TIRFMTEM

32

Figure 2-5 脂質膜上でのへリックス形成性の比較. (A) CD spectra of apoA-I 1‒83/G26R in solution (a), in the presence of PC (b), PS 30 % (c), Chol 33 % (d) SUVs. Protein and PL concentrations were 0.05 and 1.5 mg/ml, respectively. (B) Comparison of α-helix contents of apoA-I 1‒83/G26R in solution or bound to SUV with the weight ratios of PL to apoA-I of 10 and 30. **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p <

0.0001 versus“PC”.（参考論文48より転載）

2. 2 アポA-Iの脂質膜結合性の変化

各組成の SUV に結合したアポ A-I 1-83/G26R のヘリックス形成性を CD 測定により評価した

（Figure 2-5A）。Figure 2-5Bには各CDスペクトルから算出したヘリックス含量を示す。1. 3で述べ たように、アポA-I 1-83/G26Rは脂質膜に結合するとランダムコイル構造からヘリックス構造へと構 造変化する^13,60。この時のヘリックス形成性はSUVの脂質組成によって異なり、PSの存在はヘリッ クス形成性を増大させること、一方、コレステロールはヘリックス形成性を低下させる傾向がある ことが分かった。

この結果から、1章にて述べたIowa（G26R）変異の有無によるアポA-I 1-83フラグメントの脂質 膜上での線維形成性の違いと同様に、PSの存在はアポA-I 1-83/G26RのN末端側の線維形成領域の ヘリックス形成を増大させることにより脂質膜上での線維形成を阻害し、一方コレステロールの存 在は同部位のヘリックス形成性を低下させることにより線維形成を促進しているのではないかと考 えられる。

ApoA-I 1-83/G26R + SUV CD spectra

200 210 220 230 240 250 260 -15000

-10000 -5000 0 5000 10000

(a) in solution

(b) PC (c) PS 30%

(d) Chol 33%

Wavelength (nm)

Molar ellipticity (deg cm2 / dmol)

A B

helix content

0 10 20 30 40

50 in solution

PC

PS 15%

PS 30%

Chol 33%

x10 SUV PL x30 SUV PL

****

***

****

** ****

-helix content (%)

Figure 2-6 (A) グアニジン塩酸塩添加時のCDスペクトル変化、(B) 変性曲線の比較. (A) Changes in CD spectra of apoA-I 1‒83/G26R bound to PS 15 % SUV upon increasing concentrations of GdnHCl. (B) GdnHCl denaturation curves of apoA-I 1‒83/G26R bound to PC (○), PS 30 % (□), or Chol 33 % (▲) SUVs.

Protein and PL concentrations were 0.05 and 1.5 mg/ml, respectively.（参考論文48より転載）

さらに、形成されたヘリックス構造の安定性を調べるため、SUV結合時のアポA-Iに変性剤であ る塩酸グアニジンを様々な濃度で添加し、へリックス構造の安定性をCD測定により評価した。Figure 2-6Aに示す変性剤添加時のCDスペクトルから、222 nmの平均残基モル楕円率を用いて各グアニジ ン塩酸塩濃度における変性率を算出した。得られた変性曲線をFigure 2-6Bに、この変性曲線から得 られたパラメータをTable 2-1に示す⁷¹。各SUVを比較すると、PSおよびコレステロールの存在は、

変性中点を高濃度側にシフトさせるだけでなく、ギブズ自由エネルギーも増大させることが分かる。

これは、PSやコレステロールがアポA-I 1-83/G26Rの脂質膜上でのヘリックス構造の安定性を著し く増大させることを示す。PSによるヘリックス構造安定性の増大は、脂質膜上での線維形成の阻害 につながると考えられる。一方、脂質膜上での線維形成が促進されたコレステロールについてもヘ リックス構造の安定化が見られた。コレステロールの存在によるアポA-I 1-83/G26Rの線維形成促進 効果については、アポA-I 1-83/G26Rのヘリックス形成性・安定性への影響だけではなく、さらに別 の要因も考慮する必要があると考えられる。

Table 2-1 SUV結合アポA-I 1-83/G26Rの変性パラメータ（参考文献48より転載）

GD^〇

(kcal/mol) D1/2

(M)

m

(kcal/mol apoA-I/mol GdnHCl)

