発表スライドのPDF Lecture 2 Rでつなぐ次世代オミックス情報統合解析研究会

Feb 22 2012 ¹

R ^{ン 解析}

～_NGS 来塩基配列 自在 解析 ～

東京大学大学院農学生命科学研究科

ン 教育研究 ッ

門 幸二＆ う ＇

http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/ kadota@iu.a.u-tokyo.ac.jp

Contents



multi-fasta ^{形式 情報抽出}



^{比較 ン 解析＆二群間比較＇}

 ^{各種R ッ}

 ^{分布＆ ソン分布 負 二 分布＇}

 ^{edgeR ッ 使 ＆}technical replicates^＇

 MA-plot

 ^{倍率変化 理}

 ^{edgeR ッ 使 ＆}biological replicates^＇

 ^{NGS ッ 行う}

 ^任意 R ^{ッ ン 方}

 ^{ン 間 ン 基本中 基本}

Feb 22 2012 3

R ^起動

ク ップ あ _20111221 ォ ダ中 ァイ を解析

作業 ＆＝ ＇ 変更

Feb 22 2012 5

getwd() ^{打 込 確認}

参考

Feb 22 2012 7

multi-fasta ^{形式 情報抽出} 1

一連 コマン 群をコ ーし

R Console^{画面上 ー}

multi-fasta ^{形式 情報抽出} 1

出力 ァイ 名 し 指定したも _hoge.txt

20111221 ^{ォ ダ中 作成}

Feb 22 2012 9

練習



^{20111221 中 あ} practice1.txt ^{中 記述 変更}

Trinity.fasta ^{対 様 解析 行}

い 結果 _hoge1.txt 出力

multi-fasta ^{形式 情報抽出} 2

配列 _GC含量を計算したい

Feb 22 2012 11

練習



^{20111221 中 あ} practice2.txt ^{中 記述 変更}

Trinity.fasta ^{対 様 解析 行}

い 結果 _hoge2.txt 出力

multi-fasta ^{形式 情報抽出} 3

Trinity.fasta ^対し 600bp^{以上 も み抽出し みよう}

Feb 22 2012 13

multi-fasta ^{形式 情報抽出} 4

FPKM^{値：配列長補正 み 発現量 相当 値}

Trinity ^{新しいバー ョン} FPKM^{値を出力し く ったよう} _…

multi-fasta ^{形式 情報抽出} 4

Trinity.fasta

FPKM^{値をも サンプ 内 転写物間 発現 大小を議論可能}

サンプ 間 比較 使え い いわ い

利用可能 _R ッ

15

 ^DEGseq (Wang et al., Bioinformatics, 26: 136-138, 2010)

 ^{ワソン分布＆}variance = mean^{＇ 仮定 い ば 過少評価}

 ^edgeR (Robinson et al., Bioinformatics, 26: 139-140, 2010)

 ^{正規化法８TMM法}

 ^{負 二 分布＆}variance > mean^{＇ 仮定} mean ^{用い 現実}

ば 表現

 ^DESeq (Anders and Huber, Genome Biol., 11: R106, 2010)

 ^{正規化法８RLE法}(relative log expression)

 ^{edgeR 拡張＆ い い＇}

 ^baySeq (Hardcastle and Kelly, BMC Bioinformatics, 11:422, 2010)

 ^{正規化法８RPM ( ぶ )}

 ^{配列 長 情報 与え ン あ}

 ^{ッ 中 占 DEG 割合＆P}_DEG^{＇ 一意 返}

 ^NBPSeq (Di et al., SAGMB, 10:24, 2011)

