狂犬病ウイルスP蛋白質アイソフォームが関与する病原性発現機構の解明

Title 狂犬病ウイルスP蛋白質アイソフォームが関与する病原性発_{現機構の解明( 本文(Fulltext) )} Author(s) 岡田, 和真 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第483号 Issue Date 2017-03-13 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/56197 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

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9 H tPs 6˿ʱƃLǟʹ%HȾȻ1…Re:6ɝʂÞƤɑ5EGďǙ6ȴ ăƃLǰ˝#"F5ƉǗ…Re5HďǙ6ÀÞçŢ4F95ɝʂɫʉ 5HďǙ6ķǬøȤLǰ˝#*ɛ5 ə17ɝʂɫʉ5H tPs 6 IFN ȩȨƔîȀƃLǟʹ%H*ACE(NiP)∆P2-5 ǙLƉǗ"'*ɝʂɫʉ5H IFN ˷ºŃ6ȸȥ́Lǟʽ#*"F5ɝʂɫʉ5Hď P ʢȺ˔OQh |U•‡6IFN ȩȨƔîʊLǟʹ#*²˜ȡȟȴRQŽe6ȴăƃȸȥ5 0tPs ǔ*#0Hŵó6ʶƾLʿ?*

10 図 図 11.. PP 遺遺伝伝子子 mmRRNNAA かからら発発現現すするる PP 蛋蛋白白質質アアイイソソフフォォーームムのの模模式式図図 ������� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ���� ���� ���� ������� ���� ���� 欠損 ������������� ���������� ����������� 
��� ：L蛋白質結合領域 1 19 20 53 69 83 297 297aa ��

11

図

図 22.. ここれれままででにに報報告告さされれてていいるる PP33 のの機機能能のの模模式式図図

○A: P3 が STAT1 と結合し、STAT1 の核内移行および核内での DNA との

結合を阻害することが示唆されている(27, 39)。 B: P3 が抗ウイルス蛋白質の PML に結合することが報告されている(2)。 I型IFN STAT1 I型IFN 発現 IFN応答の活性化 PML P3

核

A B

細胞

P3 A

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Ǩ5TaKaRa Ex Taq Hot Start Version ̶TaKaRaʮĝȰč: RR006A̷ 4F95~ŒQ…•2#0 RHNS18(+)E9 RHN7(−)̶ʩ 1-1̷LȪ0Đ Ǝ"I* cDNA L̄İ5 PCR Lʦ4 .6ĺȱŔÚ˹¾Lĕ@ P ˷ºŃ̥ı cDNA Lķŧ#*ÝÀȻ572.5 µl 6 10×Ex Taq Buffer2 µl6dNTP Mixture 0.25 µl &.6 50 µM ~ŒQ…•E9 0.125 µl 6TaKaRa Ex Taq HS Lȑ ʛ˖ɨDz5ö0Û́24 µl 24HE PCR ˉƴȅLÂʮ#*(6 PCR ˉ ƴȅ51l 6̄İ cDNA Lȇě#²™6ǐµ1ćſLʦ-*ˉʮȅL 95 / 5 ç̊6ǐµ1öȌ#*Ŷ95 / 30 ɍ̊6țĺƃ58 / 30 ɍ̊6Os• ’\72 / 1 ç̊6¼̈ćſ6åȦL 30 aQ[ŽɻGˤ#džŶ5 72 / 5 ç̊6ǐµ1ÌȌ#*ķŧŶɥʮ"I*cDNA L̄İ2#0Ȫ0BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit̶Applied BiosystemsʮĝȰč: 4336917̷ 5EGc•[T’ećſLʦ-*4~ŒQ…•57RHN28(+)LȪ*

17

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24 RQŽeL ˷ºŃ mRNA ˜5ńĬ%H 2 ȰȾ6̉Ł_q’F6ɿʼË˯" IH 2LĴĘ#0H²˜6 2FȡȟȴRQŽeƉǗɫʉ50 BƉǗïȔ5E-0ȸȨ#*epe tPs 6ȸȥL˄Ŕ#0HČʊƃ ʀFIH njɅɔ17CE(NiP)∆P2-5 ǙLÂæ%H*AP ˷ºŃ˜6 tPs 6ɿʼ̉ Łȗ1H̻.6̉Ł_q’ AUG̶Met̷LÛ0 AUA̶Ile̷:2ĺȱ"' *̶ħ1-1̷ 6 Met L Ile :2ɼƨ%HO†v˽ĺȱ7P3 6ɿʼ̉ŁȗL Ɲ*4!–˹6̀ĻȁʦǙ́Ä: V123.DG̶GenBank ȹ̅Ȱč: AF369318̷ E9 V124DG̶AF369319̷͂1Bɇ˃"I0Hĺȱ1H̶28̷>* Met E9 Ile 7Ü5ȲDzƃO†v˽5ç̫"IH 2FďO†v˽6ɼƨ 7P1 6çŃǡˬE9(6Ǧʊ5ĽŴ̢#42£Ƈ"IH"F5² ð6Ʌɔ50ȡȟȴRQŽeSAD L16 Ǚ6˷ºŃƮÂ5EGP2P3 E9P5 6̉Ł_q’5 Ile L_•q%HĶijLŔÚ#*ĺȱǙÂæ"I0 H(6Ʌɔ17IJ̬ɫʉ5HđĺȱǙE9ÖǙ1HSAD L16 Ǚ 6ķǬʊLǰ˝#0GǙ6ķǬʊđɜ1H 2Lɉ#0H̶30̷ ²˜EGnjɅɔ17CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6Âæ6*AtPs 6̉Ł_q’LIle L_•q%HAUA 5ɼƨ%H 22#*

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NA ɫʉ5H CE(NiP)∆P2-5 ǙE9 CE(NiP)Ǚ6ķǬʊLǟʹ#*ɯ ǔƤɑ̼ƼŶ5HǙ6ƉǗÇ̊5Ljƈš˃AFI4-* 2F Ǚ7đɜ6ķǬʊLLj#0H 2ɉ"I*̶ħ 1-4̷ 6Ǝɹ7 CE(NiP)∆P2-5 ǙtPs 6ȸȥʊLǧĿ#..BIJ̬Ɋɮɫʉ5HķǬ ʊLÌƝ#0H 2Lɉ#0H IF6Ʉʲ2đǢ5ð˥#*SAD L16 ĺȱǙBtPs 6ȸȥʊLǧĿ#..ÖǙ2đɜ6ķǬʊLÌƝ#0H 2 ɉ"I0H̶4̷²˜EGIJ̬ɫʉ5HRQŽeķǬ5 tPs 6ȸȥ žʱ174 2FtPs 7RQŽe6ķǬ5ž̤4ŵóLƝ*4O[f a•ʢȺ˔1H2ʀFI* ɛ1 ə17P ˷ºŃ:6ĺȱŔÚ4F95 tPs ȸȥʊ6ǧĿLɇ˃# CE(NiP)∆P2-5 Ǚ 6  æ 5 Ǝ õ # *  " F 5  IJ ̬ Ɋ ɮ ɫ ʉ 5   H CE(NiP)∆P2-5 ǙE9 CE(NiP)Ǚ6ķǬøȤđɜ1-* 2EGtPs O[fa•ʢȺ˔1H 2ƾF24-*

