95 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
励起法の例 ４
細胞の核を PI で、微小管を Alexa488 で染めて B 励起観察
４００ ５００ ６００ ｎｍ
B 励起ﾌｨﾙﾀを使用
PI
蛍光用対物レンズ
・色収差はセミアポクロマート、アポクロ マート級以上
・・・色が画像の重要な要素
・高開口数
･･･明るい像の条件
・・・油浸対物レンズと水浸対物レンズ の使い分け
・広い波長帯で透過率が高い
・・・適用する励起波長、蛍光波長の波 長帯が広い
・（レンズ自体の）自家蛍光が少ない
･･･よいコントラストの条件
97 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
蛍光用対物レンズに望ましい分光透過率特性
蛍光顕微鏡用光源
一般的に水銀ランプ、
一部キセノンランプ、
ハロゲンランプ
99 2010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
位相差顕微鏡
位相差顕微鏡
項目
位相差顕微鏡の特徴 位相差顕微鏡の構成 位相差観察の原理
ポジティブ（ダーク）コントラストと ネガティブ（ブライト）コントラスト
1012010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
位相差顕微鏡の特徴
無染色標本の観察
・・・細胞の観察
厚い試料の観察には向かない
・・・数μｍ以上になるとハローが強くなる 薄い試料の形態観察で検出感度が高い
位相差像 微分干渉像
ハロー
上皮細胞
位相差顕顕微鏡の構成
蛍光用高輝度ランプハウス 透過用
ハロゲンランプハウス
蛍光用投光管
位相差対物レンズ 接眼レンズ
蛍光フィルタ 位相差コンデンサ
ユニバーサルコンデンサ
1032010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
位相差顕顕微鏡の構成
リングスリット切換え用 ターレット
ユニバーサルコンデンサ
位相差観察の原理
原理図
ﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｺﾝﾃﾞﾝｻ 位相差ｺﾝﾃﾞﾝｻ
位相差対物ﾚﾝｽﾞ 位相板
リングスリット
観察側 照明側
試料面
1052010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
位相差観察の原理
位相差 ｺﾝﾃﾞﾝｻ
位相差 対物ﾚﾝｽﾞ
位相板 試料
中間像位置 ﾘﾝｸﾞｽﾘｯﾄ
細胞
照明光がﾘﾝｸﾞｽﾘｯﾄに入射する
ﾘﾝｸﾞ状の２次光源から照明 光が標本を照明する
細胞を通過する際に、±1次回 折 光 と 直 進 光 と に 分か れ る。
±1次回折光は直進光より位相 が1/4波長遅れる。
直進光はﾌｪｰｽﾞﾌﾟﾚｰﾄで位相が 変わり、±1次回折光と1/2波 長の位相ずれとなる。
3本の光線が、中間像位置で 干渉し、像に明暗のｺﾝﾄﾗｽﾄが つく
位相差観察の原理
ポジティブ（ダーク）コントラスト
直進光と回折光の位相差が１
/
２波長（逆位相）の場合、像の輝度は低くなり、
明るい視野に試料のコントラストが黒く見 える
⇒主に形態観察用
ネガティブ（ブライトコントラスト）
直進光と回折光の位相差が同位相の 場合、像の輝度は高くなり、暗い視野に 試料のコントラストが明るく見える
⇒主に試料の計数用
気中アスベスト
（グリーンフィルタ使用）
1072010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
参考：コントラストの呼び名と特性
ポジティブ ＰＬＬ ＰＬ ＰＭ ＰＨ・・・オリンパス ＤＬＬ ＤＬ ＤＭ ＤＨ・・・ニコン
ネガティブ ＮＬＬ ＮＬ ＮＭ ＮＨ・・・オリンパス ＢＬＬ ＢＬ ＢＭ ＢＨ・・・ニコン
コントラスト 弱い 強い
ハロー 弱い 強い
厚い（太い）試料向き 薄い（細い）試料向き
形態観察向き
計数向き
微分干渉顕微鏡
微分干渉顕微鏡
1092010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
項目
微分干渉顕微鏡の特徴 微分干渉顕微鏡の構成 微分干渉観察の原理
シアリング量と分解能、コントラスト（立体感）
コントラストの方向性
微分干渉顕微鏡の特徴
無染色標本の観察
・・・細胞～プランクトン
位相差でハローの強い厚い試料も観察で きる
位相勾配の検出感度が高い
試料自体に光学的異方性があると本来
のコントラストで観察できない 線虫
上皮細胞 培養細胞
1112010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
微分干渉顕顕微鏡の構成
蛍光用高輝度ランプハウス 透過用
ハロゲンランプハウス
蛍光用投光管
微分干渉対物レンズ 接眼レンズ
微分干渉プリズム ユニバーサルコンデンサ 微分干渉プリズム素子 ポラライザ
アナライザ
微分干渉顕顕微鏡の構成
ユニバーサルコンデンサ ポラライザ
微分干渉プリズム素子 切換え用ターレット
1132010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
微分干渉顕顕微鏡の構成
微分干渉プリズム スライダ
微分干渉観察の原理
ユニバーサルコンデンサ
微分干渉用 対物ﾚﾝｽﾞ
ｱﾅﾗｲｻﾞ
微分干渉ﾌﾟﾘｽﾞ素子
微分干渉ﾌﾟﾘｽﾞﾑ 微分干渉スライダ ポラライザ
観察側 照明側
試料面 原理図
1152010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
微分干渉観察の原理
微分干渉 ｽﾗｲﾀﾞ
ﾕﾆﾊﾞｰｻ ｺﾝﾃﾞﾝｻ
微分干渉用 対物ﾚﾝｽﾞ
微 分 干 渉 ﾌ ﾟ ﾘ ｽ ﾞ ﾑ 素子
ﾎﾟﾗﾗｲｻﾞ
ｱﾅﾗｲｻﾞ 対 物 側 微 分 干 渉 ﾌﾟﾘｽﾞﾑ
試料
中間像位置
細胞
直線偏光にする
振動方向が直交する2本 の直線偏光に分ける
細胞を通過する際に、2 本 の 光線に位相差が生 ずる
位相差のある光線を1本にあ わせる（楕円偏光になる）
位相差に応じた干渉効果 により、像に明暗や色の ｺﾝﾄﾗｽﾄが付く
シア量
微分干渉観察の原理
シア量： 大きい ⇒ コントラスト大、分解能 低 小さい ⇒ コントラスト小、分解能 高
位相勾配が小さい（薄い）試料 ⇒ シア量 大が適する：高コントラストプリズム 位相勾配が大きい（厚い）試料 ⇒ シア量 小が適する：高分解能プリズム
1172010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
微分干渉観察の原理：シア量とコントラスト
標準シア量 シア量 小
厚い試料：線虫
微分干渉観察の原理：シア量とコントラスト
標準シア量 シア量 大
薄い試料：培養細胞
1192010/4/16 No data copy / No data transfer permitted
微分干渉観察の原理：コントラストには方向性がある
ボルボックス コントラストが高い コントラストが低い
２光束が ずれた方向