GFP P1 GFP P1∆P2-5 pEGFP-P1 pEGFP-P1∆P2-5

pEGFP-C1

ベクター

GFP-P1 GFP-P1∆P2-5

: Met → Ile

49 図

図 22--55.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの ウ

ウイイルルスス RRNNAA 合合成成ににおおけけるる機機能能性性

空ベクター、pCAGGS-P1 もしくは pCAGGS-P1∆P2-5 を、ルシフ ェラーゼ発現ミニゲノムプラスミド、N 蛋白質発現プラスミドおよ び L 蛋白質発現プラスミドと共に、NA 細胞に導入した。導入２日 後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。pCAGGS-P1 および pCAGGS-P1∆P2-5 より発現する蛋白質を、各々P1 および P1∆P2-5 と表記している。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。

ns: p≧0.05

空

空ベベククタターー PP11 PP11∆PP22--55 1

2 3 4 5

ルシフェラーゼ活性 （

^{RLU [ x10}

4 ] / sec）

0

6 ^nnss

50 図

図 22--66.. ppEEGGFFPP--PP11 おおよよびび ppEEGGFFPP--PP11∆∆PP22--55 をを導導入入ししたた N

NAA 細細胞胞ににおおけけるる GGFFPP--PP11 おおよよびび GGFFPP--PP11∆∆PP22--55 のの発発現現

pEGFP-P1 および pEGFP-P1∆P2-5 を導入した NA 細胞を、P1～P5 を発現 させるため各々pCAGGS-P1～-P5 を導入した NA 細胞と共に、ウエスタンブ ロットにより解析した。

58 46

30 46

空空 ベベ クク タタ ーー

ppEEGGFFPP--cc11 PP33

PP11 PP22 PP44 PP55 ppEEGGFFPP--PP11

ppEEGGFFPP--PP11∆PP22--55

P2 P1 P3 P4 P5

GFP-P1

GFP-P1∆P2-5

チューブリン

51 図

図 22--77.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの IIFFNN 産産生生抑抑制制活活性性 の

の比比較較

空ベクター、pEGFP-P1 もしくは pEGFP-P1∆P2-5 と共に、レポータープラス ミドの IFNB-pGL3 および導入効率補正用の pRL-Tk を SYM-I 細胞に導入した。

導入 24 時間後に、さらに Poly (I･C)を各々の細胞に導入した。24 時間培養した 後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウエスタンブロットにより、

細胞溶解液中のチューブリンおよび GFP 融合型 P1 を検出した結果をグラフ下部 に示している。エラーバーは標準誤差を示す。＊: p<0.05、ns: p≧0.05

0 1 2 3 4 5

GFP-P1

GFP-P1∆P2-5

�� � �� � �� �

G

GFFPP--PP11 GGFFPP--PP11

∆PP22--55

Poly (I･C) ns

�� ��

IFN-β プロモーター活性 (GL/RL)

空

空ベベククタターー

チューブリン

52 図

図 22--88.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株のの PP11 のの IIFFNN 応応答答抑抑制制活活性性 の

の比比較較

空ベクター、pEGFP-P1 もしくは pEGFP-P1∆P2-5 と共に、レポータープラス ミドの pISRE-luc および導入効率補正用の pRL-Tk を NA 細胞に導入した。導入 24 時間後に、各々の細胞に IFN-α を投与した。6 時間培養した後に、細胞を回 収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウエスタンブロットにより、細胞溶解液 中のチューブリンおよび GFP 融合型 P1 を検出した結果をグラフ下部に示してい る。エラーバーは標準誤差を示す。＊: p<0.01、ns: p≧0.05

� � �

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ISRE 活性 (GL/RL) ns

��

��

IFN-α 空

空ベベククタターー GGFFPP--PP11

�� �� ��

G

GFFPP--PP11

∆PP22--55

GFP-P1

GFP-P1∆P2-5 チューブリン

53

ɛ 3 ə

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54 Ŭ Ŭˊˊ

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55 ǎ

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56

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C

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57

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58

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60

CE(NiP)∆P2-5-LucǙE9CE(NiP)-LucǙ6ƉǗʎ5HŽc|SŒ•g Ȁƃ7ƿ̊ɮ˱2Ü5˜ƽ#Ƥɑ 5 ƼŶ5Hʁ6Žc|SŒ•gȀƃ 7(I)I4.810⁷ E92.4710⁸ RLU/sec/gLɉ#*Ƥɑ3E95Ƽ Ŷ 5 0 CE(NiP)∆P2-5-Luc Ǚ Ɖ Ǘ ʎ 6 Ž c | S Œ • g Ȁ ƃ 7

