均質 粉砕 た試料 2 gをポ ン製遠沈管 50 mL容 量 採
CTAB 衝液*115 mLを入 組織 見え く 均一化
遠沈管 縁 先を洗浄 う CTAB 衝液 30 mLを加
え 転倒混和後55°C 30分間放置 *2 い 放置液を撹拌 均質化 た溶
液600 µLを 遠沈管 1.5 mL容 量 採 い 500 µL
/ 混合液*3を加え 転倒混和後 サ 軽く懸 7,500ェg 15 分間室温遠心後 水層 上層 を新 い 遠沈管 移 時中間層 触
い う 注意 / コ 混合液*4 500 µLを加
え 転倒混和後 サ 軽く懸 7,500ェg 15分間室温 遠心後 水層
上層 を新 い 遠沈管 移 等容量 コ 室
温 を加え 転倒混和後7,500ェg 10分間室温遠心 カン ン 上清
を捨 500 µL 70% タ を壁面 静 加え 7,500ェg 1分間室
温遠心 沈殿 触 い う 限 タ を吸い 捨
後 2～3分間真空乾燥 完全 乾燥 い う 注意 50 µL TE 衝液*5を加え く混和後 室温 15分間放置 時々転倒混和 完全
溶 RNase A 5 µLを加え 37°C 30分間放置 200 µL CTAB 衝 液を加えた後 250 µL / コ 混合液を加え 転倒混
和後 サ 軽く懸 7,500ェg 15分間室温遠心後 水層 上層 を新
い 遠沈管 移 中間層 触 い う 採 200 µL
コ を加え 転倒混和 7,500ェg 10分間 室温
遠心 カン ン 上清を捨 い 200 µL 70% タ を壁
面 静 加え 7,500ェg 1分間室温遠心 沈殿 触 い う 限
タ を吸い 捨 後 2～3分間真空乾燥 完全
乾燥 い う注意 50 µL 水を加え 混合 た後 15分間室温 放置
時々転倒混和 完全 溶解 た をDNA試料原液*6
*1 CTAB 衝液
ビ カ 0.5 mol/L EDTA pH8.0 8 mL 1mol/L Tris-HCl pH8.0 20 mL 5 mol/L食塩水56 mLを入 約150 mL う 水を加え 撹拌
CTAB 4 gを加え 完全 溶解 水を加え全量を200 mL
滅菌 た をCTAB 衝液
*2 を使用 い場合 サ を用い 試料塊
い う く混合 際 15 mL CTAB 衝液を加え十
分 混合 た後 CTAB 衝液 30 mLを加え混合 混合後 加温
処理以降 操作 従う
*3 / 混合液
1 mol/L Tris-HCl pH8.0 飽和 / コ
混合液を1 1 v/v 混合 た を / 混合液
*4 / コ 混合液
コ を24 1 v/v 混合 た を
/ コ 混合液
*5 TE 衝液
各最終濃度 10 mmol/L Tris-HCl pH8.0 1 mmol/L EDTA pH8.0 う 水を用い 調製 た をTE 衝液
*6 定量PCR 供 際 DNA試料液 TE 衝液を用い DNAを溶解 濃 度を調製 た た 定量PCR法を実施 を目的
DNA 出を行う場合 真空乾燥 た沈殿 50 µL TE 衝液を加え 混合 た後 4°C 一晩保存 完全 溶解 DNA試料原液
2.5.1.2. カ 膜タ 法 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit:
コ 適用
均質 粉砕 た試料2 gをポ ン製遠沈管 50 mL容 量 採 あ 65°C 温 いたAP1 衝液*110 mL RNase A 20 µLを加え 試料 塊 い う サ く混合 65°C 15分間加温
間2 3回 遠沈管を 転 試料を撹拌 P3 衝液*2 3,250 µLを加 え 氷上 10分間静置 た後 4,000ェg以上 4°C 条件 20分間遠心 *3
い 上清 500 µLをQIAshredder spin column 負荷 10,000ェg以上 4分間遠心後 溶出液を遠沈管 15 mL容 移 操作を再度繰 返 た 後 溶出液 1.5倍量 AW1 衝液*4を加え 混合液500 µLをmini spin column 負荷 10,000ェg以上 1分間*5遠心 残 混合液 う
500 µLを mini spin column 負荷 条件 遠心 溶出液を捨 最終的 混合液 全 く 様 操作を繰 返 い AW2 衝液