26 表 表 11--11.. ダダイイレレククトトシシーーククエエンンススにに使使用用ししたたププラライイママーー プライマー 方向 a _{配列（5’ → 3’） アニール部位} b RHNS18(+) F ACTTTGTTGGATGCTATATGGG 1008 - 1029 RHN7(-) R GTTCATTTTGTCAGTGGTGTTGCCCG 2502 - 2477 RHN28(+) F AGTCAGTTCCAATCATCAAGCCCGT 1348 - 1372 a : F（フォワードプライマー）、R（リバースプライマー） b : 狂犬病ウイルス西ヶ原株（Accession No.AB044824）の完全長ゲノム配列に基づく 塩基番号

27 表 表 11--22.. ppCCAAGGGGSS--PP11~~ --PP55 のの作作製製にに使使用用ししたたププラライイママーー プライマー 方向a _{配列（5’ → 3’）} P1(+) F ACGGAGCTCAATATGAGCAAGATCTTCGT P2(+) F TTACTTCGAATTCTGAGACGATGGCTGAAGAGACTGTT P3(+) F TTACTTCGAATTCTGAGACCATGAGCCGA P4(+) F TTACTTCGAATTCTGAGACGATGTCCAAA P5(+) F TTACTTCGAATTCTGAGAAGATGGATGAAGGA P(-) R CAGCGAGGTGCTAGCTTAGCAAGATGCATAGCGA a_{: F（フォワードプライマー）、R（リバースプライマー）}

28

図

図 11--11.. CCEE((NNiiPP))株株 ((AA)) おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株 ((BB)) ののゲゲノノムム 構 構成成、、ななららびびにに各各 PP 遺遺伝伝子子 mmRRNNAA かからら発発現現すするる PP 蛋蛋白白質質 ア アイイソソフフォォーームムのの模模式式図図 白丸（○）は P 遺伝子上に導入された変異[AUG→AUA（+鎖として表示）]を示す。 αP1-5: 抗 P 蛋白質ペプチド抗体 ��� �� N N PP MM GG LL CE(NiP) -C N- P1 P2 P3 P4 P5 1 20 53 69 83 Met Met Met Met Met

Met Met Met Met Met Met Met Met Met Met 297 CE(NiP) ∆P2-5 転写

P mRNA AUG AUG AUG AUG AUG (A)x

翻訳

��� ��

-C N-

P1 Met Ile Ile Ile Ile

転写

P mRNA AUG AUA AUA AUA AUA (A)x

翻訳 ゲノムRNA

（A）

（B）

187 197 αP1-5認識領域

29

図

図 11--22.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株感感染染 NNAA 細細胞胞にに お おけけるるアアイイソソフフォォーームムのの発発現現パパタターーンン CE(NiP)株および CE(NiP)∆P2-5 株の感染 NA 細胞を、P1～P5 を 発現させるため各々pCAGGS-P1～-P5 を導入した NA 細胞と共に、 ウエスタンブロットにより解析した。

30

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

空空

ベベ

クク

タタ

ーー

非非

感感

染染

PP33

PP11 PP22

PP44 PP55

CCEE

((NN

iiPP))

CCEE

((NN

iiPP))

∆PP

22--

55

チューブリン

P2

P1

P3

30 図 図 11--33.. ダダイイレレククトトシシーーククエエンンススにによよるる CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株 PP 遺遺伝伝子子上上のの 変 変異異導導入入箇箇所所のの配配列列分分析析 矢印（↓）は変異導入箇所を示す。 AATATGAGC GAGATGGCT 西ヶ原株由来 P遺伝子配列 ダイレクト シークエンス結果 

P1 (開始コドン) P2 P3 

AGGATGTCC 

CAGATGGAT P4 P5 



A A ATATG A150GCAT200G AGATAGCTGG G300ACATA AGC C GACATGAGC TAG G350ATATC CATC390AGATAGATG

31

図

図 11--44.. NNAA 細細胞胞ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの 増

増殖殖能能のの比比較較

CE(NiP)株および CE(NiP)∆P2-5 株を、MOI=0.01 の条件で NA 細胞に 接種した。接種後 1、3 および 5 日目に培養上清を回収した後、フォー カスアッセイによって上清中のウイルス感染価を計測した。 （ log 10 FFU/ml ）




2 4 6 8 10 1 3 5 C CEE((NNiiPP)) C CEE((NNiiPP))∆PP22--55

接種後日数

32

ɛ

2 ə

CE(NiP)∆P2-5 Ǚ5ŔÚ#*ĺȱ

P1 6Ǧʊ5Ć=%Ŵ̢

33

Ŭ

Ŭˊ

ˊ

ɛ1 ə50tPs 6ɿʼ̉Łȗ1H̉Ł_q’:6ĺȱŔÚ5E-0 tPs 6ȸȥʊLǧĿ#* CE(NiP)∆P2-5 ǙLÂæ#*##4FďOQh | U • ‡ 6 ̉ Ł _ q ’  đ $ O † v ˽ 6 ˈ ? Ǖ Þ 5 ń Ĭ % H * A 5  CE(NiP)∆P2-5 Ǚȸȥ%H P1 57ˆkVs’̶Met̷FQhQc’̶Ile̷ :6ʸ̻.6O†v˽ĺȱŔÚ"IH̶ɛ 1 ə ħ 1-1̷ I>16ĴĘ5 EGP1 7 RNA Æńƃ RNA „ˆŒ•gÜĦŃ2#0RQŽe RNA ĐƎ5 ž̤6ŵóLƝ. 2ƾF24-0H̶44̷"F5IFN ȩȨE9 ſɞL(I)Ȉŋ%HIFN O’i`sepȀƃLLj%H 2ĴĘ"I0 H̶4, 5, 16, 35, 38-40̷ŷ-0CE(NiP)∆P2-5 ǙLȪ0ȴăƃ5H tPs 6˿ʱƃLʾÇ%HĵĐđǙ tPs 6ȸȥʊLǧ2đƿ5đǙ6 P1 ð˥6ǦʊLÌƝ%H 2ðƧ24H%4K,̻.6O†v˽ĺȱ CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 6Ǧʊ5›HŴ̢Lǟʽ%HžʱH

RQŽeRNA ĐƎ5H P1 6ǦʊƃLǟʹ%H*Anjə17†s^v ‡OlfQLʦ 22#*̶ħ2-1̷ I>1BȡȟȴRQŽeLĕ@… QrĕRNA RQŽe6 RNA „ˆŒ•gȀƃ6ʾÇ6*A5†s^v‡ OlfQʦKI0*̶29, 31̷njOlfQ17†s^v‡ RNA Lȸȥ %H†s^v‡~Œe†q4F95P ʢȺ˔N ʢȺ˔E9 L ʢȺ˔ȸȥ ~Œe†qLIJ̬ɫʉ5ÜŔÚ%H 21ʦKIHɫʉÞ5ȸȥ"IH†s ^v‡RNA 7RQŽe RNA 6˚à”ʯʮ5˿ʱ24H^v‡Njɚ6̠_ •q̥ı6˻é̶3’•j•E9 5’p•Œ•˻é̷LƝ, IF6̊5Ž c|SŒ•g˷ºŃƟÚ"I*ǡˬLƝ.̶ħ2-1A̷ 6†s^v‡ RNA

