H3C N CH3
S HN
O O
NH2
(CH2)n
H3C N CH3
S HN
O O H
N (CH2)n C
O H2 C
C H2
SH
DCC
ethyl acetate
3-mercaptopropionic acid (n = 2－6)
OH C O
C H
C H
SH
2 2
+
DansylCnSH (n = 2－6)
DansylC2SH
N-{2-[5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido]ethyl}-3-mercaptopropionami de (収率 77%). 1H NMR (CDCl3) δ: 1.51 (t, 1H), 2.29 (t, 2H), 2.66 (q, 2H), 2.89 (s, 6H), 3.06 (q, 2H), 3.32 (q, 2H), 5.80 (t, 1H), 6.20 (t, 1H), 7.19 (d, 1H, J = 7.32 Hz), 7.52 (t, 1H, J = 7.32 Hz), 7.57 (t, 1H, J = 7.93 Hz), 8.23 (d, 1H, J = 8.55 Hz), 8.28 (d,
43.09, 45.41, 115.37, 118.60, 123.25, 128.63, 129.50, 129.68, 129.98, 130.75, 134.35, 152.18, 171.67. HRFABMS: m/z 381.1213 [calcd. for C17H23N3O3S2 (M+) 381.1181].
Elemental analysis: calcd (%) for C17H23N3O3S2·0.25CHCl3: C 50.37, H 5.86, N 10.22;
found C 50.73, H 5.86, N 10.08.
DansylC3SH
N-{3-[5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido]propyl}-3-mercaptopropioam ide (収率 62%). 1H NMR (CDCl3): δ 1.33 (t, 1H), 1.49 (q, 2H), 2.29 (t, 2H), 2.59 (q, 2H), 2.81 (s, 6H), 2.85 (q, 2H), 3.19 (q, 2H), 5.89 (t, 1H), 6.00 (t, 1H), 7.11 (d, 1H, J = 7.94 Hz), 7.43 (t, 1H, J = 4.27 Hz), 7.49 (t, 1H, J = 4.27 Hz), 8.13 (d, 1 H, J = 6.10 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 8.55 Hz), 8.45 (d, 1H, J = 8.55 Hz). 13C NMR (CDCl3): δ 19.35, 28.56, 34.99, 39.00, 39.15, 44.41, 114.30, 117.93, 122.18, 127.39, 128.20, 128.54, 128.89, 134.09, 150.94, 170.66. HRFABMS: m/z 396.1463 [calcd. for C18H25N3O3S2
(M + H+) 396.1415]. Elemental analysis: calcd (%) for C18H25N3O3S2·0.5CHCl3: C 48.81, H 5.65, N 9.23; found C 48.42, H 5.92, N 9.11.
DansylC4SH
N-{4-[5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido]butyl}-3-mercaptopropionami de (収率 31%). 1H NMR (CDCl3): δ 1.47 (q, 2H), 1.56 (t, 1H), 2.42 (t, 2H), 2.77 (q, 2H), 2.90 (s, 6H), 2.91 (q, 2H), 3.16 (q, 2H), 5.12 (t, 1H), 5.68 (t, 1H), 7.19 (d, 1H, J = 7.93 Hz), 7.53 (t, 1H, J = 7.63 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 8.24 Hz), 8.24 (d, 1 H, J = 7.33 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 8.54 Hz), 8.55 (d, 1H, J = 8.55 Hz). 13C NMR (CDCl3): δ 20.45, 26.54, 26.81, 38.84, 40.36, 42.86, 45.43, 115.25, 118.71, 122.23, 128.46, 129.65, 129.95, 130.51, 134.66, 152.11, 170.84. HRFABMS: m/z 410.1616 [calcd. for C19H27N3O3S2
(M + H+) 410.1572]. Elemental analysis: calcd (%) for C19H27N3O3S2: C 55.72, H
6.65, N 10.26; found: C 55.49, H 6.68, N 10.02.
