装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件 以
あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温
タ 法 応を開始 後 95°C 30秒 59°C 1分を1サ
45サ 増幅 応を行う 応条件 設定 い 9600
emulation チ を入 く Remaining time 0分 い
を確認 応を終了 た後 測定結 解析を行う 2.3.3.4. 測定結 解析 定 ABI PRISM® 7000
遺伝子組換え 検知試験2試験及び 陽性対照試験 い い 結 定 Amplification plot上 指数関数的 増幅曲線 Ct値 確認 及 びmulticomponent上 対象蛍 色素由来 蛍 強度 FAM 指数関数的 明
確 増加 確認を 行う 遺伝子組換え 検知試験2試験 い 目視 Amplification plot上 指数関数的 増幅曲線 確認 た場合 遺伝子 組換え 陽性を疑う い ベ ンを3サ 15サ 設 定 ΔRn 幅 最大値 上側 定 た指数関数的 増幅曲線上 交わ
Threshold line Th 0.2 設定 た Th や指数関数的
い増幅曲線 交わ 場合 交わ い うThを適宜設定
Th Ct値 得 否 を解析
2併行 出 た DNA試料液 各2 い 以 結
定 従 定
各DNA試料液 い
(1) 陽性対照試験 2 並行全 43 Ct値 得 遺 伝子組換え 検知試験2試験い 2 並行全 43 Ct値
得 た場合 当該試料 陽性 定
(2) 陽性対照試験 2 並行全 43 Ct値 得 遺 伝子組換え 検知試験2試験い 2 並行全 43 Ct値 得 い場合 当該試料 陰性 定
(3) 陽性対照試験 2 並行全 43 Ct値 得 遺 伝子組換え 検知試験2試験 う 一方 2 並行全 43 Ct 値 得 う一方 2 並行全 一致 た結 得 い場合 又 遺伝子組換え 検知試験2試験い 2 並行全 一致 た結
得 い場合 再度 検体 2.5.2. 加工食品 DNA 出精
製 以降 操作を行い 定
2併行 出 た両方 DNA試料液 合計4 い 陽性 定 た検
体を陽性 断 少 く 一方 DNA試料液 い 陰性 定 た検体を 陰性 断 (3) 場合 再 出精製 たDNA試料液 い 陽性 定
得 い場合 遺伝子組換え 陰性 定 上 定 遺
伝子組換え 陽性 定 た結 い multicomponentを解析 目視 FAM又 VIC 蛍 強度 指数関数的 増加 観察 ROX 蛍 強度 明 確 降やFAM又 VIC 蛍 強度 や 上昇 い を確認
た 陽性対照試験 少 く 1 43 Ct値 得 い
DNA試料液 い 再度 検体 2.5.2. 加工食品 DNA 出精
製 以降 操作を行い 陽性対照試験 少 く 1 43
Ct値 得 い場合 本試料 検知 不能
2.3.4. Applied Biosystems® 7500を用いた定性PCR 2.3.4.1. PCR用 応液 調製
PCR用 応液 25 µL/well 調製 組成 以 あ
TaqMan® Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific社 *1 12.5 µL
対象 対溶液 各 25 µmol/L 0.5 µL 対象 溶液 10 µmol/L 0.5 µL 水9 µL 20 ng/µL DNA試料液2.5 µL 50 ng 又 滅菌水
ン 試料液 NTC 2.5 µL*2 分注操作終了後 真上 完全
を密閉 わ 寄 い う注意 専用 ン 用
タ を用い 行う*3 最後 底を観察 底 気泄 あ 場合
縁を軽く叩い 気泄を抜い く DNA試料液当た 遺伝子組換え 検知 試験2試験及び 陽性対照試験を 2 並行 行う
*1 TaqMan® Universal PCR Master Mix
本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行わ う 注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ 使う直前
必 サ を用い 3秒程度混合 た後 軽く遠心 溶液
を試料管 底 集 い 使用 た 分注 以
後撹拌 遠心 困 を考慮 底 確実 入
*2 定性PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存 氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注 内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合 操作法
通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*3 96 及び ン タ
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific社 及 びMicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific社 を使用
ン 細 い 製品付属 ニ を参考 2.3.4.2. 情報 設定 Applied Biosystems® 7500