34

~Œe†qFȸȥ"I* PN E9 L ʢȺ˔2ɯĐ%H 21t[ VW~cqŲƎ"IH(6ɯǔRNA „ˆŒ•g1H L ʢȺ˔2( 6ÜĦŃ6 P ʢȺ˔̶P1̷5E-0†s^v‡ RNA 6ʯʮ4F95Žc |SŒ•g˷ºŃ mRNA 6˚à˕ H̶ħ 2-1B̷²˜6ăȦEG†s ^v‡OlfQLʦ 21RQŽeRNA ĐƎ5H P1 6ǦʊƃLŽ c|SŒ•gȀƃ5ij/ʾÇ%H 21H –ƹP1 6 IFN O’i`sepȀƃLʾÇ%H*A5njə17ďɑ~ ‰•i•Ȁƃ6ȍň5ǵȪ"IH„•i•OlfQLȪH 22#*– ʗȻ5„•i•OlfQ17Žc|SŒ•g˷ºŃ436„•i•˷ ºŃ6˜ȁ5Ȁƃȍň6Œˏ24H~‰•i•̥ıLƝ.~Œe†q̶ „•i•~Œe†q̷LÃȪ%Hnj~Œe†qLŔÚ#*IJ̬ɫʉ50 Œˏ6~‰•i•6ȀƃûLŮ˕ %c\rŽº˳ɦLïȔ%H 21 „•i•~Œe†qEGŽc|SŒ•g˷ºŃ mRNA 6ȸȥ˄Ŕ"IH (6*Aűˀ~‰•i•ȀƃLŽc|SŒ•gȀƃ5ij/ʾÇ%H 2 Čʊ24H²˜6E4„•i•OlfQ6ȞƃEGIFN-β ~‰• i•>*7 ISRE ĕLj~‰•i•LƝ.„•i•~Œe†qLȪI8 (I)I IFN ȩȨ>*7ſɞ5Œ%H P1 6ƔîȀƃLʾÇ%H 21H ̶ħ2-2 E9-3̷

ɛ2 ə17CE(NiP)∆P2-5 Ǚ5ŔÚ#*̻.6O†v˽ĺȱ P1 6Ǧʊ5 Ŵ̢%H3Lǟʽ%HȾȻ1†s^v‡OlfQ5EGCE(NiP)∆P2-5 Ǚ6P1 6RQŽe RNA ĐƎ5HǦʊL>*„•i•OlfQ5EG (6IFN O’i`sepȀƃLʾÇ#*

35

ǎ

ǎƶ

ƶ

E

E9

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IJ IJ̬̬ɫɫʉʉ NA ɫʉLɛ 1 ə5ʺ˞#*ƹǻ5E-0IJ̬#*>*zpɊɮʙɫʉʏ ȬǑ SYM-I ɫʉ̶[ˑ]Ȩȩ̉ȸɌŅɅɔƏ «˺ĽŅĒ˂ƱƠ ǸĐƾųĂĹE Gç›̷LCO2Q’Y‹€•i•̶zŒa‘̷Þ1IJ̬#*̶37 ʻň CO2 ȕŭ̾5%̷SYM-I ɫʉ6 GM 2#010%FCS̶GibcoʮĝȰč: 10437-028̷ ȈöE-MEM̶ƼDzʮĝȰč: 05900̷LȪ* ~ ~ŒŒee††qq ď P ʢȺ˔OQh|U•‡6ȸȥ~Œe†q2#0ɛ 1 ə5ʺ˥#* pCAGGS-P1-P5 LÃȪ#*>*CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 Lȸȥ%H~Œ e†qLÂʮ%H*ACE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 ˷ºŃ̥ıLĕ@ cDNA L PCR 5EGķŧ#pCAGGS/MCS 6[•s’\˹¾5ƟÚ#*Âʮ#* CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 Lȸȥ%H~Œe†qL pCAGGS-P1∆P2-5 2ĚĒ#* "F5tPs 6ȸȥLƔî%HȾȻ1N Njɚ5 GFP LʤĐ#* P1 Lȸȥ% H~Œe†qLÂʮ#*̶ħ2-4̷ÝÀȻ57CE(NiP)ǙE9 CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6P1 ˷ºŃ̥ıLĕ@ cDNA L PCR 5EGķŧ#*(6Ŷ 6ķŧȩ ȝL pEGFP-C1̶Clontech̷6 GFP ˷ºŃ6™ȁ5ńĬ%H[•s’\˹ ¾5O†v˽6ˈ?Ǖđ$54HEƟÚ#*N NjɚÑ5 GFP ʤĐ" I* CE(NiP)ǙE9 CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 Lȸȥ%H~Œe†qL(I )IpEGFP-P1 E9 pEGFP-P1∆P2-5 2ď6~Œe†qEGȸȥ"IH GFP ʤĐİ P1 L GFP-P1 E9 GFP-P1∆P2-5 2ĚĒ#*IFN ȩȨL˄Ŕ

36

%H~‰•i•ȀƃȍňȪ6„•i•~Œe†q2#0‚iŽŽc|S Œ•g̶GL̷˷ºŃ6˜ȁ5 IFN-β ~‰•i•˻éLLj%H IFNB-pGL3 ̶McGill UniversityRongtuan Lin ĂĹEGç›̷LȪ*>*IFN ſ ɞL˄Ŕ%H~‰•i•ȀƃȍňȪ6„•i•~Œe†q2#0GL ˷º Ń6˜ȁ5 ISRE Lĕ@~‰•i•˻éLLj%H pISRE-luc̶Stratagene ʮĝȰč: 219092̷LȪ*ŔÚøȤʭǩȪ~Œe†q57R†cQi]Ž c|SŒ•g̶RL̷˷ºŃ6˜ȁ5āɨŽeRQŽek†d’Yr•g~ ‰•i•̥ıLLj%HpRL-Tk̶PromegaʮĝȰč: E2241̷LȪ*

† s ^ v ‡ ~ Œ e † q  ʮ 6 * A  ² ð 6 Ʌ ɔ 5   0  ʮ " I * pRVDI-luc̶40̷L̄İ2#0 PCR Lʦw’…•lqݍƒbQ‡  ȡ ȟȴRQŽe^v‡5’p•Œ•˻é  GL  ȡȟȴRQŽe^v‡ 3’•j •˻é  oŽiʃȖRQŽeƒbQ‡6̣5ď˷ºŃ̥ıLĕ@ cDNA L ķŧ#*ķŧȩȝL pCAGGS/MCS 5ƟÚ%H 21†s^v‡~Œe† qpCAGGS-RVDI-Luc LÂʮ#*>*Ni-CE Ǚ6^v‡~Œe†qL̄İ 2#0 PCR LʦL ˷ºŃ̥ıLĕ@ cDNA Lķŧ#*(6ķŧȩȝL pCAGGS/MCS 6[•s’\˹¾5ƟÚ%H 21L ʢȺ˔ȸȥ~Œe† q6 pCAGGS-CEL LÂʮ#*pCAGGS-CEN 7²ð6Ʌɔ50Âʮ "I*B6LÃȪ#*̶22̷ SSDDSS--PPAAGGEE EE99RRTTeeii’’}}llpp ɭɺIJ̬~•p̶Greiner bio-one24RSŽʮĝȰč: 662160̷5IJ̬ # *NAɫʉ51RSŽ*G0.8g6pCAGGS-P1~-P5pEGFP-C1

