5．4考察
このM32L変異体の熱安定性の予測値は、1993年に公表された【41】。その
後、1996年に、SpencerとStitesによってM32L変異体の熱安定性が実験
的に決定されたので【55】、その結果と比較する。M32L変異体の熱安定性の実 験値は、MG。32L＝一〇．8 kca1／moユとなり不安定化していた。また同時に、
M32エ変異体についても、その熱安定性が測定されたが、△△G。32、＝一〇．6 kca1／moユとなり不安定化していた。この予測値と実験値の不一致の原因とし て、彼らは、摂動時間が不十分である可能性とAMBER力場におけるS一π相互 作用の欠如を上げている。
摂動時間については、計算誤差が、天然状態、変性状態共に、0．6kca1／moエ と十分に小さいので、たとえ、より長い摂動時間をかけても、結果は変わらな いと我々は考えている。しかしながら、より長い摂動時間をかけることにより、
もう少し改善することは、可能であるかも知れない【39】。
次に、s一π相互作用についてであるが、これはタンパク質のx線結晶解析の 統計的な解析で発見され【59，601、㎜解析でもその存在が確認されている相 互作用である【61−63】。量子力学計算結果とAMBER 1991年力場を比較した 研究において、今回の研究に用いたAMBER 1991年力場ではS一π相互作用を 十分には再現できないことが示されている［64】。したがって、今回の予測値と 実験値の不一致の原因は、AMBER 1991年力場において、 S。π相互作用が考慮
M32L及びM32工変異体が不安定化している原因は、 Met32が他のアミノ酸 に置換され、Try27、 Phe34及びPhe76の三つの芳香環とのS一π相互作用が 失われたためと考えられる。このことは、32残基目がメチオニンであること が、staphylococcal nucleaseの熱安定性にとって重要であることを示唆
している。
58
5．5結論
分子動力学／自由エネルギー摂動法でstaphylococcal nucleaseのM32し の熱安定性を予測したが、その結果は、実験値と一致しなかった。
その原因は、AbCBERの1991年力場において、 S一π相互作用が考慮されてい
ないためであると推測される。
M32L及びM32エ変異体が不安定化している原因は、 Met32が他のアミノ酸 に置換され、Try27、 Phe34及びPhe76の三つの芳香環とのS一π相互作用が 失われたためと考えられる。したがって、32残基目がメチオニンであること が、s七aphylococcal nucieaseの熱安定性にとって重要であると考えられ
る。
6まとめ
本研究で明らかにしたことを、以下にまとめる。
（1）水素結合の導入によって、天然状態の自由エネルギーを減少させることが できるが、水素結合基の水和の自由エネルギー差のため、変性状態の自由工 ネルギーをより大きく減少させてしまう。そのため、水素結合の導入は、タ ンパク質を効果的に安定化できない。
（2）疎水基の導入は、本質的に変性状態の自由エネルギーを不利にするため、
天然状態での立体障害が無ければ、タンパク質の安定化に働く。
（3》Thr27、 Phe34及びPhe76からなる疎水コアが、 staphylococcal
nucleaseの熱安定性にとって重要である。また、 Met32は、 S…π相互作用 によってThr27、 Phe34及びPhe76からなる疎水コアを水から保護してい
る。
（41分野動力学／自由エネルギー摂動法は、Flory・一Huggins理論［29，301 に基づくSharpらアミノ酸間の水和の自由エネルギー差【31］を再現する。
60
﹂言う
（5》分子動力学／自由エネルギー摂動法は、タンパク質変異体の熱安定性を再 現できる。このことは、タンパク質変異体の熱安定性の予測も可能であるこ とを意味している。しかしながら、s・・一rt相互作用を伴うものについては、注
意を要する。
（6）Met→Alaの様な大きな摂動を伴うアミノ酸置換に対して、我々が考案し た適切な中間体を経由する多段階摂動法は極めて有効である。
最後に、分子動力学／自由エネルギー摂動法は、タンパク質工学の分野にお いて、タンパク質変異体の熱安定性を解析もしくは予測するのに有用な道具で
ある。
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蟹三 一
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staphyiococcal nuclease rnutants： component analysis of the free energy difference of dena七uraセion
（Staphylococcal nuclease変異体の安定性についての分子動力学研 究：変性の自由エネルギー差の成分解析）、
著者名Yamaotsu N．、 Moriguchi 1．、 Kollman P・A・・Hirono S・・
雑誌Biochim． Biophys． Acta 1163巻81頁〜88頁に公表（1993
年）
2．論文題名Estimation of stabilities of staphylococcal
nuclease mutan七s （Meヒ32→Ala and Met32→：Leu》using molecular dynamics／free energy perturbation
（分子動力学／自由エネルギー・…摂動法を用いたstaphylococcal nuclease変異体（Meゼ2→Ala及びMet32→Leu》の安定性の評価）、
著者名Yamao七su N．、 Moriguchi 1．、 Hirono S．、
雑誌Biochim． Biophys． Acta 1203巻243頁〜250頁に公表（1993
年）
66
窪レ