PC 2.4 ± 0.7 1.5 ± 0.1 1.6 ± 0.5

PS 15 % 2.9 ± 0.6 1.9 ± 0.2 1.9 ± 0.1

PS 30 % 4.4 ± 0.2 2.1 ± 0.1 2.1 ± 0.1

Chol 33 % 3.3 ± 0.4 2.0 ± 0.2 1.7 ± 0.3

210 220 230 240 250

-20000 -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000

GdnHCl 0M GdnHCl 4M

Wavelength (nm) Molar ellipticity (deg cm2 /dmol)

0 1 2 3 4

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

PC PS 30%

Chol 33%

GdnHCl (M)

Fraction unfolded

A B

34

PSおよびコレステロールがアポA-I 1-83/G26Rの脂質結合特性に与える影響について、さらに詳 細に評価を行うため、各SUVに対するアポA-I 1-83/G26Rの結合についてITC測定を行った。Figure 2-7A および Figure 2-7B には、それぞれ PS 30 % SUV および Chol 33 % SUV に対してアポ A-I

1-83/G26Rを滴定した際のサーモグラムを示す。このサーモグラムから結合等温線を得、フィッティ

ングを行うことにより、Table 2-2に示す熱力学的パラメータを得た。これらのパラメータを比較す ることにより、PSの存在は最大結合量（Bmax）の濃度依存的な増大および負の結合エンタルピー（H）

値の低下を引き起こすことが示された。1章にて述べたように、負のエンタルピー変化は、アポA-I のヘリックス疎水面を膜疎水部に埋め込むような相互作用様式におけるヘリックス形成を反映して いると考えられる。しかし、CD 測定により、PS の存在はヘリックス形成性の増大を示したことか ら（Figure 2-5）、Table 2-2に示されるPSによるの負のH値の低下は、CD測定結果と相反するもの となった。つまり、アポA-I 1-83/G26RとPS含有SUVとの相互作用は、ヘリックスの疎水面を膜疎 水部に埋め込むような相互作用ではなく、負電荷脂質であるPSとの静電的相互作用ではないかと考 えられる。一方、コレステロールの存在は、解離定数（Kd）を増大させ、結合親和性の低下を示し た。これによりコレステロール含有SUV上でアポA-Iが動き易くなり、線維化の核形成促進（Figure 2-2A）につながるのではないかと考えられる。

1-83/G26R (0.02 mM) + PS 30 % SUV (0.05 mM)

0 20 40 60 80 100

-0.08 -0.07 -0.06 -0.05 -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 0.00

Time (min)

Heat flow (cal/s)

1-83/G26R (0.02 mM) + EPC:chol=2:1 SUV (0.6 mM)

0 20 40 60 80 100

-0.12 -0.10 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0.00

Time (min)

Heat flow (cal/s)

A B

PS 30 % SUV Chol 33 % SUV

Figure 2-7 ITCサーモグラム. ITC for binding of apoA-I 1‒83/G26R to SUV. (A, B) Isothermal titration thermograms for binding of apoA-I 1‒83/G26R to PS 30 % (A) and Chol 33 % (B) SUVs.

（参考文献48より転載）

Kd (μg/ml)

Bmax

(amino acids/mol PL)

G^b

(kcal/mol) H

(kcal/mol) TS^c (kcal/mol)

PC 1.1 ± 0.5 0.14 ± 0.03 -11.9 ± 0.3 -20.3 ± 0.8 -8.4 ± 0.8

PS 15 % 1.0 ± 0.9 0.28 ± 0.07 -12.1 ± 0.6 -12.4 ± 0.1 -0.3 ± 0.6 PS 30 % 0.5 ± 0.4 0.53 ± 0.19 -11.6 ± 0.1 -11.6 ± 0.1 0.9 ± 0.5 Chol 33 % 3.8 ± 0.4 0.12 ± 0.02 -11.1 ± 0.1 -24.6 ± 0.1 -13.5 ± 0.1