37 pEGFP-P1>*7pEGFP-P1∆P2-5LŔÚ#* 62~Œe†qŔÚʿʟ 2#0Lipofectamine 2000̶InvitrogenʮĝȰč: 11668027̷LÃȪ#*Ŕ Ú2ƼŶ5ď6ɫʉLPBS5E-0ǿȂ#*Ŷ50l6Sample Buffer Solution (2ME+) (2) (ěØʮʟʮĝȰč: 196-11022) LȪ0Ȑʶ#*ɫ ʉ Ȑ ʶ ȅ ž 6 ʢ Ⱥ ˔ L ț ĺ ƃ " ' * Ŷ  ɛ1ə5ʺ˞#*ƹǻ5ŷ SDS-PAGEE9RTei’}lp5E-0ʶǓ#*>*Ŷ˥6„• i•OlfQ5ȪFI*SYM-IE9NAɫʉ6ȐʶȅBRTei’}l p5EGʶǓ#*4SYM-Iɫʉ6ʶǓ57–ǨƖÀ2#0ƖRQŽePʢ Ⱥ˔RaZ„[•rŽƖÀ̶[ˑ]Ȩȩ̉ȸɌŅɅɔƏ
«˺ĽŅĒ˂ƱƠ
ǸĐƾųĂĹEGç›̷LȪ* † †ss^^vv‡‡OOllffQQ ɭɺIJ̬~•p̶Greiner bio-one24 RSŽʮĝȰč: 662160̷5IJ̬ #*NA ɫʉ51 RSŽ*G 0.12 g 6 pCAGGS-P1pCAGGS-P1∆P2-5 >*7 pCAGGS/MCS 2Ü50.8 g 6 pCAGGS-RVDI-Luc0.4 g 6 pCAGGS-CEL E9 1.2 g 6 pCAGGS-CEN LŔÚ#* 62~Œ e†qŔÚʿʟ2#0Lipofectamine 2000̶InvitrogenʮĝȰč: 11668027̷ LÃȪ#*37 1 2 Ƽ̊IJ̬#*ɫʉLjŽ€l_ PBS()̶ƼDzʮĝȰč: 05913̷LȪ0ǿȂ#*Ŷ100 µl 6 Cell Culture Lysis Reagent̶Promega ʮĝȰč: E1531̷LȪ0Ȑʶ#−80 1ãɯ#*ʤʶ#*ɫʉȐʶȅL Ƭƚ#12,000 ×g / 4℃ / 2 ç̊6ǐµ1˵ŽŶLuciferase assay system ̶PromegaʮĝȰč: E1500̷5E-0˜ȉ 10 µl ž6Žc|SŒ•gȀƃL

38

ȍň#*Žc|SŒ•gȀƃ7Relative Light Unit (RLU)/sec 2#0ʩʺ #*4˜ʺ6~Œe†qŔÚɫʉ5.071 ǐµ*G̺RSŽLȪ ƈ#ď6Žc|SŒ•gȀƃÐ6ŨĮÐE9ǣȏˆšLɟæ#*ɰʸ åȦ57çƲçǓE9Dunnett 6ļ˿ǟňLȪ*



„„••ii••OOllffQQ55EEHHIIFFNN--ββ ~~‰‰••ii••ȀȀƃƃ66ȍȍňň

ɭɺIJ̬~•p̶Greiner bio-one24 RSŽʮĝȰč: 662160̷5IJ̬ #*SYM-I ɫʉ51 RSŽ*G 0.12 g 6 pEGFP-P1pEGFP-P1∆P2-5 >*7pEGFP-C1 2Ü50.25 g 6 IFNB-pGL3 E9 0.04 g 6 pRL-Tk ̶PromegaʮĝȰč: E2241̷LŔÚ#* 62~Œe†qŔÚʿʟ2 #0Lipofectamine 2000̶InvitrogenʮĝȰč: 11668027̷LÃȪ#*( 6Ŷ37 1 24 ƿ̊IJ̬#*ɫʉ55 g 6 2 nj̆ RNA Or\6 Poly (I̓ C)LŔÚ#*"F5 37 1 24 ƿ̊IJ̬#*ɫʉLjŽ€l_ PBS()̶ƼDz ʮĝȰč: 05913̷LȪ0ǿȂ#*Ŷ100 µl 6 Passive Lysis Buffer̶Promega ʮĝȰč: E1941̷LȪ0Ȑʶ#−80 1ãɯ#*ʤʶ#*ɫʉȐʶȅL Ƭƚ#12,000 ×g4 2 ç̊6ǐµ1˵ŽŶDual-Luciferase Reporter Assay System̶PromegaʮĝȰč: E1910̷5E-0˜ȉ 10 µl ž6Žc|SŒ•g ȀƃLȍň#*4a’~Ž̊6~Œe†qŔÚøȤ6šȱ5EHŴ̢L ʭǩ%H*AŸFI* GL Ȁƃ6ÐL RL Ȁƃ6Ð1ó-*B6L IFN-β ~ ‰•i•Ȁƃ2#0ʩɉ#*˜ʺ6~Œe†qŔÚɫʉ5.071 ǐµ *G̺RSŽLȪƈ#ď6Žc|SŒ•gȀƃÐ6ŨĮÐE9ǣȏˆ šLɟæ#*ɰʸåȦ57çƲçǓE9Dunnett 6ļ˿ǟňLȪ*

39



„„••ii••OOllffQQ55EEHHIISSRREE ȀȀƃƃ66ȍȍňň

ɭɺIJ̬~•p̶Greiner bio-one 24 RSŽʮĝȰč: 662160̷5IJ ̬#*NA ɫʉ51 RSŽ*G 0.12 g 6 pEGFP-P1pEGFP-P1∆P2-5 >*7pEGFP-C1 2Ü50.25 g 6 pISRE-luc E9 0.04 g 6 pRL-Tk L Ŕ Ú # *  6 2   ~ Œ e † q Ŕ Ú ʿ ʟ 2 # 0 Lipofectamine 2000 ̶InvitrogenʮĝȰč: 11668027̷LÃȪ#*(6Ŷ37 1 24 ƿ̊IJ̬ #*ɫʉ51,000U/ml 6ȕŭ1 IFN-α̶PBL Assay ScienceʮĝȰč: 1120-1̷ LåȦ#*"F537 1 6 ƿ̊IJ̬#*ɫʉLjŽ€l_ PBS(-)̶ƼDzʮ ĝȰč: 05913̷LȪ0ǿȂ#*Ŷ100 µl 6 Passive Lysis Buffer̶Promega ʮĝȰč: E1941̷LȪ0Ȑʶ#−80 1ãɯ#*ð˥6 IFN-β ~‰• i•Ȁƃ6ȍň2đǢ6ƹǻ5E-0ɫʉȐʶȅž6GL ȀƃE9 RL Ȁƃ Lȍň#*ŸFI*GL Ȁƃ6ÐL RL Ȁƃ6Ð1ó-*B6L ISRE Ȁƃ2 #0ʩɉ#*˜ʺ6~Œe†qŔÚɫʉ5.071 ǐµ*G̺RSŽL Ȫƈ#ď6Žc|SŒ•gȀƃÐ6ŨĮÐE9ǣȏˆšLɟæ#*ɰ ʸåȦ57çƲçǓE9Dunnett 6ļ˿ǟňLȪ*

