氏 名 Gopal Pramanik
学 位 （ 専 攻 分 野） 博 士 （ 理 学 ）
学 位 記 番 号 総 研 大 甲 第 1777号
学 位 授 与 の 日 付 平 成 ２ ７ 年 ３ 月 24日
学 位 授 与 の 要 件 生 命 科 学 研 究 科 生 理 科 学 専 攻 学 位 規 則 第 ６ 条 第 １ 項 該 当
学位論文題目 Analysis of Cell Adhesion Molecules in Synapse Formation and Synaptic Transmission
論文審査委員 主 査 教 授 深 田 正 紀 教 授 吉 村 由 美 子 教 授 鍋 倉 淳 一
教 授 服 部 光 治 名 古 屋 市 立 大 学 大 学 院 教 授 田 渕 克 彦 信 州 大 学
論 文 内 容 の 要 旨
Summary of thesis contents
Synaptic cell-adhesion molecules (CAMs) play a critical role in synapse formation and synaptic transmission. Numerous synaptic CAMs have been identified, but their physiological functions remain incompletely understood. For better understanding of the function of CAMs in synapses, I focused on two important synaptic CAM families, Calsyntenins and leukocyte common antigen -related receptor protein tyrosine phosphatases (LAR-RPTPs), and analyzed their functions in synapse formation and synaptic transmission.
Calsyntenins are postsynaptic membrane proteins consisting of cytoplasmic calcium binding domains and extracellular cadherin binding domains. Calsyntenin family comprises Calsyntenin-1, Calsyntenin-2 and Calsyntenin-3. To study the effect of Calsyntenins on synapse formation, I first employed HEK293T-neuron co-culture assay. In this experiment, I found Calsyntenin -3, but not Calsyntenin-1 and Calsyntenin-2, induced synapse formation on HEK293T cells from co -cultured rat/mouse neurons when it was overexpressed in HEK293T cells. Next I knocked down Calsyntenins in neurons and examined the effects on synapse formation and synaptic transmission. Simultaneous knockdown of Calsyntenin -1, Calsynteni-2 and Calsyntenin-3 (CST-TKD) in mouse cultured hippocampal neurons reduced synapse density both in inhibitory and excitatory synapses. CST-TKD reduced the expression of presynaptic marker synapsin-1, inhibitory presynaptic marker GAD67, excitatory presynaptic marker VGLUT1, inhibitory postsynaptic marker gephyrin, but not excitatory postsynaptic marker homer-1. However, single knockdown of any Calsyntenis did not affect synapse formation, suggesting that Calsyntenins are
important for the maintenance of synapses. By using electrophysiological methods, I showed that CST-TKD in mouse cultured hippocampal neurons reduced the frequency, but not amplitude of miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs). Under my experimental conditions, the frequency and amplitude of miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) were unaltered. CST-TKD reduced the frequency but increased amplitude of mIPSCs in mouse layer 2/3 pyramidal neurons in somatosensory cortex. In contrast, CST-TKD did not alter the frequency and amplitude of mEPSCs in layer 2/3 pyramidal neurons. The paired pulse ratio (PPR) of IPSCs was unaltered in CST-TKD in layer 2/3 pyramidal neurons in somatosensory cortex. Next, I identified -Neurexin as a binding partner for Calsyntenin-3 from rat brain extracts by using affinity chromatography, liquid chromatography and mass spectrometry. Importantly, simultaneous knockdown of Neurexin -1, Neurexin-2, and Neurexin-3 in mouse cultured hippocampal neurons inhibited Calsyntenin -3-induced synapse formation in artificial synapse formation assay. Collectively, these results suggest that three Calsyntenins regulate synapse formation and inhibitory synaptic transmission in concert with -Neurexin.
