氏 宮 愛喜子
学 位 専 攻 分 博士 理学
学 位 記 番 総研大 第
学位授与の日付 成 ６ 月 日
学位授与の要件 生命科学研究科 生理科学専攻
学位規則第６条第 該当
学 位 論 文 題 目
論 文 審 査 委 員 主 査 教 授 中 一裕 教 授 鍋倉 淳一 教 授 村 美子
教 授 中西 博 九 大学
(別紙様式 2) (Separate Form 2)
論文内容の要旨
Summary of thesis contents
論文題目: Microglia contribute to excitatory synapse formation in developing mouse neocortex.
It has recently been reported that microglia, the immune cells of the central nervous systems (CNS), actively interact with synapses in their resting state. Resting microglia selectively and physically contact synapses in the intact brain, and are also involved in synapse elimination in immature brain and in the penumbra region, the cortical area adjacent to ischemic core. This synapse elimination contributes to neural circuit reorganization during development, and possibly to circuit recovery from injury. However, although activated microglia can release several molecules related to synapse formation (e.g. thrombospondins (TSPs), neurotrophins), whether microglia can also actively contribute to synapse formation is not known. Therefore in this study, I focused on 1) whether microglia are involved in synapse formation in the intact mice neocortex during the developmental period when rapid increase in excitatory synapses occurs (postnatal day (P) 8-10), and 2) the possible mechanisms underlying any of such effects observed.
To elucidate whether microglia play any roles in synaptogenesis in the developing neocortex, I separately visualized and analyzed both microglia and neurons. I used Iba1-EGFP mice, in which enhanced green fluorescent protein (EGFP) is selectively expressed in microglia of the CNS. To visualize layer (L) 2/3 pyramidal neurons, I performed in utero electroporation of embryonic day (E) 14-15 Iba1-EGFP mice with constructs which express red fluorescent protein. Using these mice, I could simultaneously observe microglia and neurons, and detect any contacts or interactions between the two, using in vivo two-photon imaging under physiological conditions. During in vivo time-lapse imaging, the formation of dendritic protrusion was detected
following microglia contact with dendrites. The formation rate of these protrusion was significantly higher in dendritic regions that had been contacted by microglia, as compared with adjacent dendritic regions (10 μm lateral) in which contacts had not generally been observed. Ninety percent of these newly formed protrusions had a filopodia structure. Although these filopodia sometimes retracted or disappeared during an imaging session, their overall survival rate was not significantly different from other newly formed filopodia. Real time imaging (with higher temporal resolution) revealed that the protrusions were usually formed very soon (< 10 minutes) after microglia contact. Thus, microglia contact with dendrites appears to be involved in the initiation of filopodia.
I also observed microglia-neuron interactions at P12-14 and at P26-30. However, there was no significant difference in the formation rate of filopodia between microglia contacted and adjacent dendritic regions, indicating the microglia associated filopodia formation was age-specific. It is known that microglia in the immature brain show an activated morphology. Injection of minocycline, which inhibits the activation of microglia, decreased microglia-induced filopodia formation. To investigate possible mechanisms mediating microglia-related spine formation, I checked TSP expression using immunohistochemistry and revealed that TSP1 was present in P8 microglia processes. Co-expression of TSP1 and EGFP (in Iba1-EGFP mice) was reduced at P14 and virtually absent in adult microglia. Confocal imaging indicated that TSP1 is present within the microglia themselves. Furthermore, multiple dosing of mice with gabapentin (GBP), a blocker of TSP1 receptor α2δ-1 subunit of voltage-dependent Ca2+ channel, significantly decreased filopodia formation. Together these data suggest that TSP1 is released from activated microglia and involved in the microglia-induced filopodia formation. Filopodia are known to be actin rich structures and I proposed that actin accumulation was needed for the structural re-arrangements accompanying
(別紙様式 2) (Separate Form 2)
filopodia formation. To visualize actin filaments, I cultured P5 cortical slices and transfected them with pCMV-lifeact-mCherry by ballistic gene transfer. Lifeact is a peptide that binds to actin. Real time imaging revealed that actin accumulated at the microglia contacted dendritic site, and filopodia formed at the peak of this actin accumulation. This suggests that microglia contact attracts the recruitment and formation of actin for filopodia formation.
Finally I investigated whether microglia contact mediated filopodia become functional synapses. Double transgenic mice were generated by crossing Iba1-tetracycline transactivator (Iba1-tTA) mice and tetracycline operator-diphtheria toxin A (tetO-DTA) mice. This enabled the selective ablation of microglia upon withdrawal of doxycycline (Dox) from the diet. The density of microglia was significantly decreased three days after of Dox removal, and spine density was significantly decreased by six days of Dox removal during P5-11. Minocycline injected mice had reduced spine density. Miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) were recorded from L2/3 pyramidal neurons, and mEPSCs frequency was significantly reduced in microglia-ablated mice. These data indicate that microglia-induced filopodia mature into functional synapses during cortex development.
