氏 名 西 本 れ い
学 位 専 攻 分 野 博 士 医 学
学 位 記 番 号 総 研 大 甲 第 1 4 号
学 位 授 与 の 日 付 成 ８ 月 日
学 位 授 与 の 要 件 生 命 科 学 研 究 科 生 理 科 学 専 攻 学 位 規 則 第 ６ 条 第 項 該 当
学位論文題目 A ay T R P a y a a
論文審査委員 主 査 教 授 古 瀬 幹 夫 教 授 富 永 真 琴 教 授 池 中 一 裕
教 授 小 泉 修 一 山 梨 大 学 大 学 院
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論 文 内 容 の 要 旨
Summary of thesis contents
Transient receptor potential (TRP) channels are non -selective cation channels involved in a wide variety of sensing functions in our body, including pain and temperature sensation. The TRP channel superfamily is conserved in yeast, invertebrates and vertebrates and composed of 28 members which are divided into 6 subfamilies in mammals, based on their protein sequence homology: canonical or classic (C), vanilloid (V), melastatin (M), polycystin or polycystic kidney disease (P), mucolipin (ML), ankyrin (A). The mechanisms activating TRP channels are highly diversified: activation by temperature, by chemical molecules or activation downstream of signal transduction pathways. Additionally, it is well kno wn that TRP channels are polymodal receptors. The TRP channel activators cause synergistic effects on TRP channel activity when different types of activators exist at the same time. Thus, TRP channels attract us to study about their physiological and pathological significa nce involved in our lives. In this doctoral thesis study, I focused on TRP channel functions involved in the mechanism of pain sensation induced by propofol, a general anesthetic drug (Chapter I) and the mechanism of temperature-dependent microglia motility (Chapter II).
Propofol, a commonly used intravenous anesthetic agent, is known as a modulator and an activator of GABAA receptors in the central nervous system. It is also known to sometimes cause pain sensation upon injection in humans. However, the molecular mechanisms underlying this harmful effect are not fully understood. Propofol is so far reported to activate TRPA1 and TRPV1 in rodents, but the propofol effect on the latter is still controversial. Furthermore, it is still unclear whether propofol can activate them in humans. To address whether propofol can activate TRPV1 and TRPA1 in humans and mice, I utilized patch -clamp recordings and Ca2+-imagings using the heterologous expression system and mice in Chapter I. In patch -clamp recordings using HEK293T cells, I observed propofol -evoked currents in HEK293T cells expressing human TRPA1, mouse TRPA1 or mouse TRPV1, but not in HEK293T cells expressing human TRPV1. Next, I performed Ca2+-imagings to evaluate propofol action on sensory neurons using dorsal root ganglion (DRG) cells prepared from wild -type (Wt), Tr pv1-knockout, Tr pa 1-knockout or Tr pv1/Tr pa 1 double knockout (V1A1DKO). I found that propofol caused increases in intracellular Ca2+ concentrations ([Ca2+]i) in DRG cells from Wt, suggesting the ability of propofol to activate Ca2+-permeable proteins in DRG cells. Such propofol -induced [Ca2+]i increases were still observed in a considerable portion of DRG cells from V1A1DKO mice, indicating the existence of TRPV1 - and TRPA1-independent mechanisms for propofol action. By using Ca2+-imagings and patch-clamp recordings, I investigated the involvement of type A γ-amino butyric acid (GABAA) receptor activation in this phenomenon because it is reported that GABAA receptors and voltage-gated Ca2+ channels expressed in some population of DRG cells could be involved in the mechanism of muscimol -induced [Ca2+]i increases. I found that propofol produced action potential generation in GABAA receptor-dependent manner and
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that both T-type and L-type Ca2+ voltage-gated Ca2+ channels are activated downstream of GABAA receptor activation by propofol. Thus, propofol may cause pain sensation through multiple mechanisms involving not only TRPV1 and TRPA1 but also voltage -gated channels downstream of GABAA receptor activation.
In Chapter II, I tried to clarify the involvement of TRP channel functions in the mechanism of temperature-dependent microglia motility. Microglia are resident immune cells in the brain, which take important parts in the mainten ance of brain homeostasis. Surveillant microglia can transform into activated phenotype and migrate in response to the environmental changes under pathological conditions. Therapeutic hypothermia is an effective treatment for neural protection in the clinical field and also suppresses microglial functions such as cytokine release. However, there are few studies focusing on the molecular basis involved in the changes of microglial function in therapeutic hypothermia. Therefore, I tried to evaluate the in volvement of thermosensitive TRP channels in microglia movement in mice using temperature -controlled time-lapse imaging system, patch-clamp recordings and molecular techniques.
I found that microglia movement is temperature -dependent using temperature-controlled time-lapse imaging. I also found some clues showing the involvement of TRPM4 activation in the temperature-dependent microglia movement. I observed TRPM4 expression in mouse microglia not only at an mRNA level by RT-PCR but also at a protein level by immunocytochemistry. Moreover, heat-evoked currents in microglia were inhibited by 9-phenanthrol, a TRPM4 inhibitor, in a dose-dependent manner. Finally, I observed that the temperature-dependency of microglia movement was diminished by 9 -phenanthrol treatment. These data suggest that TRPM4, a thermosensitive monovalent cation -permeable TRP channel, might be involved in the mechanism of temperature -dependent microglia movement.