40

ɯ

ɯǔ

ǔ

R

RQQŽŽeeRRNNAA ĐĐƎƎ55HHCCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 ǙǙPP11 66ǦǦʊʊƃƃ

RQŽeRNA ĐƎ5H CE(NiP)∆P2-5 Ǚ P1 6ǦʊƃLǟʹ%HȾȻ1 CE(NiP)∆P2-5 Ǚ>*7 CE(NiP)Ǚ6 P1 Lȸȥ"'* NA ɫʉLȪ0†s^ v‡OlfQLʦ-*̶ħ2-5̷ɕ€[i•LŔÚ#*ɫʉ5HŽc|S Œ•gȀƃ 374 RLU/sec 1-*65Œ#CE(NiP)Ǚ6 P1 Lȸȥ"'* ɫʉ174.6104 _{RLU/sec 6Žc|SŒ•gȀƃǟæ"I* 6ɯǔEG}

P1 ȸȥɫʉ50†s^v‡ RNA 6ʯʮ4F95Žc|SŒ•g˷ºŃ mRNA 6˚à˄˕"I0H 2ɇ˃"I*"F5CE(NiP)∆P2-5 Ǚ 6 P1 Lȸȥ"'*ɫʉ50B4.5104 _{RLU/sec 6Ðǟæ"I} CE(NiP)∆P2-5 Ǚ>*7 CE(NiP)Ǚ6 P1 Lȸȥ"'*ɫʉ5HŽc|SŒ •gȀƃ6̊5Ljƈš7˃AFI4-*̶p 0.05̷ŷ-0CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 7CE(NiP)Ǚ6 P1 2đɜ6 RNA „ˆŒ•gÜĦŃ2#06Ȁƃ LÌƝ#0H 2ɉ"I* C

CEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 ǙǙPP11 66IIFFNN ȩȩȨȨƔƔîîȀȀƃƃ

„•i•OlfQ17tPs 6̠ńĬ™1 P1 Ǧʊ6ʾÇLʦ*A GFP-P1∆P2-5 E9 GFP-P1 L(I)Iȸȥ%H pEGFP-P1∆P2-5 E9 pEGFP-P1 LÃȪ#* IFLŔÚ#* NA ɫʉLRTei’}lp1ʶ Ǔ#*ɯǔ3,F6~Œe†qLŔÚ#*ɫʉ50B tPs 6x’q7ǟ æ"I&GFP-P1∆P2-5 E9 GFP-P1 6x’q6?ǟæ"I*̶ħ 2-6̷ ( 1CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1  IFN ȩȨLƔî%HȀƃLÌƝ#0H

41

3ǟʹ%HȾȻ1GFP-P1∆P2-5 E9 GFP-P1 Lȸȥ"'* SYM-I ɫ ʉ5H IFN-β ~‰•i•ȀƃL„•i•OlfQ5EGǰ˝#*̶ħ 2-2 E9-7̷ɕ€[i•LŔÚ#*̓ƃŒȚ6ɫʉ17Poly (I̓C)6åȦ 5EG IFN-β ~‰•i•Ȁƃû"I*–ƹ1GFP-P1∆P2-5 >*7 GFP-P1 Lȸȥ"'*ɫʉ17IFN-β ~‰•i•Ȁƃ̓ƃŒȚ6ɫʉ5 HđȀƃ6ɧ1/2 24GLjƈ5Ɣî"I*̶p̿0.05̷>*GFP-P1∆P2-5 E9GFP-P1 Lȸȥ"'*ɫʉ5H IFN-β ~‰•i•Ȁƃ6̊5Ljƈ š7˃AFI4-*̶p≧0.05̷Poly (I̓C)LåȦ#*ɫʉ6ȐʶȅLRTe i’}lp5E-0ʶǓ#*ɯǔđɜ6c\rŽŰŭLƝ.GFP-P1∆P2-5 E9GFP-P16x’qɇ˃"I*²˜6ɯǔEGCE(NiP)∆P2-5Ǚ6 P1 7CE(NiP)Ǚ6 P1 2đɜ6 IFN ȩȨƔîȀƃLLj#0H 2ɉ"I*

C

CEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 ǙǙPP11 66IIFFNN ſſɞɞƔƔîîȀȀƃƃ

CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1  IFN ſɞƔîȀƃLÌƝ#0H3Lǟʹ %HȾȻ1GFP-P1∆P2-5 E9 GFP-P1 Lȸȥ"'* NA ɫʉ5H ISRE ȀƃL„•i•OlfQ5EGǰ˝#*̶ħ 2-3 E9-8̷ɕ€[i•LŔ Ú#*̓ƃŒȚ6ɫʉ17IFN-α 6åȦ5EGISRE 6Ȁƃûɇ˃"I* –ƹ1GFP-P1∆P2-5 >*7 GFP-P1 Lȸȥ"'*ɫʉ17ISRE Ȁƃ̓ ƃŒȚ6ɫʉ5HđȀƃ6ɧ 1/20 F 1/30 24GLjƈ5Ɣî"I* ̶p<0.01̷>*GFP-P1∆P2-5 E9 GFP-P1 Lȸȥ"'*ɫʉ5H ISRE Ȁƃ6̊5Ljƈš7˃AFI4-*̶p 0.05̷IFN-α LåȦ#*ɫʉ 6ȐʶȅLRTei’}lp5E-0ʶǓ#*ɯǔđɜ6c\rŽŰŭL

42

Ɲ . GFP-P1∆P2-5 E9 GFP-P1 6x’qǟæ"I*²˜EG CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 7CE(NiP)Ǚ6 P1 2đɜ6 IFN ſɞƔîȀƃLLj# 0H 2ɉ"I*

43

ʀ

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CE(NiP)∆P2-5 Ǚȸȥ%H P1 6RQŽe RNA ĐƎ5HǦʊƃLʾ Ç%H*ACE(NiP)∆P2-5 Ǚ>*7 CE(NiP)Ǚ6 P1 Lȸȥ"'*ɊɮȬǑ NA ɫʉLȪ0†s^v‡OlfQLʦ-*(6ɯǔCE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1  RNA „ˆŒ•gÜĦŃ2#06ȀƃLÌƝ#(6Ȁƃ7 CE(NiP)Ǚ 6P1 2đɜ1H 2ɉ"I*̶ħ 2-5̷ 6Ǝɹ7NA ɫʉ5H CE(NiP)∆P2-5 ǙE9 CE(NiP)Ǚ6ķǬøȤđɜ1-* 22B–ʔ% H̶ɛ1 ə ħ 1-4̷²˜EGCE(NiP)∆P2-5 Ǚ5ŔÚ"I*ĺȱ7RQ ŽeRNA ĐƎ5H P1 6Ǧʊ5Ŵ̢#4 2ɉ"I*