In conclusion, microglia contribute to excitatory synapse formation through filopodia formation at L2/3 pyramidal neurons in developmental mice neocortex. This indicate that microglia contribute not only to neuronal circuit rearrangement but also to circuit formation.
博 士 論 文 の 審 査 結 果 の 要 旨
Summary of the results of the doctoral thesis screening
こ 中 枢 神 経 系 の 免 疫 担 当 細 胞 あ ロ い の 研 究 病 態 傷 害 時 の 働
い の の 主 体 あ 近 年 正 常 時 の ロ 突 起 選 択 的 構
造 接 触 こ や 接 触 受 け 前 部 後 部 除 去 さ こ 報 告 さ 発 達 期 や
障 害 部 位 け 神 経 回 路 編 成 ロ 関 与 こ 示 唆 さ い 一 方 活 性
化 ロ 形 成 関 与 考 え 種 々 の 子 放 出 さ こ
知 発 達 期 ロ の 形 態 観 察 行 う 成 体 ウ の ロ
比 較 細 胞 体 の 面 積 大 く 突 起 の 数 や 支 配 領 域 小 さ い い う 活 性 化 型 近 い 形 態
い こ 明 そ こ 回 出 願 者 生 後 発 達 期 の 形 成 ロ
関 与 う 検 討 行
ロ 特 異 的 緑 色 蛍 光 タ ン 質 EGFP 発 現 い Iba1-EGFP ウ 対 子 宮 内 電 気 穿 孔 法 行 い 大 脳 皮 質 感 覚 野 2/3層 の 興 奮 性 神 経 細 胞 赤 色 蛍 光 タ ン 質 可 視 化 生 後 8-10日 目 P8-P10 の ウ い ロ 樹 状 突 起 の 接 触
観 察 生 体 内 二 光 子 メ ン 観 察 結 果 ロ の 接 触 後 ロ
形 成 さ こ 見 い ウ 大 脳 皮 質 の 培 養 標 本 用 い 実 験
い ロ 接 触 樹 状 突 起 の 部 位 チ ン 集 積 く 様 子 観 察 さ
そ の 後 ロ 形 成 さ こ 観 察
こ の ロ ロ 形 成 発 達 期 特 異 的 生 P12-14 P26-30
の ウ 用 い 同 様 の 観 察 行 P12-14 P26-30 接 触 領 域 近 傍 領 域 の ロ
の 形 成 確 率 有 意 差 見 こ ロ 発 達 期 の 限 時
期 の ロ 形 成 寄 与 い こ 判 明 ロ 形 成
ロ 活 性 型 あ こ 必 要 あ 考 え サ ン の 腹 腔 内 投 与 行 い ロ
の 活 性 抑 え こ ロ 接 触 領 域 の ロ の 形 成 確 率 優 位
減 少 活 性 化 型 ロ 形 成 関 与 こ 報 告 さ い ロ ン
ン ン TSP や 神 経 成 長 因 子 BDNF 放 出 さ こ 報 告 さ い の 免 疫 組 織 化 学 法 用 い 発 達 期 ロ の こ の 発 現 検 討 BDNFの 発 現 確 認
さ P8の ロ の 突 起 部 い 多 く TSP1 発 現 い こ 判 明
一 方 P14 TSP1の 発 現 大 幅 減 少 P60 ほ 発 現 い い
い う 結 果 得 P8の ロ TSP1 放 出 い 可 能 性 示 唆 さ の
TSP1の 受 容 体 あ 膜 電 位 依 存 性 Ca2+チ ャ α2δ-１サ ユ ッ の阻害薬 あ ャ ペ ン チ ン 腹 腔 内 投 与 接 触 領 域 の ロ 形 成 確 率 優 位 減 少 以 上 の 結
果 ロ ロ 形 成 活 性 化 ロ 放 出 さ
TSP1の 関 与 示 唆 さ
ロ 形 成 さ ロ 形 成 関 与 い う 確
認 行 サ ン 投 与 ウ の 脳 灌 流 固 定 ン 密 度 対 照 群
比 較 こ 優 位 減 少 い ロ 特 異 的 毒 素 発 現 さ せ
ロ 選 択 的 除 去 ウ 同 様 の 結 果 得 の ロ
ロ 形 成 発 達 期 け ン 形 成 寄 与 い 考 え さ
ロ 除 去 ウ 作 成 脳 薄 片 用 い 微 小 興 奮 性 後 電 位 の 頻 度
確 認 こ 対 照 群 比 較 優 位 減 少 い ロ 形 成 さ
(Separate Form 3)
ロ 機 能 的 の 形 成 寄 与 い 考 え
以 上 の 結 果 大 脳 皮 質 体 性 感 覚 野 の 発 達 期 い 時 期 特 異 的 ロ ロ の 形 成 機 能 的 の 形 成 寄 与 い こ 示 さ そ の 科 学 的 価 値 極 高 く 評 価 以 上 の 理 由 審 査 委 員 会 全 員 一 致 本 論 文 学 位 論 文
相 応 い の あ 判 断