LAR, PTP and PTP are the members of (LAR-RPTPs) family proteins, known to be involved in synapse formation and synaptic transmission. They have common domain structures which include extracellular three immunoglobulin like domains, fibronectin type III domains, and transmembrane regions. Because extracellular domains of synaptic CAMs play an important role in their cell adhesive activity. I explored the binding protein to the extracellular domain of PTP. Here, I identified Glypican-4 (GPC-4) as a binding partner of PTP from rat brain extracts by affinity chromatography, liquid chromatography and mass spectrometry. GPC -4 is a member
of vertebrate six glypicans that are heparan sulfate (HS) proteoglycans and binds to the plasma membrane through glycosylphosphatidylinositol anchor. I found that GPC-4 bound to LAR, PTP and PTP and that PTP interacted with only proteolytically cleaved forms of GPC -2, GPC-3, GPC-4 and GPC-6, but not full length glypicans. The interaction between PTP and GPC-4 depends on HS-binding because mutation of HS-binding residues (KKKK) in PTP to PTP-AAAA or (SSS) in GPC-4 to GPC-4-AAA abolished their interaction. Leucine-rich repeats transmembrane 4 (LRRTM4) induces excitatory synapse formation in artificial synapse formation assay using rat cultured hippocampal neurons, however, knockdown of PTP, but not LAR, inhibited this LRRTM4-induced synaptogenic activity. Wild-type PTP, but not PTP-AAAA (HS-binding deficient mutant), rescued the effect of PTP-knockdown on LRRTM4-induced synapse formation. Knockdown of PTP in rat cultured hippocampal neurons reduced both frequency and amplitude of mEPSCs. Wild-type PTP, but not HS-binding mutant PTP-AAAA reversed the effect of PTP knockdown on excitatory synaptic transmission. In contrast, knockdown of PTP in rat cultured hippocampal neurons reduced the frequency, but not amplitude of mIPSCs. Knockdwon of LAR and PTP did not affect the frequency and amplitude of mIPSCs. In addition, knockdown of PTP did not affect the PPR of EPSCs. Together these results suggest that presynaptic PTP and GPC-4 regulate excitatory synapse formation and synaptic transmission in HS-dependent manner. Electrophysiological data suggests that PTP may regulate inhibitory synaptic transmission. Further, LRRTM4 may induce excitatory synapse formation through LRRTM4, PTP and GPC-4 complex.
In conclusion, I showed that postsynaptic Calsyntenis redundantly regulate
