氏 名
学 位 専 攻 分 博士 理学
学 位 記 番 総研大 第
学位授与の日付 成 ６ 月 日
学位授与の要件 生命科学研究科 基礎生物学専攻
学位規則第６条第 該当
学 位 論 文 題 目
論 文 審 査 委 員 主 査 教授 藤森 俊彦 教授 慎 准教授 中 実 教授 相賀 裕美子
(Separate Form 2)
論 文 内 容 の 要 旨
Summary of thesis contents
Somitogenesis is the sequential formation of epithelial blocks of structures called somites at the anterior pre-somitic mesoderm in vertebrates, in an anterior to posterior direction. Somites are precursors to vertebrae, skeletal muscles, etc and are arrange on both sides of notochord. A “Clock and Wavefront” model is used to explain the complex mechanism of somite generation. A certain clock, controlled by the Notch/Delta signaling pathway, activates oscillating genes fr om posterior towards the anterior pre-somitic mesoderm, where the temporal information of the clock is converted to spatial patterning by the activation of genes such as Mesp. This region is defined by the wavefront of FGF signaling, where a subset of cell s are released from FGF signaling and become responsive to Notch signaling leading to formation of the presumptive somite boundary.
Previous studies with mouse embryos revealed that the presumptive somite boundary is periodically created at the anterior bo rder of the expression domain of Tbx6 protein at the anterior PSM. This Tbx6 anterior domain is also important for Mesp2 activation, and subsequent degradation of this domain is important for proper
positioning of the somite boundary. Ripply1 and Ripply2 are required for the determination of the Tbx6 protein border as mouse defective of Ripply1/2 genes showed anterior expansion of Tbx6 protein expression . Ripply deficient embryos also showed increased expression of Mesp2, indicating Ripply1/2 may act downst ream of Mesp2 in Tbx6 protein degradation. These findings indicate that Ripply1/2 are more direct mediators of Tbx6 degradation than Mesp2. However, the mechanism by which this Tbx6 domain is regulated remains unclear. Interestingly, studies in zebrafish a nd frog showed that Ripplys are able to suppress Tbx6 function at the transcription level, raising questions whether Ripply-mediated mechanism of Tbx6 regulation is
conserved among different species.
In this study, to test the generality of Tbx6 protein -mediated process in somite segmentation and to further examine the mechanism of regulation of Tbx6 protein, antibody against zebrafish Tbx6/Fss, previously referred to as Tbx24 , was generated. Consistent with the findings in mice, the anterior border of Tbx6 domain also coincides with the presumptive somite boundary and the tbx6 mRNA domain was located far anterior to its protein domain, indicating the possibility of post-transcriptional regulation. Interestingly, the anterior Tbx6 domain showed periodic expression with a temporary upper band, which coincided with the mesp expression, indicating Tbx6 is also important for mesp expression. When ripply1 was knockdown using morpholinos, somite boundaries were lost and Tbx6 protein expression domain was expanded anteriorly, but in a graded manner. In contrast, no significant phenotype and no expansion of Tbx6 domain were observed in ripply2 single morphants. However, when both ripply1 and ripply2 were knockdown, somite boundaries disappear similar to the ripply1 single morphants, but the Tbx6 domain was ubiquitously expanded anteriorly, indicating the redundancy in the function of ripply1 and ripply2. The tbx6 mRNA was also expanded but not so severely as the
Tbx6 protein.
I further demonstrated that Ripply could d irectly reduce the expression level of Tbx6 protein by co-injecting either zebrafish or mouse Tbx6 mRNA with zebrafish or mouse Ripply mRNA into zebrafish embryos and detecting the protein level. This Tbx6 reduction depends on physical interaction between Ripply and Tbx6, as zebrafish Ripply1 mutated at FPVQ amino acid site or mouse Ripply2 mutated at FPIQ site, important for interaction with Tbx proteins, failed to co -immunoprecipitate with either zebrafish or mouse Tbx6.
In mouse, Mesp2 is required for expression of both Ripply2 and Ripply1, so I
(Separate Form 2)
speculated the possibility of similar regulation or ripply in zebrafish. Using the hsp-Gal4/UAS-mesp-ba transgenic line, I over expressed mesp-ba and analyzed the expressions of ripply1 and rippy2. Interestingly, no significant change was observed in ripply2 expression, however, ripply1 was highly upregulated at least at the anterior pre-somitic mesoderm and somite regions, but not posteriorly. In addition, anterior domain of Tbx6 was highly reduced. This reductio n was rescued when ripply1 and ripply2 were both knockdown in these embryos, suggesting that mesp mediates ripply
reduction of Tbx6. Expectedly, the onset of ripply1 and ripply2 expression occurred after reduction of FGF signaling at the anterior PSM in normal zebrafish embryos, but this expression was initiated much earlier in embryos treate d with SU5402, an FGF inhibitor, indicating FGF is required for posterior inhibition of ripply.
