0 hpi 24 hpi 48 hpi 72 hpi

ルシフェラーゼ活性

(×10

3 RLU/sec/g)

接種後時間

3

6 9 12 15

0 24 48 72

CE(NiP)-Luc

CE(NiP)∆P2-5-Luc 非感染

88 図

図 44--44.. GG--88 細細胞胞ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))--LLuucc 株株おおよよびび C

CEE((NNiiPP))∆∆PP22--55--LLuucc 株株ののウウイイルルスス複複製製効効率率のの比比較較

CE(NiP)-Luc 株および CE(NiP)∆P2-5-Luc 株を、G-8 細胞に MOI=1 となるよう接種した。接種 1、3 および 5 日後に各感染細胞を回収し、

ルシフェラーゼ活性を計測した。＊: p<0.05、＊＊: p<0.01 0

5000 10000 15000 20000 25000

1 dpi 3 dpi 5 dpi

ルシフェラーゼ活性 (×102 RLU/sec)

接種後日数

*

**

5 10 15 20 25

1 3 5

z

CE(NiP)-Luc

CE(NiP)∆P2-5-Luc 非感染

89 図

図 44--55.. GG--88 細細胞胞ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))--LLuucc 株株おおよよびび C

CEE((NNiiPP))∆∆PP22--55--LLuucc 株株のの感感染染性性ウウイイルルスス産産生生能能のの比比較較

CE(NiP)-Luc 株および CE(NiP) ∆P2-5-Luc 株を、G-8 細胞に MOI=1 と なるよう接種した。接種 1、3 および 5 日後に培養上清を回収し、フォー カスアッセイによって上清中のウイルス感染価を計測した。エラーバーは 標準誤差を示す（n=3）。＊: p<0.05

2 3 4 5 6

CE(NiP)

CE(NiP)∆P2-5

（ log

10

FFU/ml ） ウイルス感染価

接種後日数

1 3 5

90 図

図 44--66.. GG--88 細細胞胞ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 ののウウイイルルスス RRNNAA 合合成成ににおおけけるる機機能能

空ベクター、pCAGGS-P1 もしくは pCAGGS-P1∆P2-5 を、ルシフェラーゼ発 現ミニゲノムプラスミド、N 蛋白質発現プラスミドおよび L 蛋白質発現プラスミ ドと共に、G-8 細胞に導入した。導入２日後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活 性を測定した。pCAGGS-P1 および pCAGGS-P1∆P2-5 から発現する蛋白質を、

各々P1 および P1∆P2-5 と表記している。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。

ns: p≧0.05

ns

4 8 12 16

ルシフェラーゼ活性 (RLU [x10

3

] / sec)

0 空

空ベベククタターー PP11 PP11∆PP22--55

91

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92 Ŭ Ŭˊˊ

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94

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̊Ŷ6ɫʉLjŽ€l_PBS(̶ƼDzʮĝȰč) : 05913̷LȪ0ǿȂ#*Ŷ RNeasy Plus Mini Kit̶QIAGENʮĝȰč: 74134̷5E-0ďƉǗɫʉF RNA LƘæ#*–ň6ȕŭ5ɰ–#* RNA L̄İ2#0SuperScript Reverse Transcriptase̶InvitrogenʮĝȰč: 18080-044̷E9 Random

95

Primer [hexadeoxyribonucleotide mixture; pd (N)6̶] TaKaRaʮĝȰč: 3801̷ LȪ0cDNALĐƎ#*ÝÀȻ57Ƙæ#*RNA 11 µl5ď1 µl6 10 mM dNTP Mix̶InvitrogenʮĝȰč: 18427-013̷E9˜ʺ6Random

PrimerLö65 15ç̊öț#*Ŷ5dz˜1Ƃá#* 6a’~ŽRNA

ȇĐȅ54 µl65×First-Strand Bufferď1 µl60.1 M DDTRNaseOUT^TM Recombinant Ribonuclease Inhibitor̶InvitrogenʮĝȰč: 10777-019̷ E9SuperScript Reverse TranscriptaseLö25 / 5ç̊50 / 60

ç̊70 / 15 ç̊6ǐµ1öȌ#0 cDNA LĐƎ#Ŷ˥6OŽiQ‡

PCR5ÃȪ%H>14 1Ìń#*

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OOŽŽiiQQ‡‡PPCCRR

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ozq-3-’˽ozq^r•g̶Gapdh̷mRNA6ȸȥ́LÂʮ#*cDNA

LȪ0TaqManǻ5ij/*OŽiQ‡PCR5EGȍň#*%4K,

10 µl6TaqMan Gene Expression Master Mix̶Applied BiosystemsʮĝȰ č: 4369016̷5a’~ŽcDNAL2 µlȇĐ#* 6ȇĐȅ5ďǣȻ˷ºŃ6 TaqMan Assays ̶ Applied Biosystems Ifn-β: Mm00439546 Mx1:

