それぞれの菌体の可溶性画分を 12.5 ％のポリアク リルアミドゲルで，250 V，20 mA，60分泳動した．
4) ウエスタンブロッティング
PVDFメンブレンに12 Vで60分通電し転写した．
メンブレンは PBS で 5 分洗浄を 2 回繰り替えした後 に，EzBlock BSA ( アトー株式会社 ) を用いて60分ブ ロッキングした．PBSで5分洗浄し，60分1次抗体反 応を行った．一次抗体反応液は，各ウサギ血清抗体を
PBS で4,000 倍希釈したものを用いた．二次抗体反応
は Multi Capture HRP ( 和光純薬工業株式会社 ) を用 いて 60分行った．EzWestBlue ( アトー株式会社 ) を 用いて5-15分反応させ発色させた．
表1 使用菌株とプラスミドベクター 一般共同研究・生物圏
ブロッティングを行った結果，DHA合成酵素遺伝子産 物のうちPfaA，PfaB，PfaC，PfaDにおいて特異的な発 色シグナルを示した．PfaEには特異的な反応は見られ ず，S. pneumatophori SCRC-2738のサンプルのみ広範囲 に非特異的な微弱な反応が見られた(図2)．また，上記 を含む全てのEPA合成酵素遺伝子産物には特異的な反 応は見られなかった．結果には示していないが，pfaE 遺伝子過剰発現大腸菌株を作成して同様の条件でPfaE 抗体を使用したウエスタンブロッティングでは特異的 な発色シグナルが確認できた．DHA合成に関わる pfa 遺伝子産物とEPA合成に関わるpfa遺伝子産物間のア ミノ酸配列上の類似性のため，MP-1由来の作製ポリク ローナル抗体がEPA合成に関わるpfa遺伝子にも反応 することが考えられた(表2)．しかし，ウスタンブロッ ティングの結果，両者遺伝子産物の反応には明らかな 差異が見られたことから，実際には，抗原認識部位(エ ピトープ) において，使用した菌株間ではアミノ酸配 列上の相同性が低く，DHA合成酵素遺伝子産物にのみ 特異的に反応したことが考えられた．更に，MP-1と同 じ好冷菌であるColwellia psychrerythraea 34Hのpfa遺 伝子産物のアミノ酸配列を参照し比較した結果，S.
pneumatophori SCRC-2738 よりも高い相同性が認めら れたことから，MP-1由来の作製ポリクローナル抗体が C. psychrerythraea 34Hに反応する可能性が予想された．
これによって，作製ポリクローナル抗体を使用した DHA 合成細菌スクリーニングへの利用も期待される．
また，MP-1由来のpfaE遺伝子産物についてはpfaE 遺伝子過剰発現株のみに明瞭な反応が得られたことか ら，pfaE遺伝子の発現量がウエスタンブロットの感度 限界を下回った可能性が考えられた．より明瞭な反応 を得るためには，ウエスタンブロッティングの条件検 討，対象とする推定エピトープの変更を含めた更なる 最適化が必要であると考えられる．
図1．EPA/DHA合成細菌由来のpfa遺伝子群の遺伝子マップ
図2．ウエスタンブロッティングの結果．PfaA-Dには特異的な発色
シグナルを確認．( 1：SCRC-2738，2：MP-1，3：DH5α/pDHA4，4：
DH5α/pSTV29，矢印：各目的遺伝子産物と思われる発色シグナル )
[まとめ]
海洋細菌M. marina MP-1由来のDHA合成に関わる 5つのpfa遺伝子群（pfaA-pfaE）のうち、グラム陽性菌 であるBrevibacillus choshinensisにおいて確実に発現・
保持されていることを、ウエスタンブロット法で確認 するため，より特異的な抗体作成を試みた．その結果，
DHA合成遺伝子群pfaA-pfaEのほぼすべての産物に明 瞭な反応がみられることが示された．現在までにpfaB および pfaE において遺伝子導入が実施されているが，
今後は，今回作成した抗体を用いることでより安定し た抗原抗体反応が可能となることから，B. choshinensis の DHA 合成遺伝子群を導入した組み換え体の確実な 取得が期待される．
表2 推定エピトープのアミノ酸配列
[研究発表]
ポスター発表
1 ) Kenji Gocho, Mikako Hashimoto, Kiyohito Yoshida, Ayano Horiuchi, Megumi Yokoyama,Yoshitake Orikasa.
Detection of bacterial poly unsaturated fatty acids synthetic enzyme using polyclonal antibody. 第67回日本生 物工学会大会., Kagoshima, Japan, 26 Oct. 2015.