DansylC5SH
N-{5-[5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido]pentyl}-3-mercaptopropiona mide (収率 46%). 1H NMR (CDCl3): δ 1.25 (q, 2H), 1.34 (q, 2H), 1.42 (q, 2H), 1.58 (t, 1H), 2.44 (t, 2H), 2.78 (q, 2H), 2.89 (s, 6H), 2.89 (q, 2H), 3.13 (q, 2H), 5.14 (t, 1H), 5.79 (t, 1H), 7.19 (d, 1H, J = 7.32 Hz), 7.52 (t, 1H, J = 8.24 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 8.24 Hz), 8.23 (d, 1 H, J = 7.32 Hz), 8.32 (d, 1H, J = 8.55 Hz), 8.54 (d, 1H, J = 8.54 Hz).
13C NMR (CDCl3): δ 20.51, 23.38, 28.75, 28.90, 39.07, 40.39, 42.90, 45.43, 115.25, 118.77, 123.22, 128.41, 129.55, 129.67, 129.95, 130.43, 134.85, 152.06, 170.88.
HRFABMS: m/z 424.1757 [calcd. for C20H29N3O3S2 (M + H+) 424.1728]. Elemental analysis: calcd (%) for C20H29N3O3S2·0.1CHCl3: C 55.43, H 6.73, N 9.65; found: C 55.46, H 6.79, N 9.54.
DansylC6SH
N-{6-[5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido]hexyl}-3-mercaptopropionam ide (収率 55%). 1H NMR (CDCl3): δ 1.19 (m, 4H), 1.36 (q, 2H), 1.37 (q, 2H), 1.58 (t, 1H), 2.45 (t, 2H), 2.78 (q, 2H), 2.89 (s, 6H), 2.89 (s, 2H), 3.16 (q, 2H), 4.97 (t, 1H), 7.19 (d, 1H, J = 7.32 Hz), 7.52 (t, 1H, J = 8.24 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 8.24 Hz), 8.24 (d, 1 H, J = 7.32 Hz), 8.31 (d, 1H, J = 8.55 Hz), 8.54 (d, 1H, J = 8.54 Hz). 13C NMR (CDCl3): δ 20.53, 25.69, 25.88, 29.26, 29.34, 39.13, 40.45, 42.96, 45.43, 115.22, 118.77, 123.38, 128.38, 129.51, 129.67, 129.95, 130.38, 134.94, 150.06, 170.73. HRFABMS:
m/z 438.1843 [calcd. for C21H31N3O3S2 (M + H+) 438.1885]. Elemental analysis:
2、 IMP-1およびVIM-2存在下におけるDansylCnSH (n = 2 − 6)の蛍光特性の変 化と解離定数の決定
蛍光スペクトル測定は25 ºC、スリット幅 5.0 nmの条件下、励起波長340 nm (測定波長：350 nmから800 nm)としてメタノール10 % を含む50 mM Tris-HCl (pH 7.4, 0.5 M NaCl) 緩衝液を用いて行った。
DansylCnSH (n = 2－6)の蛍光剤の濃度が100 µMになるようにメタノール (紫 外部吸収スペクトル用) で調製し、測定の際はこの溶液を 30µL とり全量 3 mL にして、測定溶液中1 µMの濃度になるようにした。