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44 ̖P1ȸȥ~Œe†q2#0pEGFP-P1∆P2-5E9pEGFP-P1LÃȪ#* IF6~Œe†q˜17GFP˷ºŃ6̉Ł_q’Fƒh•‡5EHɿ ʼŁ>HGFP˷ºŃ6̉Ł_q’2tPs6đ_q’6˗̛̛I0H*A •Y•eYŠs’\5EHtPs6ɿʼî̐"IH2ʀ*ʼn̖5 pEGFP-P1∆P2-5E9pEGFP-P1LŔÚ#*ɫʉLRTei’}lp5E -0ʶǓ#*ɯǔtPs6ȸȥ7ǟæ"I&GFP-P1∆P2-5E9GFP-P16ȸ ȥ6?ɇ˃"I*̶ħ2-6̷²˜EGtPs6̠ńĬ™50CE(NiP)∆P2-5 Ǚ  E 9CE(NiP) Ǚ 6 P1 6 IFN O ’ i ` s e p Ȁ ƃ L ǰ ˝ % H ˜ 1  pEGFP-P1∆P2-5E9pEGFP-P1LjȪ1H2ʀFI* njə17CE(NiP)∆P2-5Ǚ6P16IFNO’i`sepȀƃLʾÇ%H*A GFP-P1∆P2-5E9GFP-P1Lȸȥ"'*IJ̬ɊɮɫʉLȪ0„•i•O lfQLʦ-*(6ɯǔCE(NiP)∆P2-5Ǚ6P1IFNȩȨE9ſɞLƔ î%HȀƃLÌƝ%H 2ɉ"I*̶ħ2-7E9-8̷ I>16Ʌɔ5E -0P16IFNȩȨƔîȀƃ5176181¾>*IFNſɞƔîȀƃ5267297 ¾6̥ı˿ʱ1H 2ƾF24-0H̶30, 38̷ IF6̥ı5 CE(NiP)∆P2-5Ǚ6P15ŔÚ"I*4.6O†v˽ĺȱ˹¾̶205369E9 83¾̷7ĕ>I0F&ɯǔ2#0đǙ6P17IFNO’i`sepȀƃLĿ K4-*2ʀFI* ɛ2 ə17CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 RNA „ˆŒ•gÜĦŃ2#06 Ȁƃ4F95IFN O’i`sepȀƃLÌƝ%H 2ɉ"I*²˜EG CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 5ńĬ%H̻.6O†v˽ĺȱ7(6Ǧʊ5Ŵ̢#4  2ƾF24-*

45

(A)

(B)

図 図 22--11.. ((AA))ミミニニゲゲノノムムププララススミミドドのの模模式式図図 ((BB))ミミニニゲゲノノムムアアッッセセイイのの原原理理のの模模式式図図 ルシフェラーゼ : ハンマーヘッドリボザイム : デルタ肝炎ウイルスリボザイム : 5’トレーラー配列 : 3’リーダー配列 N N PP LL N N LL

培養細胞

ル ルシシフフェェララーーゼゼ ヌクレオカプシド ミニゲノムRNA PP 発 発光光 PP、、NNおおよよびびLL発発現現ププララススミミドド リボザイムによる自己切断

46 図 図 22--22.. IIFFNN--ββ ププロロモモーータターーレレポポーータターーアアッッセセイイのの模模式式図図 ル ルシシフフェェララーーゼゼ

P

ル ルシシフフェェララーーゼゼ IIFFNN--ββププロロモモーータターー

：

：

PP レ レポポーータターーププララススミミドド プPP蛋プラ蛋白ラス白質スミ質発ミド発現ド 現 PPoollyy((II･･CC))

P

シグナル伝達 抑制 発 発光光 I型IFN

47 図 図 22--33.. IISSRREE レレポポーータターーアアッッセセイイのの模模式式図図 ル ルシシフフェェララーーゼゼ

P

ル ルシシフフェェララーーゼゼ IISSRREE含含有有ププロロモモーータターー

：

：

PP レ レポポーータターーププララススミミドド プPP蛋プラ蛋白ラス白質スミ質発ミド発現ド 現

P

発 発光光 IIFFNN--αα IFN誘導性因子 シグナル伝達 抑制

PP

48 図 2-4. pEGFP-P1 および pEGFP-P1∆P2-5 から発現する GFP-P1 および GFP-P1∆P2-5 の模式図

GFP P1

GFP P1∆P2-5

pEGFP-P1

pEGFP-P1∆P2-5

pEGFP-C1

ベクター

GFP-P1

GFP-P1∆P2-5

: Met → Ile

49

図

図 22--55.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの ウ ウイイルルスス RRNNAA 合合成成ににおおけけるる機機能能性性 空ベクター、pCAGGS-P1 もしくは pCAGGS-P1∆P2-5 を、ルシフ ェラーゼ発現ミニゲノムプラスミド、N 蛋白質発現プラスミドおよ び L 蛋白質発現プラスミドと共に、NA 細胞に導入した。導入２日 後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。pCAGGS-P1 および pCAGGS-P1∆P2-5 より発現する蛋白質を、各々P1 および P1∆P2-5 と表記している。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。 ns: p≧0.05 






空 空ベベククタターー PP11 PP11∆PP22--55 1 2 3 4 5 ルシフェラーゼ活性 （RLU [ x10 4 ] / sec ） 0 6 nnss

50 図 図 22--66.. ppEEGGFFPP--PP11 おおよよびび ppEEGGFFPP--PP11∆∆PP22--55 をを導導入入ししたた N NAA 細細胞胞ににおおけけるる GGFFPP--PP11 おおよよびび GGFFPP--PP11∆∆PP22--55 のの発発現現 pEGFP-P1 および pEGFP-P1∆P2-5 を導入した NA 細胞を、P1～P5 を発現 させるため各々pCAGGS-P1～-P5 を導入した NA 細胞と共に、ウエスタンブ ロットにより解析した。

58

46

30

46

空空

ベベ

クク

タタ

ーー

ppEE

GGFF

PP--

cc11

PP33

PP11 PP22

PP44 PP55

ppEE

GGFF

PP--

PP11

ppEE

GGFF

PP--

PP11

∆PP

22--55

P2

P1

P3

P4

P5

GFP-P1

GFP-P1∆P2-5

チューブリン

51

図

図 22--77.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの IIFFNN 産産生生抑抑制制活活性性 の の比比較較 空ベクター、pEGFP-P1 もしくは pEGFP-P1∆P2-5 と共に、レポータープラス ミドの IFNB-pGL3 および導入効率補正用の pRL-Tk を SYM-I 細胞に導入した。 導入 24 時間後に、さらに Poly (I･C)を各々の細胞に導入した。24 時間培養した 後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウエスタンブロットにより、 細胞溶解液中のチューブリンおよび GFP 融合型 P1 を検出した結果をグラフ下部 に示している。エラーバーは標準誤差を示す。＊: p<0.05、ns: p≧0.05 0 1 2 3 4 5 GFP-P1 GFP-P1∆P2-5