[研究協力者一覧]
堀内綾乃，午膓健司（帯広畜産大学・食品科学）
（共同研究報告書（終了） ）
【研究課題名】
北極植物の気候変動に対する成長応答の解明
【共同研究者】
◎和田直也 富山大学研究推進機構極東地域研究センター・教授
（国立極地研究所）
内田雅己 准教授 伊村 智 教授
【研究期間】
平成28年～平成29年（６ヶ月）
【研究成果】
氷河後退域における植生遷移の理解を深めるた めに、氷河後退後約 70 年以内に侵入・定着したキ ョクチヤナギ（Salix polaris）の遷移初期集団に着 目し、遷移後期集団との葉形質の比較を通じて、本 種の生理生態学的環境馴化力を評価した。
調査地は、高緯度北極圏内にあるスバールバル諸 島ニーオルスンの東ブレッガー氷河後退域である。
現地調査及び資料の採取は2010年7月に実施した。
着目した葉形質は、個葉面積、SPAD値（葉緑素 含量）、LMA（Leaf Mass per Area）、炭素濃度、窒 素濃度、CN 比、プロアントシアニジン（縮合型タ ンニン）濃度、炭素安定同位体比、窒素安定同位体 比である。葉面積は葉の短径と長径の実測値から楕 円近似から算出し、SPAD値はコニカミノルタの葉 緑素計（SPAD-502PLUS）、炭素及び窒素濃度はCN コーダ分析器（Yanaco MT-700）、プロアントシア ニジンはブタノール塩酸法、炭素及び窒素安定同位 体比は元素分析／同位体比質量分析計（EA/IRMS） を用いて測定した。
遷移初期集団と後期集団の生育環境を明らかに するため、微気象の観測と土壌理化学性について調 査した。微気象については、気温、湿度、日射得量、
土壌水分量を、土壌理化学性については、炭素濃度、
窒素濃度、CN 比、炭素及び窒素安定同位体比につ いて調べた。
氷河後退域の遷移初期集団の生育環境は、未発達 な有機物土壌のため、貧栄養と乾燥ストレスに曝さ れていることが予想される。このような環境に馴化 するためには、菌根菌との共生による窒素利用効率 の増大や気孔の閉鎖に伴う水利用効率の増大が期 待される。これらの指標として、前者については窒 素安定同位体比、後者について炭素安定同位体比を 用いた。キョクチヤナギと共生している外生菌根菌 は有機物中の窒素を分解・吸収して宿主に渡す時に 同位体分別を行うため、菌根菌存在下では宿主の窒
素同位体比は有機物土壌の値や非共生植物の値よ りも低くなることが予想される。また、植物は乾燥 ストレスに曝されると水利用効率を高めるために 気孔を閉鎖する割合を高め、その結果として二酸化 炭素を固定する酵素であるルビスコ（リブロース 1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ）
の同位体分別が低下し高い炭素同位体比を示すこ とが期待される。さらに、植食者に対する防御物質 と考えられるプロアントシアニジンの濃度を調べ ることにより、遷移初期集団の被食防御力を評価し た。
図１．キョクチヤナギの遷移初期と後期集団の微気 象の比較
微気象の比較から、気温、湿度、日射量について は集団間に大きな違いはみられず、土壌水分のみに 顕著な違いがあることが分かった（図1）。
(裏面に続く)
（２枚目）
図２．キョクチヤナギの遷移初期と後期集団の土壌 特性の比較
土壌特性の比較から、遷移初期集団の土壌は炭素 及び窒素が著しく乏しく、また同位体比も大きく異 なることから有機物の起源が異なる可能性がある ことが分かった（図2）。
図 3．キョクチヤナギの遷移初期と後期集団の葉形 質（葉面積・SPAD値・LMA）の比較
葉面積は両集団間で有意な差はみられなかった
（図3）。SPAD値（図3）及び窒素濃度（図4）は 遷移初期集団でやや高い値を示していたが統計的 に有意な差は検出されなかった。
葉の窒素同位体比は両集団間で有意な差はみら れず（図 4）かつ土壌中の値（図 2）よりも低い値 を示していたことから、遷移初期集団においても外 生菌が関与しておりその結果高い葉内窒素濃度が 維持されていることを明らかにした。
図 4．キョクチヤナギの遷移初期と後期集団の葉形 質（C濃度・N濃度・δ13C・δ15N）の比較
乾燥ストレスに応じて増大が予想された葉形質 の一つであるLMAは遷移初期集団において低い値 を示した。葉の炭素濃度は遷移初期集団で有意に低 く、かつ葉の炭素安定同位体比が予想に反して低い 値を示した。これらの結果は、遷移初期集団におい てよりもむしろ遷移後期集団において水利用効率 が高く、乾燥ストレスが強いことを示唆していた。
図 5．キョクチヤナギの遷移初期と後期集団の葉形 質（CN比・プロアントシアニジン濃度）の比較
葉のCN比は遷移初期集団で低かった。一方、プ ロアントシアニジン濃度は両集団間で有意な差が 検出されなかった。これらの結果は、遷移初期集団 では防御物質に大きな投資を行っていないこと、低 いCN比は植食者の選好性を介して被食されるリス クが高いことを示唆していた。
1．平尾 章（筑波大学菅平高原実験センター）
2．蒲池 浩之（富山大学大学院理工学研究部（理学領域））
3．中坪 孝之（広島大学大学院生物圏科学研究科）
4．WIDORY DAVID（Université du Québec à Montréal）