まず、新規蛍光剤DansylCnSH (n = 2－6) の蛍光量子収率を求めた。標準蛍光 物質であるキニーネ (in 0.1 M H2SO4) (Φ 0.54)90) を用いて励起波長340 nmとし
て (1) 式により相対的に求めた。
∫ ∫
× ε
×
×ε Φ
= Φ
standard sample
sample standard
standard sample
emission emission
(1)
ただし、
Φsample : DansylCnSH (n = 2－6) の蛍光量子収率
Φstandard : キニーネ (in 0.1 M H2SO4) の蛍光量子収率 (= 0.54)37)
ε sample : DansylCnSH (n = 2－6) のモル吸光係数
ε standard : キニーネ (in 0.1 M H2SO4) のモル吸光係数
∫emission sample : DansylCnSH (n = 2－6) の蛍光スペクトルの半値幅 (縦軸の値が 山の最大値Fmaxの半分になる所の横軸の幅) × ピーク高で求めた面積
∫emission standard : キニーネ (in 0.1 M H2SO4) の蛍光スペクトルの半値幅 × ピー ク高で求めた面積
次に1 µMの DansylCnSH (n = 2－6) 溶液に酵素 (IMP-1、VIM-2) 濃度が測定
溶液中0.1から10 µMになるように酵素溶液を適宜加えていき、励起波長340 nm として蛍光スペクトルを測定した。さらに、535 nmにおける蛍光強度を酵素濃 度に対してプロットし 式(6)の回帰曲線にあてはめ、解離定数Kdを求めた。
IMP-1 ならびに VIM-2 の解離平衡を式(2)のように定義する。ここで MBL は
IMP-1またはVIM-2を表す。
MBL DansylCnSH
MBL
-DansylCnSH K→←d +
(2) このときの解離定数Kdは
MBL]
-H [DansylCnS
[MBL]
H]
[DansylCnS free free
d =
K (3)
となりDansylCnSHならびにIMP-1またはVIM-2の全濃度は式(4)で表される。
[DansylCnSH]total = [DansylCnSH]free + [DansylCnSH-MBL] and
[MBL]total = [MBL]free+ [DansylCnSH-MBL] (4) 実測される蛍光強度Fは式(5)で表される。
total free total [DansylCnSH]
H]
[DansylCnS H] b
[DansylCnS
MBL]
-H [DansylCnS
a× + ×
F = (5)
ここでaおよびbはそれぞれ十分量のIMP-1存在下におけるDansylCnSH (n = 2
－6) の蛍光強度とIMP-1非存在下におけるDansylCnSH (n = 2－6) の蛍光強度 を表す。
式(3)と(4)を式(5)に代入すると式(6)が得られる。
) 4[MBL]
1) [MBL]
( [MBL]
-1 2( b
) 4[MBL]
-1) [MBL]
( -1 [MBL]
2( a
total 2
total d
total d
total 2
total d
total d
− + +
+
+ +
+ +
+
=
K K
K K
F
(6)
3、DansylC2SHの蛍光スペクトルに及ぼす溶媒効果
テトラヒドロフラン (THF) を用いて、各々の溶媒で100 µM DansylC2SHを調製 した。その溶液を30 µLとり各々の溶媒で3 mLにし測定溶液中1 µMになるよう にし、励起波長340 nmとして蛍光スペクトルを測定した。メタノールについて は、含率10、20、30、40、50、60、70、80、90 % の溶媒も調製し、同様にこれ らの溶媒で1 µMのDansylC2SH溶液を調製し、蛍光スペクトルを測定した。得ら れたスペクトルから極大蛍光波長 λmaxを求め、それぞれの溶媒の誘電率に対し てプロットした。用いた溶媒の誘電率91, 92)をTable 25に示す。
Table 25. Dielectric constants of the solvents used in this study91, 92).