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博 士 論 文 の 審 査 結 果 の 要 旨
Summary of the results of the doctoral thesis screening
出 願 者 Analysis of TRP channel functions in sensory neurons and microglia い う 課 題 の 麻 酔 薬propofol 引 起 こ 痛 覚 び ロ ア 細 胞 の 走 性 の 温 度 依 存 性 い う ２ の 現 象 い TRP ャ ネ の 関 与 を 解 明 研 究 を 行 臨 床 広 く 使 わ 静 脈 麻 酔 薬propofolの イ ン ャ ネ 対 効 果 の 解 析 を ウ イ ー ン 法 ッ ン 法 を 用 い 行 い propofol ウ TRPV1, ウ TRPA1,
TRPA1を 活 性 化 こ を 見 い し 各TRP ャ ネ を 発 現 さ HEK293T細 胞 を
用 い 解 析 特 TRPA1活 性 化 能 強 い こ 明 propofol
の 静 注 初 期 見 血 管 痛 血 管 壁 分 布 感 覚 神 経 発 現 TRPA1を 活 性 化 こ 引 起 こ さ 考 え ウ 単 離 後 根 神 経 節 細 胞(DRG細 胞)を 用 い
解 析 機 能 的 TRPA1, TRPV1を 発 現 細 胞 propofol 細 胞 内 ウ 昇 観 察 さ TRPA1, TRPV1 損 ウ 調 製 し 細 胞 propofol 細 胞 内 ウ 濃 度 昇 見 こ TRPA1, TRPV1以 外 の 分 子 の 関 与 推 察 さ Propofol TRPA1, TRPV1二 損DRG細 胞 の 細 胞 内 ウ 昇 GABAA阻 害
剤picrotoxin 完 全 抑 制 さ こ GABAA受 容 体 の 関 与 を 推 定 し さ TRPA1, TRPV1二 損DRG細 胞 い propofol 細 胞 内 ウ 昇 L型
びT型 の 電 作 動 性 ウ ャ ネ 阻 害 剤 強 く 抑 制 さ こ GABAA受 容 体 活 性 化 ロ イ 流 出 脱 分 極 を 引 起 こ し そ の 脱 分 極 電 作 動 性
ウ ャ ネ 活 性 化 し 細 胞 内 へ の ウ 流 入 さ い の 考 え
膜 電 記 録 い propofol投 与 活 動 電 発 生 し そ の 活 動 電 発 生 picrotoxin 完 全 抑 制 さ こ 観 察 さ こ の う 出 願 者 propofol 複 数 の ニ を し 細 胞 膜 を 脱 分 極 さ 電 作 動 性Na+ ャ ネ 活 性 化 痛 感 覚 を 引 起 こ こ を 明 し
出 願 者 臨 床 い 行 わ 脳 温 療 法 の 分 子 ニ を 明
ロ ア 焦 点 を あ 温 度 の 影 響 を 観 察 し ウ ロ ア の 純 粋 培 養 系 を 確 立 し 後 イ 法 を 用 い 33度 37度 40度 け 細 胞 移 動 を 観 察 し
37度 の ロ ア の 動 能 33度 し40度 増 強 し ２ 時 間 の 細 胞 の 動 を 定 解 析 法 を 開 発 し 定 解 析 を 行 こ ロ ア の 動 温 度 依 存 性
あ こ 明 そ こ ウ ロ ア の 温 度 感 受 性TRP ャ ネ
遺 伝 子 の 発 現 を 解 析 し Trpv4, Trpm2, Trpm4, Trpv2の 発 現 を 確 認 し 体 温 域 活 性 化 TRPV4, TRPM2, TRPM4 絞 解 析 し TRPV4 損 ロ ア TRPM2 損
ロ ア 37度 生 型 ロ ア 動 差 そ こ TRPM4 着
目 し 細 胞 内 ウ 1 µMの 条 件 し 生 型 ロ ア 温 度 刺 激 活 性 化
外向 整流性を有 電流 観察さ この電流 TRPM4の特異的阻害剤 9-phenanthrol 抑 制 さ こ ウ 生 型 ロ ア のTRPM4の 機 能 的 発 現
を 確 認 し イ 法 温 度 依 存 的 ウ ロ ア の 動 変 化
9-phenanthrol 濃 度 依 存 的 抑 制 さ こ ウ ロ ア の 温 度 昇 伴 う
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動 能 の 増 強 TRPM4 関 わ い の 結 論 し
以 の う 出 願 者 感 覚 神 経 ロ ア 発 現 温 度 感 受 性 TRP ャ ネ の 発 現 機 能 の 解 析 を 行 い そ 病 態 生 理 機 能 深 く 関 わ い こ を 示 し そ の
科 学 的 価 値 高 く 評 価 後 の 当 該 分 の 発 展 資 の 考 え し
審 査 委 員 全 員 本 論 文 学 論 文 し 相 応 し い の あ 断 し
