注
内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分
注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合
操作法 通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*9 対象 対 対象 混合溶液
SSIIb 3-5’ 0.2 µmol/L SSIIb 3-3’ 0.2 µmol/L P35S 1-5’ 0.625 µmol/L P35S 1-3’ 0.625 µmol/L NOS ter 3-5’ 0.75 µmol/L NOS ter 2-3’ 0.75 µmol/L
う水 希釈 サ を用い 十分 混合 調製
た 本混合液 凍結保存 能 あ 凍結融解を繰 返 避け
*10 分注必要数
標準試料液 1 及び ン 試料液 1 計2 DNA試料液 数を
加えた数
*11 96 及び ン タ
LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, white Roche Diagnostics社 及び
LightCycler® 480 Sealing Foil Roche Diagnostics社 を使用
LightCycler® 480 Sealing Foil LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, white 付属 い
2.2.2.2.2. 情報 設定 LightCycler® 96及びLightCycler® 480
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う
目 検体 配置 種類及び 特性 あ 具体的 新規 上
調製 た 配置 対応 う 気を付け 検体 種類
Negative control ン 試料液 Unknown DNA試料液 設定を行
う 際 一 溶液 分注 た3 を選択 た状態 名称を入力
く た 特性 関 VIC SSIIb FAM
P35S+TNOSを割 当 *
* あ Detection Format VIC FAM を選択 く
2.2.2.2.3. PCR LightCycler® 96及びLightCycler® 480
装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温 タ 法 応を開始 後 95°C 30秒間 59°C 1分30秒
間を1サ 40サ 増幅 応を行う 応 終了 い
を確認 た後 測定結 解析を行う
2.2.2.2.4. PCR結 解析 LightCycler® 96及びLightCycler® 480
解析 PCR装置付属 行う* 各々 DNA試料液 け
SSIIb及びP35S+TNOS 均Cq値 3 分 を算出 SSIIb け 均Cq値 P35S け 均Cq値 差［ΔCq = Cq(P35S+TNOS) –
Cq(SSIIb)］を算出
2.2.2.3. 結 定
混入率 5%を超え 能性 あ う 定 分析試料 標準試料 ΔCq
値を比較 行う わ 分析試料 ΔCq値 標準試料 ΔCq値以上 あ 場
合［ΔCq(分析試料) – ΔCq(標準試料) 0］ 分析試料 け 遺伝子組換え
コ 混入率 5%以 あ 定 分析試料 ΔCq値 標準試料 ΔCq値
い場合［ΔCq(分析試料) – ΔCq(標準試料) < 0］ 分析試料 け 遺伝子組
換え コ 混入率 5%以上 あ 能性 あ 定 混入率 5%
以上 あ 能性 あ 定 た場合 粒単 検査法又 検査法を
実施
2.2.3. 粒単 検査法
コ 穀粒試料 92粒を ン サン ン 以 手 従 遺
伝子組換え穀粒を検知 試験有効粒数90粒 け 粒数を定量 遺伝子組
換え穀粒 混入率を
遺伝子組換え穀粒 粒数 92粒 試験有効粒数90粒 中 3以上9以
場合 2回目 92粒 粒単 検査法を行い 1回目 2回目 総和184粒 試
験有効粒数180粒 け 遺伝子組換え穀粒 粒数を定量 混入率を
本法 適用機種 LightCycler® 96 あ *
* 他 タ PCR機器 ABI PRISM® 7900 ABI PRISM®
7700 ABI PRISM® 7000 Applied Biosystems® 7500 LightCycler® 480等
適用 能 あ 考え 使用 機器 操作 条件 感度等 異
GM コ セ DNA溶液又 GM コ 陽
性コン DNA溶液を用い 前 PCR用 応液 調製法 PCR
条件 解析方法を最適化 必要 あ
2.2.3.1. チ タ PCRを用いた定性検知法
コ 陽性対照用 対及び 2.2.2.2. 様 あ
各粒由来DNA試料液 1 92試料 92 たPCR ン
応液 必 DNA試料液を加え い を2 分 GM コ
セ DNA溶液又 GM コ 陽性コン
DNA溶液 2 分 合計96 分析を行う
2.2.3.1.1. PCR 用 応液 調製