Methanol mixture Dielectric constant (ε)
10 % 75.8
20 % 71.0
30 % 66.0
40 % 61.2
50 % 56.5
60 % 51.5
70 % 46.5
80 % 41.5
90 % 36.8
Solvent Dielectric constant (ε) Methanol 32.6
Ethanol 24.3 Butanol 17.1 Octanol 10.3 DCM 9.08
THF 7.58
4、DansylCnSH (n = 2－6) によるIMP-1およびVIM-2阻害の検討
所定の濃度となるようにメタノールで調製したDansylCnSH (n = 2－6) 溶液 0.1 mL と 50 mM Tris-HCl (pH 7.4, 0.5 M NaCl) 緩衝液で調製した 31 nM の
IMP-1(VIM-2)溶液0.1 mLをUV測定用セルに入った50 mM Tris-HCl (pH 7.4, 0.5 M NaCl) 緩衝液2.8 mLに加え全量3.0 mLとした。30 ºCで10分間インキュベー トした後、この溶液に3.1 mM ニトロセフィンのDMSO溶液0.1 mLを加え混合
し491 nmにおける吸光度変化を経時的に3分間測定した。コントロールとして、
DansylCnSH (n = 2－6) の代わりにメタノール0.1 mLを用いて同様に測定した。
得られた各初速度より見かけの分子活性k2 / min-1を求め、DansylCnSH (n = 2－
6)の濃度に対してプロットした。これよりIC50を求め、さらに(4)式(実験項:第 2
章に関する実験)の拮抗阻害の回帰曲線より阻害定数Ki値を求めた。
5、IMP-1とDansylC4SHとの複合体のX線結晶構造解析
5-1、IMP-1とDansylC4SHとの複合体の結晶化
IMP-1溶液をセントリコンで濃縮し、20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5) 緩衝液に 変換した後、500 µM (10 mg / mL) まで濃縮した。その後メンブレンフィルター に通し、結晶化用のタンパク溶液とした。
リザーバ溶液は、2.0 gのPEG 4000を10 mLのメスフラスコに入れ、0.2 M 酢 酸ナトリウム－0.1 M クエン酸ナトリウム (pH 6.5) を調製、メスアップし、こ の溶液をメンブレンフィルターに通した。
DansylC4SH は濃度が約 10 mMとなるようにメタノールに溶かし、その後メ
ンブレンフィルターに通し、結晶化用の蛍光試薬溶液とした。
結晶化は20 ºCにおいて蒸気平衡法 (hanging drop) で行った。30 µLのタンパク
溶液と30 µLのリザーバ溶液を混ぜ、そこに15 µLの蛍光試薬溶液を加え氷上で
十数個成長した。結晶は空間群 (space group) がP212121で斜方晶系に属し、格子 定数 (unit cell dimensions) はa = 37.905 Å、b = 55.896 Å、c = 59.445 Åであり、非 対称単位中に結晶学的に独立なタンパク質分子が2つ存在した。
5-2、IMP-1とDansylC4SHとの複合体のX線結晶構造解析
2.4 Åの分解能の回折データは、SPring-8のビームラインBL38B1において、1.00 ÅのX線でADSC CCDカメラをdetectorとして100 Kで測定した。測定時間30秒、
振動角0.5 ºで360枚データを集めた。また結晶－detector距離は220 mmにした。
結晶は結晶化溶液であるDropを25 % PEG-4000を含む0.2 M 酢酸ナトリウム
－0.1 M クエン酸ナトリウム (pH 6.5) 2 µLずつで数回置換しcryoprorectedした。
これらのデータはDENZO / SPACEPACK93)を使って、integrating、merging、scaling した。Table 26に測定条件と結晶データ、回折データをまとめた。
DansylC4SHとIMP-1 との複合体の構造は分子置換法によって決定した。2000
年 にConchaらによって報告されているP. aeruginosa由 来 のIMP-1 (PDB file, 1DD6)76) をsearch modelとして使用した。プログラムはCCP-4のAMoReを用いた。
グラフィックプログラムO94) でモデルを修正し、プログラムCNS83) で構造の精 密化を行った。精密化には結晶学的に独立な 2 つのタンパク質分子が同一構造 を持つという制限(noncrystallographic symmetry, NCS) を用いて行った。また
DansylC4SHの構造は新規な構造だったので、
http://www.alpha2.bmc.uu.se/hicup
にある既存の化合物の parameterと topology から DansylC4SH の parameterと topologyを作成し、DansylC4SHの構造の精密化に用いた。Table 27 に精密化で 得られたデータをまとめた。
Table 26. X-ray Data collection.