CE(NiP)-Luc ǙƉǗʎ5HđȀƃEGB¿-*B66ʁ6̊5Ljƈ

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…

…RReeʎʎÞÞ55HH CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55ǙǙEE99CCEE((NNiiPP))ǙǙ66ƉƉǗǗƃƃRRQQŽŽeeȩȩȨȨ ʊ

ʊ66ǰǰ˝˝

…ReʎÞ5HCE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)Ǚ6RQŽeȩȨʊL ǰ˝%HȾȻ1ďǙLʎÞƤɑ#*…Re6ʎ5HƉǗƃRQŽéL ȍň#*̶ħ3-4̷(6ɯǔCE(NiP)∆P2-5ǙƉǗʎ5HRQŽeƉǗ Ç 1.5×10⁶ FFU/g +-*65Œ#CE(NiP)ǙƉǗʎ5HRQŽeƉǗ

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61 ʀ ʀőő

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ɯǔEGCE(NiP)∆P2-5ǙCE(NiP)Ǚ2đɜ6̱ɊɮȴăƃLLj%H 2

ʀFI*B663,F6Ƥɑɽ50BʔǪȤ100%1-* 2 FǙ6Õ4ȴăƃ6šLʵő14-*ČʊƃBʀFI*( 1 ÛÍÀǪ¨#4RQŽé6ǐµ1ďǙ6ȴăƃLßǟʹ%H 2LȾȻ 5đǢ6Ƥɑʿ̮L1×10³ FFU6RQŽé5E-0ʦ-*(6ɯǔ

CE(NiP)ǙƤɑɽ6ȸȵȤE9ʔǪȤ&IB85%1-*65Œ#

CE(NiP)∆P2-5ǙƤɑɽ1795%24GƤɑɽ6ȸȵȤE9Ǫ¨Ȥ6̊5

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6ɯǔEGCE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)Ǚ6Ɋɮȴăƃ7đɜ1H 2 ɇ˃"I*ŷ-0Ɋɮȴăƃ50tPs174P1Ÿʱ4ŵóLƙ -0H2ʀFI* I>15Ɋɮȴăƃ5˿ʱ4PʢȺ˔OQh|U•‡

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²ð6Ʌɔ5EGPʢȺ˔6IFNO’i`sepȀƃCE(NiP)Ǚ6Ɋɮȴ ăƃ5̋›#0H 2Űɉġ"I0H̶16̷njə17PʢȺ˔2#

0P16?Lȸȥ%HCE(NiP)∆P2-5ǙCE(NiP)Ǚ2đɜ6ɊɮȴăƃLɉ%

2ɇ˃"I*̶ʩ3-1E9ħ3-2̷ IF6Ʉʲ5EGP16IFNO’

i`sepȀƃɊɮȴăƃ6ȸȥ50ÿç1HČʊƃʀFI*

62

ɛ̹ə50CE(NiP)ǙE9CE(NiP)∆P2-5Ǚ6P1đɜ6IFNO’i`

sepȀƃLLj%H 2ɇ˃"I* 2B 6ČʊƃLƯƝ#0H²

˜EGCE(NiP)∆P2-5Ǚ6Ɋɮȴăƃ57P16IFNO’i`sepȀƃ̋

›#0H2ʀFI*

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e 6 Ɋ ɮ ȴ ă ƃ 2 ǩ 6 ̋ Ê 5 H 2 ɉ " I 0 H ̶40̷ ŷ - 0

CE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)Ǚđɐŭ6ɊɮȴăƃLLj%H 27ʎÞ

5HǙ6ķǬøȤđɜ1HČʊƃLɉ#0Hnjə17…Re ʎÞ5HǙ6ķǬøȤLǰ˝%H*ACE(NiP)∆P2-5-LucǙE9 CE(NiP)-LucǙ Ɖ Ǘ … R e ʎ 5 H Ž c | S Œ • g Ȁ ƃ 4 F 9 5

CE(NiP)∆P2-5ǙE9CE(NiP)ǙƉǗ…Reʎ5HƉǗƃRQŽéL

ǟʹ#*(6ɯǔďʼn̮50 IF6Ǚ6ʎÞ5HRQŽeʯ ʮʊE9ƉǗƃRQŽeȩȨʊđɜ1H 2ɇ˃"I*̶ħ3-3E9 -4̷²˜EG…ReʎÞ5HRQŽeķǬ50tPs6˿ʱƃ¿

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ɛ 3ə17CE(NiP)∆P2-5 ǙE9CE(NiP)Ǚ6ɊɮȴăƃE9…Re ʎÞ5HķǬøȤ7đɜ1H 2Lɉ% 21* IF6ƎɹE GȡȟȴRQŽe6Ɋɮȴăƃ4F95ʎÞ16ķǬ50tPs˿ʱ 4ŵóLǔ*#04 2ƾF24-*