inhibitory synapse formation and synaptic transmission through interaction with presynaptic -Neurexin. In addition, I found that presynaptic PTP forms complex with presynaptic glypican-4 and postsynaptic LRRMT4, and modulates excitatory synaptic transmission. These results should contribute to understanding the
molecular mechanisms for synapse formation and synaptic transmission in mammalian brain.
Summary of the results of the doctoral thesis screening
シ ナ ス 接 着 分 子 シ ナ ス 形 成 や シ ナ ス 伝 達 の 制 御 い 中 心 的 役 割 を 担 う 考 え い 最 近 の 研 究 数 多 く の シ ナ ス 接 着 分 子 見 出 さ い
の 全 容 明 さ い い Pramanik氏 シ ナ ス 接 着 分 子 Calsynteninフ ァ ー leukocyte common antigen-related receptor protein tyrosine phosphatase
LAR-RPTP フ ァ ー ン パ ク 質 焦 点 を 当 の シ ナ ス 形 成 や シ ナ ス 伝 達 の 制 御 生 理 機 能 を 解 明 す を 目 的 し 研 究 を 行
Calsyntenin 大脳皮質や海馬 強く発現す 細胞接着分子 哺乳類 Calsyntenin-1, -2, -3 い う ３ の フ ァ ー 分 子 知 い Calsyntenin シ ナ
ス 後 部 局 在 す シ ナ ス 機 能 あ く わ い
Calsyntenin の シ ナ ス 役 割 を 解 明 す ウ ス Calsyntenin-1, -2, -3 遺 伝 子 を 入 し HEK293T細 胞 を ッ ト し く ウ ス 培 養 海 馬 神 経 細 胞 共 培 養 し Calsyntenin-3 を 入 し HEK293T 細 胞 の 表 面 共 培 養 し 神 経 細 胞 の
軸索 端 集積し シナ ス様構造の形成 一方 shRNA
Calsyntenin-1,-2, -3 遺 伝 子 を ウ ス 培 養 海 馬 神 経 細 胞 ノ ッ ク ウ ン し
単 独 の ノ ッ ク ウ ン 有 意 シ ナ ス 密 度 の 変 化 認 3 の 遺
伝 子 を 同 時 ノ ッ ク ウ ン し 興 奮 性 及 び 抑 制 性 シ ナ ス の 密 度 の 減 少
Calsyntenin-1, -2, -3 を 同 時 ノ ッ ク ウ ン し ウ ス 培 養 神 経 細 胞 及 び 大 脳 皮 質 第 2/3層 の 神 経 細 胞 微 抑 制 性 シ ナ ス 後 電 流 mIPSC の 頻 度 の
微 興 奮 性 シ ナ ス 後 電 流 mEPSC 関 し 頻 度 振 幅 変 化 見
さ ッ ト の 脳 抽 出 液 の 親 和 性 沈 降 質 分 析 法 Calsyntenin-3 シ ナ ス 接 着 分 子-Neurexins 間 接 的 複 合 体 を 形 成 す を 見 出 し shRNA 培 養 神 経 細 胞 Neurexin-1, -2, -3を 同 時 ノ ッ ク ウ ン し Calsyntenin-3
誘 さ シ ナ ス 形 成 阻 害 さ 以 Calsyntenin -Neurexins を 介 し シ ナ ス 形 成 の 誘 及 び 抑 制 性 シ ナ ス 機 能 の 制 御 寄 与 し い 示 唆 さ
シ ナ ス 前 終 局 在 す LAR-RPTP フ ァ ー ン パ ク 質 LAR, PTP, PTPの ３ あ シ ナ ス 形 成 や シ ナ ス 伝 達 関 与 す 知 い Pramanik氏
ッ ト の 脳 抽 出 液 親 和 性 沈 降 質 分 析 法 glypican-4 GPC-4 PTP 相 互 作 用 す を 見 出 し PTP GPC-4 の 結 合 パ ン 硫 酸 の 結 合 を 介 し い を 見 出 し シ ナ ス 後 部 局 在 す シ ナ ス 接 着 分 子 の 一 leucin-rich repeats transmembrane 4 (LRRTM4) 興 奮 性 シ ナ ス の 形 成 を 誘 す 知
い ッ ト 培 養 海 馬 神 経 細 胞 い shRNA PTPを ノ ッ ク ウ ン す
LRRTM4 シ ナ ス 形 成 起 い 明 し PTPの ノ ッ ク ウ ン
mEPSC の 頻 度 振 幅 の 両 方 し い 生 型 の PTP PTPの ノ ッ ク ウ ン
mEPSCの を レ ス キ ュ ー し パ ン 硫 酸 結 合 配 列 変 異 を 加 え PTP レ
ス キ ュ ー し の PTP パ ン 硫 酸 を 介 し GPC-4 の 結 合
興 奮 性 シ ナ ス の 形 成 び シ ナ ス 伝 達 を 制 御 し い 示 唆 さ さ LRRTM4 PTP/GPC-4 の 結 合 を 介 し 興 奮 性 シ ナ ス の 形 成 を 誘 し い 考 え
研 究 シ ナ ス 接 着 分 子 シ ナ ス 形 成 シ ナ ス 伝 達 機 構 の 解 明 を 研 究 テ ー 掲 分 子 細 胞 生 物 学 生 化 学 や 電 気 生 理 学 の 手 法 を 駆 使 し 行 わ の あ
当 該 分 の 発 展 大 い 貢 献 す の 考 え し 研 究 学 論 文 し
ふ さ わ し い の あ 審 査 委 員 全 員 の 意 見 一 致 し