*6 500 µLを負荷 10,000ェg以上 1分間遠心 溶出液を捨 様 操作 を計3回繰 返 溶出液を捨 mini spin columnを乾燥 た 10,000ェ g以上 20分間遠心 mini spin columnを 遠沈管 移 あ
65°C 温 いた水70 µLを加え 5分間静置 た後 10,000ェg以上 1分間 遠心 DNAを溶出 う一度水を加え 操作を行い 得 た溶出液を合 わ DNA試料原液*7
*1 AP1 衝液
カ 膜タ QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 付属 又 別途購入 た を用い
*2 P3 衝液
カ 膜タ QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 付属 又 別途購入 た を用い
*3 遠心後 上清
上清を確認 澄明 い場合 条件 遠心操作を再度繰 返 以降 操作を行う
*4 AW1 衝液
使用 直前 容器 ベ 載 た適量 タ 96-100% を混合
た をAW1 衝液
*5 遠心時間
mini spin column 負荷 液 性状 カ 通遃 時間
あ 全 液 カ を通遃 必要 遠心時間を適宜 調整
*6 AW2 衝液
使用 直前 容器 ベ 載 た適量 タ 96-100% を混合
た をAW2 衝液
*7 定量PCR 供 際 spin column 乾燥以降 操作を 変更 行う
mini spin columnを 遠沈管 移 あ 65°C 温 いた
TE 衝液70 µLを加え 5分間静置 た後 10,000ェg以上 1分間遠心
DNAを溶出 う一度TE 衝液を加え 操作を行い 得 た溶出液 を合わ DNA試料原液
2.5.1.3. カ 膜タ 法 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit:
適用
均質 粉砕 た試料 1 gをポ ン製遠沈管 50 mL容 量 採 あ 65°C 温 いたAP1 衝液*1 10 mL RNase A 20 µLを加え 試料 塊 い う サ く混合 65°C 1時間加温
間5 6回 遠沈管を 転 試料を撹拌 ン 式遠心分 機を使用
3,000ェg 室温 条件 10分間遠心後 上清 7 mLを ポ ン製
遠沈管 15 mL容 移 P3 衝液*2 2,500 µLを加え サ
10秒間 く撹拌 氷上 15分間静置後 ン 式遠心機 3,000ェg以 上 室温 条件 35分間遠心 *3 得 た上清 う 8 mLを新 い15 mLチ
移 サ を用い 撹拌 た後 500 µLをQIAshredder
spin column 負荷 10,000ェg以上 4分間遠心後 溶出液を遠沈管 15 mL
容 移 溶出液 1.5倍量 AW1 衝液*4を加え 混合液 500 µLを
mini spin column 負荷 10,000ェg以上 1分間*5遠心 残 混合液
う 500 µLを mini spin column 負荷 条件 遠心 溶出液を
捨 最終的 混合液 全 く 様 操作を繰 返 い AW2 衝液*6 500 µLを負荷 10,000ェg以上 1分間遠心 溶出液を捨 様 操作を計3回繰 返 溶出液を捨 mini spin columnを乾燥 た
10,000ェg以上 20分間遠心 mini spin columnを 遠沈管 移 あ 65°C 温 いた水70 µLを加え 5分間静置 た後 10,000ェg以上 1分間遠心 DNAを溶出 う一度水を加え 操作を行い 得 た溶 出液を合わ DNA試料原液*7
*1 AP1 衝液
カ 膜タ QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 付属 又 別途購入 た を用い
*2 P3 衝液
カ 膜タ QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 付属 又 別途購入 た を用い
*3 遠心後 上清
上清を確認 澄明 い場合 条件 遠心操作を再度繰 返 以降 操作を行う
*4 AW1 衝液
使用 直前 容器 ベ 載 た適量 タ 96-100% を混合
た をAW1 衝液
*5 遠心時間
mini spin column 負荷 液 性状 カ 通遃 時間
あ 全 液 カ を通遃 必要 遠心時間を適宜 調整
*6 AW2 衝液