PCR用 応液組成及び調製方法 2.2.2.1.1. 及び2.2.2.2.1. 様 あ た PCR用 タ 2ェDirectAce qPCR Mix No ROX ニ
*1 DirectAce qPCR Mix plus ROX Tube
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う
注意 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う直前
必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心 溶
液を試料管 底 集 い 使用 た 分注 際
以後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入 ABI
PRISM® 7900 ABI PRISM® 7700 ABI PRISM® 7000 ROX 必要
タ PCR機器を使用 場合 本試薬 添付 い ROXを
添付 ニ 従い適量を添加
2.2.3.1.2. 情報 設定
2.2.2.2.2. 様 行う
2.2.3.1.3. PCR
2.2.2.2.3. 様 行う
2.2.3.1.4. PCR結 解析
解析 PCR装置付属 行い LightCycler® 96 い
SSIIb及びP35S+TNOS Minimal EPFを0.1 設定 SSIIb検知試験及び
P35S+TNOS検知試験 両方 い 38 Cq値 得 たDNA試料液
遺伝子組換え穀粒 由来 定 一方 SSIIb検知試験 い 38
Cq値 得 P35S+TNOS検知試験 い 38 Cq値 得
たDNA試料液 非遺伝子組換え穀粒 由来 定 た SSIIb検
知試験 い 38 Cq値 得 た場合 当該DNA試料液 対
チ タ PCRを用いた粒単 定性検知法以降 操作
を再度行い 様 結 場合 DNA試料液 結 を無効
SSIIb検知試験 い 38 Cq値 得 たDNA試料液 け
試験 有効 断 92粒 DNA試料液中 90粒以上 DNA 試料液 有効
た場合 本試験 成立 後 有効 たDNA試料液 結
遺伝子組換え穀粒 非遺伝子組換え穀粒 数を測定 89粒以 DNA 試
料液 有効 た場合 本試験 不成立 改 92粒 ン サン
ン を行い 2.5.4. コ 粒単 検査法 た DNA試料液調製 試験を再度実施
2.2.3.2. 結 定
2.2.3.1.4. 得 た結 い 92粒 試験有効粒数90粒 中 け 遺
伝子組換え穀粒 粒数 2以 あ 適 分別生産流通管理 行わ た
遺伝子組換え穀粒 粒数 3以上9以 2回目を行 た場合 1回目 2回 目 総和 184粒 試験有効粒数180粒 中 け 遺伝子組換え穀粒 粒数 9以
あ 適 分別生産流通管理 行わ た 断
1回目 結 け 遺伝子組換え穀粒 粒数 10以上 試料 又 1回目 2
回目 総和184粒 試験有効粒数180粒 中 け 遺伝子組換え穀粒 粒数 10
以上 試料 い 不適 分別生産流通管理 行わ いた 能性 あ
2.2.4. 検査法
コ 穀粒試料 ン サン ン を行い 穀粒20粒
を10 用意 2.5.5 載 方法 各 DNA試料液を調製
各 遺伝子組換え穀粒 含 い 否 を タ PCR 定
遺伝子組換え穀粒を含 数 遺伝子組換え穀粒 混入率を評価
10 中遺伝子組換え穀粒を含 7以上 場合 2回
目 10 分析を行い 1回目 2回目 総和 あ 20 中 遺伝子
組換え穀粒を含 数を決定 混入率を評価 本法 適用機種 ABI
PRISM® 7900 Applied Biosystems® 7500 あ
2.2.4.1. チ タ PCRを用いた定性検知
Cauliflower mosaic virus由来 35S promoter P35S 及びAgrobacterium
tumefaciens由来 nopaline synthase遺伝子 terminator TNOS を標的
チ タ PCRを用い 遺伝子組換え穀粒を検出
を遺伝子組換え検出 応 た 各DNA試料 PCRを行う
を確認 た コ 内 性遺伝子 タ チ ンタ IIb SSIIb
遺伝子 検出 人 的 添加 た微量 検出 Internal Positive
Control IPC を チ タ PCR 行う を対照 応
遺伝子組換え検出 応 対照 応 各DNA試料液 1
た陽性コン GM コ 陽性コン を加え
を1 陰性コン 水を加え を1 合計12
分析を行う
2.2.4.1.1. 応液 調製
ABI PRISM® 7900を使用 場合 以 応液を調製
遺伝子組換え検出 応 1 当た 2ェDirectAce qPCR Mix No ROX *1
12.5 µL 対象 対 P35S-1*2 25 µmol/L 0.5 µL NOS ter-2*2
25 µmol/L 0.5 µL 対象 P35S-TaqFB*3 10 µmol/L 0.25
µL NOS-TaqFB*3 10 µmol/L 0.25 µL DirectAce qPCR Mix付属50ェROX Passive Reference溶液0.5 µLを混合 水 22.5 µL 組成 必要