(a) Measurement condition
X-ray source SPring-8 BL38B1 wave length 1.00 Å
camera type ADSC CCD camera camera distance 220 mm
crystal size 0.2×0.2×0.2 mm
temperature 100 K
(b) Crystallographic data Space group P212121
Cell constant a =37.905 Å b =55.896 Å c =59.445 Å Z 8 Vm 2.51 Å3/dalton
(c) Diffraction data
resolution 2.4 Å
no. of obserbed 133304 no. of unique reflections 19464
completeness 97.6 %
R-merge 0.055
I / Sigma 23.8
Refinement data
Rworking 0.208
Rfree 0.247
no. of used reflection (F ≠ 0) 19418 no. of atoms in asymmetric unit 2
Protein 3388
Ligand 54
Solvent 220
rms deviation from ideal
bond lengths (Å) 0.01 bond angles (deg) 1.6
謝 辞
本研究に際し闘病中も終始ご指導、ご鞭撻を賜りました熊本大学大学院医学 薬学研究部 構造機能物理化学分野（故）後藤正文教授に深甚なる謝意を表し ます。
本研究に際し終始ご指導、ご鞭撻を賜りました熊本大学大学院医学薬学研究 部 構造機能物理化学分野 黒崎博雅助教授に深甚なる謝意を表します。
本研究に際し終始ご指導、ご鞭撻を賜りました熊本大学環境安全センター 山口佳宏助教授に深甚なる謝意を表します。
名古屋大学における研究を行うに際し、終始ご指導、ご鞭撻を賜りました名 古屋大学医学系研究科分子病原細菌学分野 太田美智男教授に深甚なる謝意を 表します。
本研究を行うに際し、多々ご協力を戴いた国立感染症研究所細菌第二部 荒 川宜親部長に厚く御礼申し上げます。
本論文の審査にあたり、有益な御助言と御校閲を賜りました熊本大学大学院 医学薬学研究部 生体機能分子合成学分野 大塚雅巳教授、熊本大学大学院医 学薬学研究部 機能分子構造解析学分野 山縣ゆり子教授、熊本大学大学院医 学薬学研究部 薬学微生物学分野 鈴木啓太郎助教授に心から感謝いたします。
名古屋大学における研究を行うに際し、終始ご指導、ご鞭撻を賜りました名 古屋大学医学系研究科分子病原細菌学分野 山田景子助手に深甚なる謝意を表 します。
本研究に際し、多々ご協力を戴いた熊本大学大学院医学薬学研究部 構造機 能物理化学分野 寺沢宏明教授に深甚なる謝意を表します。
部機能分子構造解析学分野 山縣ゆり子教授、池水信二助教授に厚く御礼申し 上げます。
名古屋大学における研究を行うに際し、ご指導、ご鞭撻を賜りました名古屋 大学理学研究科 生体超分子物理研究室(J研) 神山 勉教授、村上 緑助手に厚 く御礼申し上げます。
本研究を行うに際し、ご指導、ご鞭撻を賜りました森 弘正博士に深く感謝 いたします。
熊本大学で勉強・研究するに当たって、常に暖かい励ましとご協力を戴いた 保澤寿美氏、東 俊博氏、松枝 聖氏、三津谷可奈氏、廣松和修氏、所賀明日 美氏、松永和代氏をはじめ本研究室の諸氏に心から感謝申し上げます。
名古屋大学で勉強・研究するに当たって、常に暖かい励ましたとご協力を戴 いた名古屋大学 医学系研究科 分子病原細菌学分野・理学研究科 生体超分子物 理研究室(J研)の諸氏に心から感謝申し上げます。
日本へ留学の期間に、御支援を戴いた熊本大学、熊本大学大学院薬学研究科、
名古屋大学医学系研究科、ライオンズクラブ国際協会(337-D-2001年度)、日本文 部 科 学 省(2002 年 度)、(財)留 学 生 支 援 企 業 協 力 推 進 協 会((株)肥 後 銀 行)(2002~2004)、日本文部科学省(2005~2006 年度)の先生方、皆様に厚く御礼申 し上げます。
博士課程終了に際し、ここまでお教えて戴いた、お暖かい励まして戴いたた くさんの母国の先生方、日本の先生方に厚く御礼申し上げます。
最後に、御支援と御理解を戴いた家族の皆様に深く感謝申し上げます。
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