使用 直前 容器 ベ 載 た適量 タ 96-100% を混合
た をAW2 衝液
*7 定量PCR 供 際 spin column 乾燥以降 操作を 変更
行う
mini spin columnを 遠沈管 移 あ 65°C 温 いた
TE 衝液70 µLを加え 5分間静置 た後 10,000ェg以上 1分間遠心
DNAを溶出 う一度TE 衝液を加え 操作を行い 得 た溶出液 を合わ DNA試料原液
2.5.1.4. カ 膜タ 法 NIPPON GENE GM quicker: コ 適用
均質 粉砕 た試料 1 gをポ ン製遠沈管 50 mL容 量 採 GE1 衝液*1 6 mL RNase A 20 µLを加え 試料塊 い う
サ 30秒間混合 た後*2 室温 10分間静置 GE2 衝液*3 750 µLを加 え 10～12回転倒混和 *4 氷上 10分間静置 5,000ェg以上 4°C 条件
10分間遠心*5 い 上清*6 400 µLを1.5 mLチ 移 GB3 衝液 50 µL及び タ 100% 200 µLを添加 た後 10～12回転倒混和
*7 混合液 650 µL 全量 をspin column 負荷 た後 13,000ェg以上 4°C 条件 30秒間遠心 溶出液を捨 い GW 衝液600 µLを負荷
13,000ェg以上 4°C 条件 1分間遠心 溶出液を捨 spin columnを乾燥 た 13,000ェg以上 4°C 条件 3分間遠心 spin columnを新た 1.5 mL容チ 移 水 50 µLを加え3分間室温 静置 た後 13,000ェg以 上 1分間遠心 得 た溶出液をDNA試料原液*8
*1 GE1 衝液
カ 膜タ NIPPON GENE GM quicker 付属 又
別途購入 た を用い
*2 撹拌操作 不十分 あ DNA 収量 著 く減少 対
50ｍL容チ を垂直 あ 30秒間 撹拌 撹
拌 不十分 場合 30～60秒間撹拌
*3 GE2 衝液
カ 膜タ NIPPON GENE GM quicker 付属 又
別途購入 た を用い
*4 発生 た泄 チ 内 残 い 続け GE2 衝液を添加
能 あ 出液 性 生 い 添加 たGE2 衝液 十分 均一 う混合
*5 使用 タ 及び50 mL容チ 特性を考慮 たうえ g 最大
う 遠心条件を設定
*6 沈殿や浮遊物等を 能 限 い う 上清を回収 た 上清 4
mL程分 能 あ 4°C 条件 あ 数日 定 あ
後 試験 あわ DNA 再 出 精製 必要 た場合 本上清を 用い 以降 操作を実施
*7 GB3 衝液を添加 続い タ 100% を添加 た後 撹拌操作を
行う 析出物 生 白 い 場合 液 透明 十分転倒混和
*8 定量PCR 供 際 spin column 乾燥以降 操作を 変更
行う
spin columnを新た 1.5 mL容チ 移 TE 衝液 50 µLを加え3 分間室温 静置 た後 13,000ェg以上 1分間遠心 得 た溶出液をDNA 試料原液
2.5.1.5. カ 膜タ 法 NIPPON GENE GM quicker: 適 用
均質 粉砕 た試料 1 gをポ ン製遠沈管 50 mL容 量 採 GE1 衝液*1 12 mL RNase A 40 µLを加え 試料塊 い う
サ 30秒間混合 た後*2 室温 10分間静置 GE2 衝液*3 1,500 µLを 加え 10～12回転倒混和 *4 氷上 10分間静置 5,000ェg以上 4°C 条 件 10分間遠心 *5 い 上清*6 700 µLを2.0 mLチ 移 GE3
衝液250 µL及び 100% 250 µLを添加 た後 10～12回転 倒混和 *7 混合液600 µLをspin column 負荷 13,000ェg以上 4°C 条 件 30秒間遠心 溶出液を捨 残 混合液全量を spin column 負荷
条件 遠心 溶出液を捨 い GW 衝液600 µLを負荷 13,000 ェg以上 4°C 条件 1分間遠心 溶出液を捨 spin columnを新た 1.5 mL容チ 移 水50µLを加え 3分間室温 静置 た後 13,000ェg以上
1分間遠心 得 た溶出液をDNA試料原液*8
*1 GE1 衝液
カ 膜タ NIPPON GENE GM quicker 付属 又
別途購入 た を用い
*2 撹拌操作 不十分 あ DNA 収量 著 く減少 対