Feb 22 2012

入力８生 ン 遺伝子発現行列

出力８遺伝子 発現変動 度合い＆_p値 ＇

生 ン ？！



^{基本的 ッ ン ＆ bowtie ＇ 用い 場合}

遺伝子₁ 遺伝子₂ 遺伝子₃ 遺伝子₄

遺伝子₁ 遺伝子₂ 遺伝子₃ 遺伝子₄

T1 ^ン RNA-Seq

mapping

count ン 配列８ ノ

count ン 配列８ ン

理想的 実験 ン＆二群間比較＇



^{ン A vs. B 比較＆} Kidney vs. Liver ^９腎臓 vs. ^肝臓＇

 ^{生 ン ＆整数値＇}

Feb 22 2012 17

A1^{８あ 生物 腎臓}

A2^{８ 生物種 別個体 腎臓}

A3^{８ 生物種 別個体 腎臓}

…

B1^{８あ 生物 肝臓}

B2^{８ 生物種 別個体 肝臓}

…

Biological replicates

生物学的 ば ＆個体間 違い＇ 考慮 べ

分布 話

 ^例題８Marioni et al., Genome Res., 18: 1509-1517, 2008 ^{＆ 一部＇}

kidney^＆腎臓＇ liver^＆肝臓＇

Technical replicates

ン 内 技術的 ば ＆例８ ン間 違い＇ 度合い 調べ

あ う 二群間比較 発現変動遺

伝子 程度あ い 数 関 議論 無意味

解析例８ _?!数＆_50% ＇ 発現変動遺伝子 検出

理 ８Biological variation > Technical variation

分布 話

 ^例題８Marioni et al., Genome Res., 18: 1509-1517, 2008 ^{＆ 一部＇}

Feb 22 2012 19

kidney^＆腎臓＇

RPM 正規化

8 . 1,804,977 7027

000 , 000 , 685 1 , 2

1 _{ }

分布 話

 ^例題８Marioni et al., Genome Res., 18: 1509-1517, 2008 ^{＆ 一部＇}

kidney^＆腎臓＇

adjusted R-squared: 0.897

y = a + bx y = x

Technical replicates ^８

＆遺伝子 ＇_{VARIANCE MEAN}

明可能 あ

VARIANCE ^≒ MEAN ソン分布 従う

分布 話

 ^例題８Cumbie et al., PLoS ONE, 6: e25279, 2011 ^{＆ 一部＇}

Feb 22 2012 21

Arabidopsis^{＆ ＇}

adjusted R-squared: 0.815

y = a + bx y = x

Biological replicates ^８

VARIANCE > MEAN 負 二 ＆_NB＇分布 従う

NB ^適用可能

生物 ン＆http://biosciencedbc.jp/taxonomy_icon/taxonomy_icon.cgi^＇

沢山 方法 存在 う ？

 ^DEGseq (Wang et al., Bioinformatics, 26: 136-138, 2010)

 ^{ワソン分布＆}variance = mean^{＇ 仮定 い ば 過少評価}

 ^edgeR (Robinson et al., Bioinformatics, 26: 139-140, 2010)

 ^{正規化法８TMM法}

 ^{負 二 分布＆}variance > mean^{＇ 仮定}

 ^DESeq (Anders and Huber, Genome Biol., 11: R106, 2010)

 ^{正規化法８RLE法}(relative log expression)

 ^{edgeR 拡張＆ い い＇}

 ^baySeq (Hardcastle and Kelly, BMC Bioinformatics, 11:422, 2010)

 ^{正規化法８RPM ( ぶ )}

 ^{配列 長 情報 与え ン あ}

 ^{ッ 中 占 DEG 割合＆P}_DEG^{＇ 一意 返}

 ^NBPSeq (Di et al., SAGMB, 10:24, 2011)