Table 2-2に記載したKdおよびBmaxを用い、異なるPL/アポA-I濃度比において各SUVに結合した

アポA-Iの割合、および、SUV粒子上に結合したアポA-I分子数を算出し⁶²、それぞれFigure 2-8A

およびFigure 2-8Bに示した。PS 30 % SUVの場合、PL/アポA-I濃度比が低いとき（10（w/w））に

おいてもSUV表面がアポA-I 1-83/G26Rで飽和しており、その結合量はPC SUVもしくはChol 33 % SUVの場合と比較して3倍以上大きいことが分かる（Figure 2-8B）。また、PL/アポA-I濃度比が高 いとき（＞30（w/w））、結合量は各組成のSUV間で違いがないことが分かる（Figure 2-8B）。このこ とから、PS含有SUV上においてアポA-I 1-83/G26Rの線維形成が阻害されたことは、SUV表面に結 合したアポA-I濃度の低下のためではなく、CD測定の結果から、PSによりアポA-I 1-83/G26Rのヘ リックス形成性・安定性が増大したことが、脂質膜表面での線維形成阻害につながったと考えられ る。

a The data were from three independent experiments.

b Free energy was calculated according to G = -RT ln 55.5(1/Kd).

c The entropy of binding was calculated from G = H - TS

Table 2-2 アポ A-I 1-83/G26R の SUV 結合における熱力学的パラメータ. Thermodynamic parameters of binding of apoA-I 1‒83/G26R to SUVs at 25℃.^a（参考文献48より転載）

10 20 30 40 50 60

0 5 10 15 20

1 100 PC

Chol 33%

PS 30%

SUV PL/apoA-I (w/w) ApoA-I bound/surface PL (mmol/mol)

A

B

Figure 2-8 アポA-I 1-83/G26RのSUVへの結合性の比較. Changes in the fraction percent of apoA-I 1‒83/G26R bound to SUV (A) and molar ratio of bound apoA-I to surface PL on SUV (B) as a function of weight ratio of PL to apoA-I. ○, PC SUV; □, PS 30 % SUV; ▲, Chol 33 % SUV.

Fraction percent of apoA-I bound to SUV were calculated from Kd and Bmax values listed in Table 2-2.

Molar ratios of bound apoA-I to surface PL on SUV were calculated by assuming that surface PL on the outer layer of SUV available for binding of apoA-I is 67% of total PL.（参考論文48より転載）

10 20 30 40 50 60

0 20 40 60 80 100

1 100

PC

Chol 33%

PS 30%

SUV PL/apoA-I (w/w)

ApoA-I bound (%)

36

アポA-IとPSとの静電的相互作用の存在を検証するために、これまで線維形成を評価してきた生 理的塩濃度（150 mM NaCl）より、低いNaCl濃度（50 mM NaCl）でアポA-Iの線維形成性を評価し た（Figure 2-9）。その結果、50 mM NaClでは、150 mM NaCl の場合に比べてPSによる線維化阻害 効果の増大がみられた（Figure 2-9（▽））。50 mM NaCl中では150 mM NaCl中よりも静電的相互作用 の影響が大きくなる。そのため、50 mM NaClにおいてPSによる線維形成阻害効果の増大がみられ たという結果は、アポA-IとPSとの静電的相互作用を支持する結果となった。

2. 3 アポA-I線維化領域ペプチドを用いた線維形成性の評価

アポA-I 1-83/G26Rフラグメント中の2ヶ所の線維化領域のうち^24,31、N末端側（14-31残基領域）

および中央部（46-59残基領域）の線維化領域のそれぞれを含む、アポA-I 8-33/G26Rペプチドおよ

び44-65ペプチドを用い、脂質膜組成がアポA-Iの脂質結合性や線維形成性に与える局所的な影響の

評価を行った。Figure 2-10AおよびFigure 2-10Bに示す通り、ThT蛍光測定により各SUV上での線 維形成性を評価したところ、アポA-I 8-33/G26RペプチドはPC SUV上では強い線維形成性を示すが、

PSの存在により線維形成が抑制された（Figure 2-10A）。対照的に、アポA-I 44-65ペプチドはいずれ Figure 2-9 線維形成における塩濃度の影響. Effect of salt concentration on fibril-forming property of apoA-I 1-83/G26R bound to SUV. Formation of amyloid-like structure was monitored by ThT fluorescence for apoA-I 1‒83/G26R in the presence of SUV at NaCl concentration of 50 mM.

PL/apoA-I weight ratio was 10. ○, PC SUV; ▽, PS 30 % SUV. Protein concentration was 0.05 mg/ml.

The data at NaCl concentration of 150 mM (dotted line) are also shown for comparison.（参考文献48 より一部変更して転載）