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G GFFPP--PP11 GGFFPP--PP11 ∆PP22--55 Poly (I･C) ns

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IFN -β プロモーター活性 (GL/RL) 空 空ベベククタターー チューブリン

52

図

図 22--88.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの IIFFNN 応応答答抑抑制制活活性性 の の比比較較 空ベクター、pEGFP-P1 もしくは pEGFP-P1∆P2-5 と共に、レポータープラス ミドの pISRE-luc および導入効率補正用の pRL-Tk を NA 細胞に導入した。導入 24 時間後に、各々の細胞に IFN-α を投与した。6 時間培養した後に、細胞を回 収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウエスタンブロットにより、細胞溶解液 中のチューブリンおよび GFP 融合型 P1 を検出した結果をグラフ下部に示してい る。エラーバーは標準誤差を示す。＊: p<0.01、ns: p≧0.05

�

�

�

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 ISRE 活性 (GL/RL) ns

��

��

IFN-α 空 空ベベククタターー GGFFPP--PP11

��

��

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G GFFPP--PP11 ∆PP22--55 GFP-P1 GFP-P1∆P2-5 チューブリン

53

ɛ

3 ə

54

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Ŭˊ

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55

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Luucc ȸȸȥȥCCEE((NNiiPP))EE99CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 ǙǙ66ÂÂææ

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56

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C

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62 ɛ̹ə50CE(NiP)ǙE9CE(NiP)∆P2-5Ǚ6P1đɜ6IFNO’i` sepȀƃLLj%H 2ɇ˃"I* 2B 6ČʊƃLƯƝ#0H² ˜EGCE(NiP)∆P2-5Ǚ6Ɋɮȴăƃ57P16IFNO’i`sepȀƃ̋ ›#0H2ʀFI* I>16ĴĘ5EGʎÞ5HȡȟȴRQŽe6ķǬøȤRQŽ e 6 Ɋ ɮ ȴ ă ƃ 2 ǩ 6 ̋ Ê 5  H 2  ɉ " I 0  H ̶40̷ŷ-0 CE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)Ǚđɐŭ6ɊɮȴăƃLLj%H 27ʎÞ 5HǙ6ķǬøȤđɜ1HČʊƃLɉ#0Hnjə17…Re ʎÞ5HǙ6ķǬøȤLǰ˝%H*ACE(NiP)∆P2-5-LucǙE9 CE(NiP)-Luc Ǚ Ɖ Ǘ … R e ʎ 5   H Ž c | S Œ • g Ȁ ƃ  4 F 9 5 CE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)ǙƉǗ…Reʎ5HƉǗƃRQŽéL ǟʹ#*(6ɯǔďʼn̮50 IF6Ǚ6ʎÞ5HRQŽeʯ ʮʊE9ƉǗƃRQŽeȩȨʊđɜ1H 2ɇ˃"I*̶ħ3-3E9 -4̷²˜EG…ReʎÞ5HRQŽeķǬ50tPs6˿ʱƃ¿ 2ɉ"I* 6Ǝɹ7CE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)Ǚ6Ɋɮȴăƃ đɜ1H 2Lʫ°HB61H

ɛ 3 ə17CE(NiP)∆P2-5 ǙE9 CE(NiP)Ǚ6ɊɮȴăƃE9…Re ʎÞ5HķǬøȤ7đɜ1H 2Lɉ% 21* IF6ƎɹE GȡȟȴRQŽe6Ɋɮȴăƃ4F95ʎÞ16ķǬ50tPs ˿ʱ 4ŵóLǔ*#04 2ƾF24-*

63

表

表 33--11.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株をを脳脳内内接接種種さされれたたママウウススのの発発症症率率 お およよびび致致死死率率 1×104 _{FFU 1×10}3 _FFU 株 発症率 （発症/接種個体数） 致死率 （死亡/接種個体数） 発症率 （発症/接種個体数） 致死率 （死亡/接種個体数） CE(NiP) 100% （20/20） 100% （20/20） 85% （17/20） 85% （17/20） CE(NiP)∆P2-5 100% （20/20） 100% （20/20） 95%ns （19/20） 95%ns （19/20） ns_{: CE(NiP)株接種群と比較して、有意差なし（p≧0.05）}

64 （A）

（B）

図

図 33--11.. ((AA))ゲゲノノムムププララススミミドド ppCCEE((NNiiPP))--LLuucc のの模模式式図図 ((BB))CCEE((NNiiPP))--LLuucc 株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55--LLuucc 株株のの

ゲ ゲノノムム構構成成模模式式図図 白丸（○）は P 遺伝子上に導入された変異[プラスミド: ATG→ATA、ゲノム: AUG→AUA（+鎖として表示）]を示す。 CE(NiP)-Luc 株名 ゲノム構成模式図 CE(NiP)∆P2-5-Luc ��� �� N N PP MM GG LLuucc LL N N PP MM GG LLuucc LL G G LLuucc LL : G遺伝子転写終結シグナル : N遺伝子転写開始シグナル pCE(NiP)-Luc pCE(NiP)∆P2-5-Luc : L 遺伝子転写開始シグナル Pst I Bsp1407 I PCR増幅配列

65

図

図 33--22.. 11××110044 _{FFFFUU ((AA)) ももししくくはは 11××1100}33 _{FFFFUU ((BB)) のの CCEE((NNiiPP))株株}

お

およよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株がが脳脳内内接接種種さされれたたママウウススのの症症状状推推移移

1×104 _{FFU（A）もしくは 1×10}3 _{FFU（B）の CE(NiP)株または CE(NiP)∆P2-5 株を、}

20 匹/群の 4 週齢マウス（ddY 系統、雄）に脳内接種した。接種後 14 日間における 各株感染マウスの症状を観察した。感染マウスの症状を正常、体重減少、軽度の神経症 状、重度の神経症状および死亡の 5 つに分類した。
0 5 10 15 20 0 7 14 0 5 10 15 20 0 7 14 0 5 10 15 20 0 7 14 C CEE((NNiiPP))∆PP22--55 個体数 接種後日数 ：正常 ：重度の神経症状 ：体重減少 ：軽度の神経症状 ：死亡 (A) 1×104 _FFU C CEE((NNiiPP)) (B) 1×103 _FFU 0 5 10 15 20 0 7 14

66

図

図 33--33.. 感感染染ママウウスス脳脳内内ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55--LLuucc 株株おおよよびび C

CEE((NNiiPP))--LLuucc 株株ののウウイイルルスス複複製製効効率率のの比比較較

1×104 _{FFU の CE(NiP)∆P2-5-Luc 株および CE(NiP)-Luc 株を、3 匹/群の 4}

週齢マウス（ddY 系統、雄）に脳内接種した。接種 1、３および 5 日後に各感 染脳を採取し、ルシフェラーゼ活性を計測した。 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09

1 dpi

3 dpi

5 dpi

mock CE(NiP)-Luc CE(NiP)∆P2-5-Luc

3

4

5

6

7

8

9

ルシフェラーゼ活性

(log 10 RLU/sec/g)

1

3

5

接種後日数

非感染

67

図

図 33--44.. 感感染染ママウウスス脳脳内内ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株おおよよびび C