応 際 情報 設定を行わ け い 設定を行う 目 検体 配置 種類及び 特性 あ 特性 設定を行 う 特性 Detector Manager 面上 Reporter FAM Quencher
TAMRA う設定 * 設定 たDetectorをWell Inspector 録
た後 セ を用い 測定を行う 全 を指定
検体 配置 種類を指定 具体的 調製 た 配置
対応 う 気を付け 検体 種類 Standard 検量線用標準
DNA溶液 NTC ン 試料液 Unknown DNA試料液 をTask欄 い 指定 たPassive Referenceを ROX 設定
* Detector 設定
Detector 各 セ 対 設定 く 良い
2.3.4.3. PCR Applied Biosystems® 7500
装置 をセ 応 タ 込 を開始 応条件 以
あ 50°C 2分間 条件 保持 た後 95°C 10分間加温
タ 法 応を開始 後 95°C 30秒 59°C 1分を1サ
45サ 増幅 応を行う 応条件 設定 い RUN Mode
を9600 emulation 設定 RUN 終了を知 The run completed
successfully 表示を確認 応を終了 た後 測定結 解析を行う
2.3.4.4. 測定結 解析 定 Applied Biosystems® 7500
遺伝子組換え 検知試験2試験及び 陽性対照試験 い い 結 定 Amplification plot上 指数関数的 増幅曲線 Ct値 確認 及 びmulticomponent上 対象蛍 色素由来 蛍 強度 FAM 指数関数的 明 確 増加 確認を 行う 遺伝子組換え 検知試験2試験 い 目視 Amplification plot上 指数関数的 増幅曲線 確認 た場合 遺伝子 組換え 陽性を疑う い ベ ンを3サ 15サ 設 定 ΔRn 幅 最大値 上側 定 た指数関数的 増幅曲線上 交わ
Threshold line Th 0.2 設定 た Th や指数関数的
い増幅曲線 交わ 場合 交わ い うThを適宜設定
Th Ct値 得 否 を解析
2併行 出 た DNA試料液 各2 い 以 結
定 従 定
各DNA試料液 い
(1) 陽性対照試験 2 並行全 43 Ct値 得 遺 伝子組換え 検知試験2試験い 2 並行全 43 Ct値
得 た場合 当該試料 陽性 定
(2) 陽性対照試験 2 並行全 43 Ct値 得 遺 伝子組換え 検知試験2試験い 2 並行全 43 Ct値 得 い場合 当該試料 陰性 定
(3) 陽性対照試験 2 並行全 43 Ct値 得 遺 伝子組換え 検知試験2試験 う 一方 2 並行全 43 Ct 値 得 う一方 2 並行全 一致 た結 得 い場合 又 遺伝子組換え 検知試験2試験い 2 並行全 一致 た結
得 い場合 再度 検体 2.5.2. 加工食品 DNA 出精
製 以降 操作を行い 定
2併行 出 た両方 DNA試料液 合計4 い 陽性 定 た検
体を陽性 断 少 く 一方 DNA試料液 い 陰性 定 た検体を 陰性 断 (3) 場合 再 出精製 たDNA試料液 い 陽性 定
得 い場合 遺伝子組換え 陰性 定 上 定
遺伝子組換え 陽性 定 た結 い multicomponentを解析 目 視 FAM又 VIC 蛍 強度 指数関数的 増加 観察 ROX 蛍 強度 明確 降やFAM又 VIC 蛍 強度 や 上昇 い を確認
た 陽性対照試験 少 く 1 43 Ct値 得 い
DNA試料液 い 再度 検体 2.5.2. 加工食品 DNA 出精
製 以降 操作を行い 陽性対照試験 少 く 1 43
Ct値 得 い場合 本試料 検知 不能
2.3.5. Roche LightCycler Systemを用いた定性PCR
2.3.5.1. PCR用 応液 調製 Roche LightCycler System
PCR用 応液 20 µL/ 調製 組成 以
あ LC- FastStart DNA Master Hybridization Probes*1 2 µL 対象 対 溶液 各 25 µmol/L 0.4 µL 対象 10 µmol/L 0.4 µL 水 9.8 µL MgCl2溶液 25 mM 2.4 µL 10 ng/µL DNA試料液5 µL 50 ng 又 滅
菌水 ン 試料液 NTC 5 µL*2 分注操作終了後 真上 蓋を 完全
を密閉 最後 遠心操作*3を行い 混合液を
充填 DNA試料液当た 遺伝子組換え 検知試験2試験及び 陽性
対照試験を 2 並行 行う
*1 LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes
LC-FastStart Enzyme 1a red cap LC-FastStart Reaction Mix
Hybridization Probes 1b colorless cap を混合 調製 調製 た LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes 4℃ 一逬間 保存 能 あ た 本試薬 性 高いた 混合操作を行う際 混合 確実 行 わ う 注意を要 不十分 場合 PCR う くい い場合 あ
*2 定量PCR用 応液 調製
冷凍庫 出 た試薬類 必要 室温 融解後 氷上 保存 氷上 保存 た試薬 一 チ を用い連続分注 内 空気 冷却 た 2回目以降 通常 操作 正確 分注 い 注意 説明書 書 た 温試料を扱う場合 操作法