My study, for the first time, reveals the expression patterns of zebrafi sh Tbx6 protein, and the importance of the Tbx6 anterior domain for somite boundary positioning in zebrafish. Most importantly, I showed that Ripply is a direct regulator of the Tbx6 reduction at the protein level, and this reduction is mediated by mesp. However, mesp is not sufficient to induce ripply unlike mouse, indicating some other factor apart from mesp may be involved in somite boundary formation in zebrafish.
博 士 論 文 審 査 結 果 要 旨
Summary of the results of the doctoral thesis screening
脊 椎 動 物 基 本 骨 格 過 程 体 節 呼 分 節 状 組 織 神 経 管
両 側 数 珠 状 列 を し 作 体 節 沿 軸 中 胚 葉 由 来 組 織 あ
脊 椎 骨 骨 格 筋 真 皮 発 生 体 節 体 軸 後 端 あ 未 分 節 中 胚 葉 一 定
時 間 間 隔 形 成 知 う 周 期 的 体 節 形 成 時 間 周
期 性 を 生 出 分 子 時 計 分 節 時 計 分 子 時 計 生 出 時 間 周 期 情 報 を 体 節 い う 空 間 周 期 性 を 持 形 態 変 換 機 構 必 要 あ わ い 時 間 周 期 空 間 周 期 変 換 未 分 節 中 胚 葉 前 方 側 起 分 節 時 計 時 間 情 報 を bHLH 型転写制 御因子 Mesp を含 一 連 分 子 経 路 周 期 的 活 性 化
一 定 時 空 間 間 隔 体 節 形 成 考 え い
本 研 究 時 間 周 期 空 間 周 期 変 換 機 構 理 解 を 進 遺 伝 学 的 解 析 や 胚 操 作 比 較 的 容 易 あ 体 節 形 成 機 構 研 究 広 く 用 い い ッ シ ュ 着 目 し マ ウ ス い Tbx６ ン パ 質 発 現 領 域 前 方 端 将 来 体 節 境
界 置 を 規 定 示 境 界 体 節 形 成 周 期 体 節 分 幅
後 方 移 動 体 節 境 界 置 順 次 決 行 く 申 請 者
ッ シ ュ Tbx6 対 抗 体 を 独 自 調 製 し ッ シ ュ い 基 本 的
マ ウ ス 同 様 Tbx6 ン パ 質 体 節 境 界 規 定 起 Tbx6 ン パ
質 パ ー ン 変 化 ッ シ ュ 固 有 部 分 あ 体 節 頭 尾 軸 沿
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い 機 能 阻 害 実 験 明 し Ripply1 Tbx６ ン パ 質 発 現 ベ
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顕 微 注 入 し Ripply1 依存的 Tbx６ ン パ 質 量
Ripply 依存 的 Tbx６ ン パ 質 量 両 者 直 接 相 互 作 用 必 要
明 未 分 節 中 胚 葉 前 側 体 節 形 成 周 期 依 存 し 誘 導 Ripply 発 現
体 節 境 界 置 決 定 重 要 あ 考 え Ripply 発 現 を 制 御
因 子 し Mesp 注 目 し 両 者 関 係 を 検 討 し マ ウ ス い Mesp
Ripply 発 現 必 要 あ 対 し ッ シ ュ い 熱 シ ョ ッ ン パ
質 モ ー ー mesp-ba 遺伝 子を 強制 発現 Ripply2 発 現 変 化
Ripply1 未 分 節 中 胚 葉 後 側 発 現 誘 導 Ripply 発 現 FGF 活 性 比 較 び FGF シ ナ 阻 害 剤 を 用 い 実 験 未 分 節 中 胚 葉 前 側
Ripply1 発 現 誘 導 FGF 活性 必 要 あ 示 以 結 果
ッ シ ュ 体 節 形 成 過 程 い 分 節 時 計 働 け 未 分 節 中 胚 葉
前 方 部 起 FGF シ ナ Ripply Ripply 発 現 誘 導
Tbx6 ン パ 質 発 現 を 引 起 し 新 Tbx６ ン パ 質 前 方 境 界 を
規 定 い う 一 連 分 子 機 構 周 期 的 引 起 体 節 境 界 置
一 定 時 間 周 期 順 次 決 定 行 く い う モ デ 提 唱
(Separate Form 3)
本 研 究 主 要 成 果 い 報 論 文 国 際 的 学 術 雑
発 表 既 受 理 い
以 本 研 究 ッ シ ュ け Tbx6 ン パ 質 Ripply 発 現 制 御 機 構 を
明 体 節 境 界 置 一 定 時 間 周 期 逐 次 作 行 く
分 子 機 構 い 理 解 を 進 し 高 く 評 価
