week old ICR mice were treated with 5% DSS for 7 days, and intraperitoneally administered tropisetron (1 mg/kg) once daily

Colonic tissue samples were fixed in Mildform, then embedded in paraffin before being cut into 4 µm sections, and subjected to histological examination by hematoxylin and eosin staining.

Normal DSS DSS + Tropisetron

第

3

節 トロピセトロンによる

DSS

腸炎抑制作用における

α

7

nAChRs

の関与

トロピセトロンの

DSS

腸炎抑制効果のメカニズムにおける

α

7

nAChRs

の関与を調べるために，以下の

2

つの実験を行った．まず始めに，選択的

α

7

nAChRs

刺激薬である PNU282987の

DSS

腸炎に対する影 響を検討した．その結果，DSSの投与により上昇した

disease activity index

は，PNU282987の投与によ り有意に抑制された (Fig. 16A)．また，DSSの投与により惹起される大腸の短縮および

MPO

活性の上 昇においても，PNU282987 の投与による有意な抑制効果が認められた (Fig. 16B, C)．このことは

α

7

nAChRs

刺激薬が

DSS

腸炎抑制効果を有することを示している．なお，PNU282987 はコントロール群

（DSSを投与していない群）に対しては影響を与えなかった (data not shown)．

これまでに，トロピセトロンは

5-HT

₃

Rs

阻害作用を介して抗炎症作用を示すことが示唆されている^76,

78．そこで次に，トロピセトロンの

DSS

腸炎抑制効果における

α

7

nAChRs

および

5-HT

₃

Rs

の関与を検討

するために，選択的

α

7

nAChRs

阻害薬である

methyllycaconitine

とトロピセトロンの併用投与の検討を行 った．その結果，methyllycaconitine (1 mg/kg)の前投与により，disease activity indexおよび大腸の短縮に

おいてトロピセトロンによる腸炎抑制効果が消失した(Fig. 17A, B)．一方で，

methyllycaconitine

の前投与 はトロピセトロンによる

MPO

活性の抑制効果に影響を与えることはなかった (Fig. 17A–C)．このこと は，トロピセトロンの腸炎抑制効果において，

α

7

nAChRs

の刺激作用が関与していること，および

MPO

活性の抑制効果においては

α

7

nAChRs

の刺激作用以外の経路も関与している可能性を示している．なお，

本検討において，

methyllycaconitine

それ自身が

DSS

腸炎に影響を与えることはなかった (Fig. 17A–C)．

Fig. 16. Effect of PNU282987 on development of DSS-induced colitis.

6 week old ICR mice were treated with 5% DSS for 7 days, and intraperitoneally administered PNU282987 (0.25 mg/kg; n=10, or 0.5 mg/kg; n=13, or 1 mg/kg; n=13) once daily. Disease Activity Index was measured daily (A). The length of the colon (B) and colonic MPO activity (C) were determined at the end of the experimental period. Statistical significances versus normal (n=5) or DSS (n=10) were calculated by Steel’s test (Disease Activity Index) or Dunnett’s test (Length of colon and MPO activity). Values are mean ± S.E.M. **, P<0.01 (versus normal),

^#

, P<0.05 or

^##

, P<0.01 (versus DSS) were considered significant.

day4 day5 day6 day7

0 1 2 3 4 5 6

Disease Activity Index

DSS

PNU282987 0.25 mg/kg

PNU282987 1 mg/kg PNU282987 0.5 mg/kg

(A)

(B)

Length of colon (cm)

(C)

MPO activity (U/g tissue)

DSS PNU282897

(mg/kg) Normal

**

**

**

**

#

#

DSS PNU282987

(mg/kg)

+ + + +

0 0.25 0.5 1

-0 7 8 9

6 10

*

*

## ##

0 20 40 60 80

+ + + +

0 0.25 0.5 1

-0

*

*

#

day4 day5 day6 day7

0 1 2 3 4 5 6

Disease Activity Index

DSS MLA 1 mg/kg MLA + Tropisetron Tropisetron 1 mg/kg (A)

(B)

Length of colon (cm)

7 8 9

6

MLA (1 mg/kg) Tropisetron (1 mg/kg)

(C)

MPO activity (U/g tissue) 0 10 20 30 40

n.s.

n.s.

n.s. 50

DSS

MLA (1 mg/kg) Tropisetron (1 mg/kg)

DSS Normal

**

** **

**

## †

10

*

*

##

+ + + +

-- + - +

-- - + +

-+ + + +

-- + - +

-- - + +

-n.s.

*

*

##

##

Fig. 17. Effect of methyllycaconitine on suppressive effect of tropisetron on development of DSS-induced colitis.

6 week old ICR mice were treated with 5% DSS for 7 days, and intraperitoneally administered methyllycaconitine (MLA) and/or tropisetron once daily. Disease Activity Index was measured daily (A). The length of the colon (B) and colonic MPO activity (C) were determined at the end of the experimental period. Statistical significances versus normal (n=5), DSS (n=15–20), MLA (n=15–20), tropisetron (n=15–20), or MLA and tropisetron (n=14–19) were calculated by Tukey’s test. Values are mean ± S.E.M. **, P<0.01 (versus normal),

^#

, P<0.05 or

^##

, P<0.01 (versus DSS),

^†

, P<0.05 (versus tropisetron) were considered significant. n.s., not significant.