Mm00487796Oas1: Mm00449297E9GAPDH: 4352339E̷L1 µlö ȑʛ˖ɨDzLö0džɬ́20 µl54HE5ˉƴ#*˜ʺˉƴȅL StepOnePlus real-time PCR system̶Applied Biosystems̷LȪ0²™6ǐ µ1ćſ"'*%4K,50 / 2ç̊95 / 10ç̊6țćſ6Ŷ95 / 15 ɍ̊6țĺƃE960 / 1ç̊6Os•’\”¼̈ćſL40aQ[ŽɻGˤ

96

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CE(NiP)∆P2-5 ǙƉǗɫʉ5H Mx1 E9 Oas1 mRNA 6ȸȥ́7

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98

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99

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102

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103

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104 図

図 55--11.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株をを接接種種ししたた GG--88 細細胞胞にに お

おけけるるIIffnn--ββ、、MMxx11おおよよびびOOaass11遺遺伝伝子子のの発発現現量量

G-8 細胞に、CE(NiP)株および CE(NiP)∆P2-5 株を MOI=1 で接種し、接種 24 時 間後に感染細胞における(A) Ifn-β、(B) Mx1 および(C) Oas1 遺伝子発現量をリア ルタイム PCR により定量した。ウイルス希釈液のみを接種したものを、非感染と した。エラーバーは、標準誤差を示す（n=3）。＊: p<0.01

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

mock CE(NiP) koP2-5

IIffnn--ββ mRNA/Gapdh mRNA

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

mock CE(NiP) koP2-5

MMxx11 mRNA/Gapdh mRNA OOaass11 mRNA/Gapdh mRNA

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

mock CE(NiP) koP2-5

(A) (B) (C)

C

CEE((NNiiPP)) CCEE((NNiiPP))

∆PP22--55 非

非感感染染 CCEE((NNiiPP)) CCEE((NNiiPP))

∆PP22--55 非

非感感染染 CCEE((NNiiPP)) CCEE((NNiiPP))

∆PP22--55 非

非感感染染

105 図

図 55--22.. GG--88 細細胞胞ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの IIFFNN 産産生生抑抑制制活活性性のの比比較較

空ベクター、pCAGGS-P1 もしくは pCAGGS-P1∆P2-5 と共に、レポータープラスミ ドの IFNB-pGL3 および導入効率補正用の pRL-Tk を G-8 細胞に導入した。導入 24 時 間後に、さらに Poly (I･C)を各々の細胞に導入した。6 時間培養した後、細胞を回収し、

ルシフェラーゼ活性を測定した。pCAGGS-P1 および pCAGGS-P1∆P2-5 より発現す る蛋白質を、各々P1 および P1∆P2-5 と表記している。ウエスタンブロットにより、

細胞溶解液中のチューブリン、P1 および P1∆P2-5 を検出した結果をグラフ下部に示 している。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。＊: p<0.01

30 46 0 2 4 6 8 10

Empty vector pCAGGS-P1 pCAGGS-P1∆P2-5

IFN-β プロモーター活性 (GL/RL)

Poly (I･C)

�� � �� �

空

空ベベククタターー PP11

�� �

PP11∆PP22--55

チューブリン

�� ��

P1 P1∆P2-5 ns

106

図

図 55--33.. GG--88 細細胞胞ににおおけけるる各各 PP 蛋蛋白白質質アアイイソソフフォォーームムのの IIFFNN 産産生生抑抑制制活活性性

(A) 空ベクター、pCAGGS-P1~-P5 もしくは pCAGGS-N と共に、レポータープラ スミドの IFNB-pGL3 および導入効率補正用の pRL-Tk を G-8 細胞に導入した。導入 24 時間後に、さらに Poly (I･C)を各々の細胞に導入した。6 時間培養した後、細胞を 回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。(B) ウエスタンブロットにより、細胞溶解液 中のチューブリンおよび各 P 蛋白質アイソフォームを検出した。エラーバーは標準誤 差を示す（n=3）。＊: p<0.01

0 3 6 9 12 15

IFN-β プロモーター活性 (GL/RL)

�� � �� � �� � �� � �� � �� �

空

空ベベククタターー PP11 PP22 PP33 PP44 PP55

�� �

N N

�� �� �� �� ��

Poly (I:C)

（A）

46

30 46

Poly (I:C)

�� � �� � �� � �� � �� � �� � �� �

PP22 PP11 PP33 PP44 PP55 N N

空

空ベベククタターー PP11 PP22 PP33 PP44 PP55 NN

チューブリン

（B）

107 ɯ ɯˊˊ

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108

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109 図

図 66 本本研研究究のの結結果果にによよりり考考ええらられれるる ttPPss がが関関与与すするる神神経経侵侵入入性性のの 機

機構構のの模模式式図図

IFN産生 抑制 ウイルス

増殖

筋肉細胞

tPs

感染

末梢神経への感染

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