CEE((NNiiPP))株株のの感感染染性性ウウイイルルスス産産生生能能のの比比較較

1×104 _{FFU の CE(NiP)∆P2-5 株および CE(NiP)株を、5 匹/群の 4 週齢マウ}

ス（ddY 系統、雄）に脳内接種した。接種 5 日後に各感染脳を採取し、フォ ーカスアッセイにより脳内の感染性ウイルス量を計測した。ns: p≧0.05 




mock CE(NiP)

4

6

8

(log

10

FFU/g)

ウイルス感染価

2

ns

非

非感

感染

染 C

CEE((N

NiiPP)) C

CEE((N

NiiPP))

68

ɛ

4 ə

69

Ŭ

Ŭˊ

ˊ

ȡȟȴRQŽe6ȴăƃ50ɊɮÈÚƃ7NjǜɭɺFžǖɊɮɦ :2ƉǗLƜĽ%HRQŽe6ʊô2ňɾ"IH I>1RQŽe6Ɋɮ ÈÚƃLʾÇ%H*A5…Re:6ɝʂÞƤɑ–ʗȻ5ȪFI0* ²ð6ĴĘ50ůǯ6Ni-CEǙɝʂÞƤɑ5E-0…ReLȸȵ"'4 65Œ#Ni-CEǙ6^v‡5Űǯ6ʰ“ăǙȬǑP˷ºŃLÌLj%H CE(NiP)Ǚ7ʔǪȻ4ƉǗLŮ˕ % 2ɇ˃"I0H̶45̷ŷ-0 ɊɮÈÚƃ50PʢȺ˔˿ʱ4ŵóLƝ. 2ɉ"I*"F5Pʢ Ⱥ˔7ɝʂɫʉ5HȡȟȴRQŽe6ķǬLË˯#RQŽe6NjǜɊ ɮ:6ƉǗøȤḺAH 2ɉġ"I0H̶45̷##4Fȡȟȴ RQŽe6ɊɮÈÚƃ4F95ɝʂɫʉ16ķǬ50tPs˿ʱ4ŵóL Ɲ.637šƾ6>>1H ( 1ɛ4 ə17ȡȟȴRQŽe6ɊɮÈÚƃ5H tPs 6ŵóLǟʽ %HȾȻ1…Re:6ɝʂÞƤɑ5EGCE(NiP)∆P2-5 ǙE9 CE(NiP) Ǚ6ɊɮÈÚƃ4F95Ǚ6ÀÞçŢLǰ˝#*"F5ɝʂɫʉ16R QŽeķǬ5H tPs 6˿ʱƃLǟʽ%H*A…Re6ɝʂÞ4F95IJ ̬ɝʂɫʉ5H CE(NiP)∆P2-5 ǙE9 CE(NiP)Ǚ6ķǬøȤLǰ˝#*

70

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Q’Y‹€•i•̶zŒa‘̷Þ1IJ̬#*̶37 ʻň CO2ȕŭ̾5%̷G-8 ɫʉȪGM 2#010%FCS E9 10%R…ʥȉ̶HS̷̶InvitrogenʮĝȰ č: 26050-088̷ȈöjŽ€l_ưĺQ•\ŽIJĭ̶D-MEM̷̶Invitrogenʮ ĝȰč: 11995-065̷LȪ*G-8 ɫʉ6çû˄Ŕ7ATCC 6ʺ˞5ŷ-0 ʦ-*ÝÀȻ57đɫʉ6 GM Lçû˄ŔȪIJĭ1H 2%FCS E9 2%HS Ȉö D-MEM 2ªƨ%H 21çûL˄Ŕ#*CE(NiP)ǙE9 CE(NiP)∆P2-5 Ǚ 7 ɛ 1 ə 5 ʺ ˥ # * B 6 L  CE(NiP)-Luc Ǚ  E 9 CE(NiP)∆P2-5-Luc Ǚ5.07ɛ 3 ə5ʺ˥#*B6LÃȪ#*ďǙ6e pl[RQŽe6Âʮǻ5.07ɛ1 ə5ʺ˞#*ƹǻLȪ* ~ ~ŒŒee††qq

CE(NiP)ǙE9 CE(NiP)∆P2-5 Ǚ6 P1 Lȸȥ%H~Œe†q2#0( I)I pCAGGS-P1 E9 pCAGGS-P1∆P2-5 LÃȪ#*>*†s^v‡ ~Œe†q2#0ɛ 2 ə50Âʮ#* pCAGGS-RVDI-Luc LÃȪ#* N ʢȺ˔E9 L ʢȺ˔ȸȥ~Œe†q7ɛ 2 ə2đǢ5ďpCAGGS-CEN E9pCAGGS-CEL LÃȪ#*

71 † †ss^^vv‡‡OOllffQQ ɭɺIJ̬~•p̶Greiner bio-one24 RSŽʮĝȰč: 662160̷6˜1 IJ ̬ ” ç û # * G-8 ɫʉ51 RSŽ*G 0.2 µg 6 pCAGGS-P1 pCAGGS-P1∆P2-5>*7pCAGGS/MCS2Ü50.8 µg6pCAGGS-RVDI-Luc 0.4 µg6pCAGGS-CELE90.4 µg6pCAGGS-CENLŔÚ#* 62 ~Œe†qŔÚʿʟ2#0TransIT-LT1̶TaKaRaʮĝȰč: MIR2304̷L ÃȪ#*37 / 2 Ƽ̊6ǐµ1ďɫʉLIJ̬#*Ŷɛ 2 ə5ʺ˞#*ƹǻ 5E-0ɫʉÞ6Žc|SŒ•gȀƃLȍň#*Žc|SŒ•gȀƃ7 RLU/sec 2#0ʩʺ#*4˜ʺ6~Œe†qŔÚɫʉ5.071 ǐ µ*G̺RSŽLȪƈ#ď6Žc|SŒ•gȀƃÐ6ŨĮÐE9ǣȏ ˆšLɟæ#*ɰʸåȦ57çƲçǓE9Dunnett 6ļ˿ǟňLȪ* C

CEE((NNiiPP))ǙǙEE99CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 ǙǙ66ɊɊɮɮÈÈÚÚƃƃ66ǟǟʹʹ

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Ǚ>*7CE(NiP)∆P2-5 ǙLĕ@RQŽeȅ 0.1 ml LɝʂÞƤɑ#*̓ƃŒ Ț2#0RQŽeţ˾ȅ̶5%FCS Ȉö E-MEM̷6?LƤɑ#*̠ƉǗ…R eLȪ*ƉǗ…ReE9̠ƉǗ…Re6ȵȠ6ƥɏL 24 Ƽ̊ʵő#* …Re6ȵȠ6ëň4F95ȸȵȤE9ʔǪȤ6ɟæ7ɛ 3 ə5ʺ˞# *ƹǻLȪ*ȸȵȤE9ʔǪȤ6Ljƈšǟň57|PlcŠ•6ǩɇ ɇȤǟňLȪ*4njùȝʼn̮7£AŚ̍ĽŅùȝʼn̮łĞ¹5E -0ƒ˃"I*̶ʼn̮ƒ˃Ȱč̾13069̷