50 mL容チ を垂直 あ 30秒間 撹拌 撹
拌 不十分 場合 30～60秒間撹拌
*3 GE2 衝液
カ 膜タ NIPPON GENE GM quicker 付属 又
別途購入 た を用い
*4 発生 た泄 チ 内 残 い 続け GE2 衝液を添加
能 あ 出液 性 生 い 添加 たGE2 衝液 十分 均一 う混合
*5 使用 タ 及び50 mL容チ 特性を考慮 たうえ g 最大
う 遠心条件を設定
*6 沈殿や浮遊物等を 能 限 い う 上清を回収 た 上清 8
mL程分 能 あ 4°C 条件 あ 数日 定 あ
後 試験 あわ DNA 再 出 精製 必要 た場合 本上清を 用い 以降 操作を実施
*7 GB3 衝液を添加 続い を添加 た後 撹拌操作を行
う 析出物 生 白 い 場合 液 透明 十分転倒混和
*8 定量PCR 供 際 spin column 乾燥以降 操作を 変更
行う
spin columnを新た 1.5 mL容チ 移 TE 衝液 50 µLを加え3 分間室温 静置 た後 13,000ェg以上 1分間遠心 得 た溶出液をDNA 試料原液
2.5.1.6. カベ ンタ 法 Promega Wizard DNA Clean-up System
均質 粉砕 た試料2 gをポ ン製遠沈管 50 mL容 量 採
出用 衝液*1 17.2 mL 5 mol/L ニ ン-塩酸2 mL及び20 mg/mL Proteinase
Kを0.8 mL加え く サ 撹拌後 55～60°C 振 う
3時間保温 い 室温 温度を 3,000ェg 10分間遠心
上清 い 場合 上清 一部を 遠沈管 1.5 mL容 移
14,000ェg 10分間遠心 得 た澄明 上清500 µL DNA
Clean-up Resin 1 mLを 遠沈管 1.5 mL容 採 転倒混和 混合液
mini column 上部 注射筒を付け ニ 吸引装置 装着
ニ コ を閉 吸引装置内部 十分 減 い を
確認 た後 混合液を注射筒 mini column 負荷 直 コ を開け 最速 減 吸引 溶液を完全 除去 い 2 mL 80% コ
を注射筒 加えカ を洗浄 注射筒を外 たmini columnを
遠沈管 1.5 mL容 装着 室温 10,000ェg 2分間遠心 カ を乾燥
mini columnを新 い 遠沈管 1.5 mL容 移 あ
65～70°C 温 いた水100 µLを滴 *2 1分間放置後 室温 10,000ェg 以上 1分間遠心 DNA を溶出 得 た溶出液をDNA試料原液
*1 出用 衝液
150 mmol/L NaCl 2 mmol/L EDTA及び1% SDSを含 10 mmol/L Tris-HCl 衝液 pH7.5
*2 定量PCR法 供 際 水 代わ あ 65～70°C 温 いた
TE 衝液100 µLを滴
2.5.2. 加工食品 DNA 出精製
食品表示基準第 条 規定 別表17 欄 及び コ 加工食品
DNA 出精製 以 手法 行う
試料 粉砕 用い 粉砕器 水分を含 試料 適 た粉砕器 乾燥試料 適 た粉砕器 あ 試料 性状 合わ 選択 た 粉砕器 刃 回
転 粉砕 を利用 遠心力 高速回転 タ
粉砕 超遠心粉砕器等 あ コンタ ン防 た 粉砕容器 カ タ 等 分解 洗浄 十分行え を用い 更 望 く 滅菌
良い 粉砕容器 カ タ 等 洗浄後 能 あ 滅菌 用い
超音泅 DNA を分解 使用 い
2.5.2.1. 載 方法 前処理を た後 2.5.2.2. 載 方法
DNAを 出精製 DNeasy Plant Maxi kitを使用 場合 1 g を採
加工食品 い 2.5.2.2.1. DNeasy Plant Maxi kit DNA 出A コ 加工食品 い 2.5.2.2.2. DNeasy Plant Maxi kit DNA 出B 従う QIAGEN Genomic-tip 20/Gを使用 場合 2 g を採
2.5.2.2.3. QIAGEN Genomic-tip 20/G DNA 出 従う CTABを用い 方法 場合 各 目 示 た試料量を採 2.5.2.2.4. CTABを用いたDNA
出 従う DNA 出 1試料当た 2併行 行う 加工食品 い 加工工程 DNA 分解 逭 い
示 た方法 分析 能 DNA 必 出 わけ い 留意 必 要 あ