Ans. Variance Mean ^{関係 表現 手段 沢山あ}

) 1

(

VAR _{  }

) 1

(

VAR _{  }

) 1

(

VAR _{  }^1



 VAR

edgeR ^使

 ^例題８Marioni et al., Genome Res., 18: 1509-1517, 2008

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kidney^＆腎臓＇ liver^＆肝臓＇

８SupplementaryTable2_changed.txt 内容８_A群 最初 ₅列 _B群 残 ₅列

解析結果 _hoge2.txt いう 前 出力 い

edgeR ^使

８SupplementaryTable2_changed.txt 内容８_A群 最初 ₅列 _B群 残 ₅列

edgeR ^使

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R^{上 ！}

＆ ッ 出 い け ば

hoge2.txt ^{いう い ＇}

edgeR ^使

一番右側 数値 False Discovery Rate (FDR) 列＆_O列＇ 昇 ソ ば任意 閾値 満 遺伝子数 わ

19,785^個 FDR < 0.01 ^満 21,291 FDR < 0.05

edgeR ^使

Feb 22 2012 27

Top-ranked gene ^{生 ン 眺 確} 発現変動 (Kidney << Liver) ^{い 分}

edgeR ^使

 ^{M-A plot 描画＆}FDR < 0.01 ^{満 赤色 表示＇}

hoge2.png

edgeR ^使

 ^{M-A plot 描画＆2倍以上発現変動 い 赤色 表示＇}

Feb 22 2012 29

hoge2.png

11787^{個＆全遺伝子数 う 約}37% 2^{倍以上発現変動 い ＇} 方

倍率変化 理

 ^例題８Marioni et al., Genome Res., 18: 1509-1517, 2008

kidney^＆腎臓＇ liver^＆肝臓＇

A B

発現変動遺伝子 い 二群間比較

倍率変化 理

 ^例題８Marioni et al., Genome Res., 18: 1509-1517, 2008 ^{＆ 一部＇}

 (A1, A2) vs. (A3, A4) ^{二群間比較結果}

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edgeR FDR < 0.01 ^満 0^{個 ＆}edgeR ^＇2^{倍以上発現変動 い} 3814^個

低発現領域 _log比 大 く 現象 う く 化 重要

○ _×

Rcode_edgeR_tech_rep_fdr001.txt Rcode_edgeR_tech_rep_fc2.txt

Top 400

Top 2000

低い _← 全体的 発現 _→ 高い

感 ンキン 重要

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adjusted R-squared: 0.897

y = a + bx y = x

adjusted R-squared: 0.774

RPM^正規化 RPKM^正規化

長 補正 仮定 分布 大 く _…

Biological replicates 3 vs. 3 ^ン

 ^例題８Cumbie et al., PLoS ONE, 6: e25279, 2011 Arabidopsis

data_arab.txt

26,221 genes

” AT4G32850” ^{重複 存在} い ₁₉₅₂₀行目 予 除去 い

A^群 B^群

edgeR default ^手 (edgeR/default) ^実行

Feb 22 2012 35

edgeR default ^手 (edgeR/default) ^実行

A^{群 高発現} B^{群 高発現}

Feb 22 2012 37

い！ 文句 言わ 自分 ン

R^{上 ば任意 ッ ン}

ン 間 ン 重要

Feb 22 2012 39

ン 間 ン 重要

中 発現変動遺伝子 あ う う

ン 結果 眺 け わ

＆ _R ＇

 ^{NGS 得 FASTQ形式 込 論文 く出}

く quality score^分布 GC^{含量 計算結果 得}

 ^＆de novo transcriptome assembly ^{得 ＇}multi-fasta^形式 各種解析 可能

 ^{配列長 ン N50 計算}

 ^{比較 ン 解析用 R ッ 充実 い}

 ^{但 入力 注意 必要}

 ^{ン 間比較８生 ン}

 ^{ン 内比較８長 補正 行 ＆}RPKM FPKM ^＇

 ^{分布 考え 重要 ＆発現変動遺伝子数 議論 い場合＇}

 technical replicates biological replicates

 R ^{ッ 用い ば発現変動遺伝子 検出 描画 簡単}

 ^{二倍＆倍率変化＇ ○○}

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＆_R ＇塩基配列解析 用い _… べく自力 解析

3/9 ^{門 担当部分 詳細 話 予定}

Feb 22 2012 43

東大生以外 方 受講可能 ＆来年度 ＇