第

4

節

α

7

nAChRs

刺激による

DSS

腸炎抑制効果における炎症性サイトカインの関与

DSS

腸炎の形成には炎症性サイトカインの関与が考えられている．そこで，DSS 腸炎における

α

7

nAChRs

刺激作用の炎症性サイトカインに対する影響を検討した．本検討においては， PNU282987 (1

mg/kg)

の投与により

α

7

nAChRs

の刺激を行った．まず，大腸組織における種々の炎症性サイトカインの

発現に関する検討を行ったところ，

DSS

の投与によりタンパクレベルで有意な

IL-1β， IL-6

および

IFN-γ

の上昇が認められた．また，このうち

IL-6

および

IFN-γ

の上昇は

PNU282987

の投与により有意に抑制 された．この結果は，PNU282987の投与による

α

7

nAChRs

の刺激作用を介した

DSS

腸炎抑制効果にお いて，IL-6および

IFN-γ

が関与している可能性を示している．一方で，DSSおよび

PNU282987

は大腸 組織におけるタンパクレベルでは

TNF-α

の発現に影響を与えることはなかった (Fig. 18A–D)．そこで，

α

7

nAChRs

刺激作用の

DSS

腸炎抑制効果における

TNF-α

の関与について明らかにするために，TNF-α

の大腸組織における

mRNA

レベルでの発現および血清中におけるタンパクレベルでの発現について検 討を行った．その結果，DSS の投与により血清中のタンパクレベルおよび大腸組織の

mRNA

レベルに おいて，ともに有意な

TNF-α

の発現の上昇が認められた．しかしながら，PNU282987 の投与による

α

7

nAChRs

の刺激は

TNF-α

の発現の上昇に影響を与えることはなかった

(Fig. 18E, F)．このことは，

PNU282987

の投与による

α

7

nAChRs

の刺激作用を介した

DSS

腸炎抑制効果において，

TNF-α

は関与して

いない可能性を示している．

Fig. 18. Effect of stimulation of α

₇

nAChR on the protein and mRNA levels of cytokines.

6 week old ICR mice were treated with 5% DSS for 7 days, and intraperitoneally administered PNU282987 (1 mg/kg; n=8) once daily. Colonic and serum samples ware prepared according to the method described in Materials & Methods. And the protein levels of IL-1β (A), IL-6 (B), IFN-γ (C), colonic TNF-α (D), and serum TNF-α (E) were determined by ELISA. The mRNA level of TNF-α (F) was determined by real-time RT-PCR method with the samples of day4 according to the manner written in the material method. Relative expression shown in fig.5F was calculated with Actb as an internal control. Statistical significances versus normal (A-E; n=5, F; n=8) and DSS (n=8) were calculated by Tukey’s test. Values are mean ± S.E.M. *, P<0.05 or **, P<0.01 (versus normal),

^#

, P<0.05 or

^##

, P<0.01 (versus DSS) were considered significant. n.s., not significant.

DSS - + +

PNU282987

(1 mg/kg) - - +

(A)

IL-1β (pg/g tissue) 0 2000 6000 8000

4000

** ^n.s.

(B)

DSS - + +

PNU282987

(1 mg/kg) - - +

0 1000 3000 4000

2000

5000 ** ^##

IL-6 (pg/g tissue)

DSS - + +

PNU282987

(1 mg/kg) - - +

(D)

TNF-α (pg/g tissue)

0 400 1200 1600

800 2000

n.s. n.s.

DSS - + +

PNU282987

(1 mg/kg) - - +

(C)

IFN-γ (pg/g tissue) ^{** #}

0 1000 3000 4000

2000

DSS - + +

PNU282987

(1 mg/kg) - - +

0 1 3 4

2 5

tnf-α relative expression

6 (F)

** n.s.

DSS - + +

PNU282987

(1 mg/kg) - - +

(E)

TNF-α (pg/ml)

0 1 3 4 2 5

* n.s.

6 7

第

5

節 大腸における

α

7

nAChRs

の発現とマクロファージの局在に関する検討

本研究においてこれまでに，

α

7

nAChRs

の刺激作用は炎症性サイトカインの抑制を介して腸炎抑制効 果を示す可能性が示唆された (Fig. 16, Fig. 18)． 一方で，

α

7

nAChRs

はマクロファージに発現している ことが知られているが^{23, 82}，大腸における

α

7

nAChRs

の局在は不明であった．そこで，大腸において

α

7

nAChRs

が発現しているかどうかを確認するために，抗

CD11b

抗体および選択的

α

7

nAChRs

阻害薬であ

る

α-bungarotoxin

を用いて免疫組織化学的解析を行った．その結果，コントロール群の大腸粘膜下層に

おいて，抗

CD11b

抗体陽性細胞（赤色）および

α-bungarotoxin

陽性細胞（緑色）の発現が観察された．

また，DSS処置群では，抗

CD11b

抗体陽性細胞数および

α-bungarotoxin

陽性細胞数の顕著な増加が見ら れ，この増加はともに

PNU282987

投与群では抑制された (Fig. 19A)．さらに，Fig. 19Aに示すように，

大腸において観察された

α-bungarotoxin

陽性細胞のほとんどが抗

CD11b

抗体陽性細胞であった（黄色）．

また，これらの

α-bungarotoxin

および抗

CD11b

抗体ともに陽性である細胞を

α

7

nAChRs

を発現している マクロファージと考え，その数を計測した．その結果，DSSの投与により大腸組織において

α

7

nAChRs

の発現を伴うマクロファージの有意な増加が認められ，その増加は

PNU282987

投与による

α

7

nAChRs

の刺激により有意に抑制された (Fig. 19B)．このことは，DSS腸炎を発症することにより大腸組織にお

いて

α

7

nAChRs

の発現を伴うマクロファージの浸潤が増加すること，および

α

7

nAChRs

の刺激によりこ

れらの現象が抑制されることを示している．

Fig. 19. Effect of stimulation of α

7

nAChR on the level of macrophage proliferation and expression of α

7

ドキュメント内 副作用マネジメントとその評価 (ページ 47-54)