63

表

表 33--11.. CCEE((NNiiPP))株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株をを脳脳内内接接種種さされれたたママウウススのの発発症症率率 お

およよびび致致死死率率

1×10⁴ FFU 1×10³ FFU

株 発症率

（発症/接種個体数）

致死率

（死亡/接種個体数）

発症率

（発症/接種個体数）

致死率

（死亡/接種個体数）

CE(NiP) 100%

（20/20）

100%

（20/20）

85%

（17/20）

85%

（17/20）

CE(NiP)∆P2-5 100%

（20/20）

100%

（20/20）

95%^ns

（19/20）

95%^ns

（19/20）

ns: CE(NiP)株接種群と比較して、有意差なし（p≧0.05）

64

（A）

（B）

図

図 33--11.. ((AA))ゲゲノノムムププララススミミドド ppCCEE((NNiiPP))--LLuucc のの模模式式図図 ((BB))CCEE((NNiiPP))--LLuucc 株株おおよよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55--LLuucc 株株のの

ゲ

ゲノノムム構構成成模模式式図図

白丸（○）は P 遺伝子上に導入された変異[プラスミド: ATG→ATA、ゲノム:

AUG→AUA（+鎖として表示）]を示す。

CE(NiP)-Luc

株名 ゲノム構成模式図

CE(NiP)∆P2-5-Luc

��� ��

N

N PP MM GG LLuucc LL N

N PP MM GG LLuucc LL

G

G LLuucc LL

: G遺伝子転写終結シグナル : N遺伝子転写開始シグナル pCE(NiP)-Luc

pCE(NiP)∆P2-5-Luc

: L 遺伝子転写開始シグナル

Pst I Bsp1407 I

PCR増幅配列

65 図

図 33--22.. 11××1100⁴⁴ FFFFUU ((AA)) ももししくくはは 11××1100³³ FFFFUU ((BB)) のの CCEE((NNiiPP))株株 お

およよびび CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株がが脳脳内内接接種種さされれたたママウウススのの症症状状推推移移

1×10⁴ FFU（A）もしくは 1×10³ FFU（B）の CE(NiP)株または CE(NiP)∆P2-5 株を、

20 匹/群の 4 週齢マウス（ddY 系統、雄）に脳内接種した。接種後 14 日間における 各株感染マウスの症状を観察した。感染マウスの症状を正常、体重減少、軽度の神経症 状、重度の神経症状および死亡の 5 つに分類した。

0 5 10 15 20

0 7 14

0 5 10 15 20

0 7 14

0 5 10 15 20

0 7 14

C

CEE((NNiiPP))∆PP22--55

個体数

接種後日数

：正常

：重度の神経症状

：体重減少 ：軽度の神経症状

：死亡 (A)

1×10⁴ FFU

C

CEE((NNiiPP))

(B)

1×10³ FFU

0 5 10 15 20

0 7 14

66 図

図 33--33.. 感感染染ママウウスス脳脳内内ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55--LLuucc 株株おおよよびび C

CEE((NNiiPP))--LLuucc 株株ののウウイイルルスス複複製製効効率率のの比比較較

1×10⁴ FFU の CE(NiP)∆P2-5-Luc 株および CE(NiP)-Luc 株を、3 匹/群の 4 週齢マウス（ddY 系統、雄）に脳内接種した。接種 1、３および 5 日後に各感 染脳を採取し、ルシフェラーゼ活性を計測した。

1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09

1 dpi 3 dpi 5 dpi

mock

CE(NiP)-Luc

CE(NiP)∆P2-5-Luc

3 4 5 6 7 8 9

ルシフェラーゼ活性

(log10 RLU/sec/g)

1 3 5

接種後日数

非感染

67 図

図 33--44.. 感感染染ママウウスス脳脳内内ににおおけけるる CCEE((NNiiPP))∆∆PP22--55 株株おおよよびび C

CEE((NNiiPP))株株のの感感染染性性ウウイイルルスス産産生生能能のの比比較較

1×10⁴ FFU の CE(NiP)∆P2-5 株および CE(NiP)株を、5 匹/群の 4 週齢マウ ス（ddY 系統、雄）に脳内接種した。接種 5 日後に各感染脳を採取し、フォ ーカスアッセイにより脳内の感染性ウイルス量を計測した。ns: p≧0.05

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ドキュメント内 狂犬病ウイルスP蛋白質アイソフォームが関与する病原性発現機構の解明 (ページ 57-96)