通常 ふ 呼 操作 を理解 使用
*3 遠心操作
遠心操作 破損を避け た 専用 カ セ 遠心機を使用 行う 又 汎用 遠心機を使用 場合 700ェg以 条 件 行う 遠心操作 い 関わ 装置本体 セ 前
をカ セ 装填 際 破損 十分注意
セ
2.3.5.2. 情報 設定 Roche LightCycler System
応 際 情報 設定を行わ け い 具体的
サン 作成 面上 調製 た 配置 カ セ 上 配
置 対応 う 気を付け 検体 種類 Negative ン 試料
液 Unknown DNA試料液 をType欄 い 指定 た Seek
Temperatureを30℃ 設定 Maximum Position カ セ 装填 た 最大 置番号を入力
2.3.5.3. PCR Roche LightCycler System
装置 カ セ をセ 応 タ 込 を開始 応条件
以 あ 95°C 10分間 条件 加温 た タ 法 応
を開始 た後 95°C 15秒 59°C 30秒 1°C /秒 *1を1サ 50サ
増幅 応を行う 増幅 応終了後 40°C 30秒 条件 保 タ 込
増幅 応 各サ 終了時 行わ う設定 *2
*1 加温 冷却速度
示 い 以外 加温 冷却 速度 20°C /秒
*2 タ 込 設定
タ 込 設定 実際 サ タ 面 い 59°C
30秒 設定 たカ い Acquisition Mode を Single 設定 2.3.5.4. 測定結 解析 定 Roche LightCycler System
応 終了 い を確認 た後 Fit Points法 を用い 解析を行う
2併行 出 た DNA試料液 各2 い 以
結 定 従 定
各DNA試料液 い
(1) 陽性対照試験 2並行全 48 Ct値 得 遺伝子組 換え 検知試験2試験い 2並行全 48 Ct値 得 た場 合 当該試料 陽性 定
(2) 陽性対照試験 2並行全 48 Ct値 得 遺伝子組 換え 検知試験2試験い 2並行全 48 Ct値 得 い場 合 当該試料 陰性 定
(3) 陽性対照試験 2並行全 48 Ct値 得 遺伝子組 換え 検知試験2試験 う 一方 2並行全 48 Ct値 得
う一方 2並行全 一致 た結 得 い場合 又 遺伝子組換え 検知試験2試験い 2並行全 一致 た結 得 い場合
再度 検体 2.5.2. 加工食品 DNA 出精製 以降 操作を行い
定
2併行 出 た両方 DNA試料液 合計4 い 陽性 定 た検 体を陽性 断 少 く 一方 DNA試料液 い 陰性 定 た検体を 陰性 断 (3) 場合 再 出精製 たDNA試料液 い 陽性 定
得 い場合 遺伝子組換え 陰性 定 上 定
遺伝子組換え 陽性 定 た結 い multicomponentを解析 目 視 FAM又 VIC 蛍 強度 指数関数的 増加 観察 ROX 蛍 強度 明確 降やFAM又 VIC 蛍 強度 や 上昇 い を確認
た 陽性対照試験 少 く 一方 48 Ct値 得
いDNA試料液 い 再度 検体 2.5.2. 加工食品 DNA
出精製 以降 操作を行い 陽性対照試験 少 く 一方
48 Ct値 得 い場合 本試料 検知 不能
2.4. コ 加工食品 検査法
コ 加工食品 い 2併行 出 た DNA試料液 対 コ 穀粒 様 内 性遺伝子 あ starch synthase IIb SSIIb 遺伝子 コ 陽性対照試験 並び 遺伝子組換え コ 広く共通 存 組 換え配列 あ Cauliflower mosaic virus由来 35S promoter P35S 及び
Agrobacterium tumefaciens由来 nopaline synthase遺伝子 terminator TNOS 遺伝子組換え コ 検知試験* を 時 検出 チ タ
PCRを行う た 加工食品 遺伝子 加工遃程 DNA分解率 一定
いた 正確 定 い た コ 加工食品 い
チ タ PCRを用いた定性PCRを実施 遺伝子組換え食品混入 有無 い 定
* 本検査 SSIIbを検出 VIC 標識 い P35S TNOSを
検出 FAM 標識 い た 遺伝子量 合計
P35S+TNOS 相当 蛍 値 得
2.4.1. ABI PRISM® 7900HT 96 wellを用いた定性PCR
2.4.1.1. PCR用 応液 調整 ABI PRISM® 7900HT 96 well
PCR用 応液 10 µL/well 調製 組成 以 あ
FastStart Universal Probe Master (Rox) Roche Diagnostics *1 5 µL 対象 SSIIb 3-5’ 50 µmol/L 0.016 µL*2 SSIIb 3-3’ 50 µmol/L 0.016 µL*2 P35S 1-5’ 50 µmol/L 0.05 µL*3 P35S 1-3’ 50 µmol/L 0.05 µL*3 NOS ter 3-5’ 50 µmol/L 0.06 µL*4 NOS ter 2-3’ 50 µmol/L 0.06 µL*4 対象
SSIIb-TaqV 10 µmol/L 0.08 µL*5 P35S-Taq 10 µmol/L 0.1 µL*6 NOS-Taq 10 µmol/L 0.12 µL*7 水3.448 µL 20 ng/µL DNA試料液1