PEG-DEN の調製

デンドリマー

0.5 mL

を試験管に加えて減圧下メタノールを完全に除去した。

その後、

SUNBRIGHT

^®

ME-020-AS 30 mg

と DMSO 0.5 mL を加えて完全に溶解し、

室温で攪拌した。その後、水中で 5 日間透析 (Spectra Pore^®：

MWCO=3,500)

し、

凍結乾燥にて本品を得た。 PEG-DEN：¹

H-NMR (500 MHz, D

2

O)

：3.77-3.73

(dendrimer, methylene), 3.62-3.60 (dendrimer, methylene), 3.57 (PEG ethylene),

3.46-3.21 (dendrimer, methylene), 3.20-3.15 (dendrimer, methylene), 3.04-3.00

(dendrimer, methylene), 2.80-2.72 (dendrimer, methylene), 2.54-2.52 (dendrimer,

methylene), 2.35-2.32 (dendrimer, methylene), 2.12-2.06 (dendrimer, methylene),

1.88-1.81 (dendrimer, methylene), 1.53-1.44 (dendrimer, methylene), 1.27-1.20

(dendrimer, methylene).

101

12. プラスミドの調製

pDNA の増幅：

pRL-CMV Luciferase DNA

を導入した大腸菌株

JM109

を

100

g/mL のアンピシリンを含む LB 培地 (BACTO TRYPTONE 10 g, BACTO

YEAST 5 g, NaCl 5 g/1,000 mL) 6 mL

中で、37ºC で 6-9 時間予備培養し、その 後、新たな 2,000 mL に加え、

37ºC

で 12-15 時間培養した。さらに、

100 g/mL

のアンピシリンと 170 g/mL のクロラムフェニコールを含む LB 培地 800 mL を添加し、

37ºC

で

12-15

時間培養した

(260 rpm)

。

pDNA の精製：QIAGEN 製 Plasmid Purification MAXI Kit を用いて行った。

精製操作はマニュアルに準じて行い、精製後の

DNA

濃度は、

Tris-EDTA

溶液

(TE)

に 溶 解 し て 分 光 光 度 計

(Nano Drop

製

ND-1000)

を 用 い 、

Operation Software

により算出した。 また、OD₂₆₀

/OD

₂₈₀ の値から、タンパク質混入の有 無を判定し、

1.8

以上の値を示すサンプルを実験に用いた (< -0.1 EU/g DNA；

1 ng LPS=1.8 EU)。

13. PEG 化キャリア/CyDs PPRXs の調製

TE

に 溶 解 し た 種 々 の 濃 度 の

PEG

化 キ ャ リ ア

(PEG-DEN

お よ び

PEG--CDE)

に、-CyD 飽和水溶液 (145 mg/mL)、b-CyD 飽和水溶液 (18.5

mg/mL)

あるいは -CyD 飽和水溶液

(232 mg/mL)

を添加し、軽く混和後、

4ºC

で 12 時間静置した (Fig. 47)。

Fig. 47. Preparation Scheme of PEG-DEN/CyDs PPRXs and

PEG--CDE/CyDs PPRXs

102

14. pDNA/PEG 化キャリア/CyDs PPRXs の調製

TE

に溶解した種々の濃度の

PEG

化キャリアに、

TE

に溶解した

pDNA

を加 え、軽く混和後、15 分間室温でインキュベートした。 その後、-CyD 飽和水 溶液 (145 mg/mL)、b-CyD 飽和水溶液 (18.5 mg/mL) あるいは -CyD 飽和水溶 液 (232 mg/mL) を添加し、軽く混和後、4ºC で 12 時間静置した (Fig. 48)。

Fig. 48. Preparation Scheme of pDNA/PEG-DEN/CyDs PPRXs and pDNA/PEG--CDE/CyDs PPRXs

15. 物性測定

pDNA との相互作用：

HBSS

に溶解した種々の濃度のキャリアに、

TE

に溶解

した pDNA 2 L (0.1 g/L) を加え、軽く混和後、15 分間室温でインキュベー トした。本反応液に重層用試薬

(60% (v/v)

グリセロール、

1 mM EDTA

、

0.004%

(w/v)

ブロモフェノールブルー、

0.004% (w/v)

キシレンシアノール) 2 L を添加 し、泳動用緩衝液 (Tris-borate EDTA : TBE ; 45 mM ホウ酸、1 mM EDTA) で調 製した 1% アガロースゲルを用い、

100 V

の定圧条件下で約 30 分間泳動した。

泳動終了後、アガロースゲルを

EtBr (100 ng/mL)

を含む

TBE

溶液中で

30

分 間振とうし、染色した。 染色終了後、FUJIFILM 製トランスイルミネーター

(FLA-9000)

によりゲルを撮影した。

PEG 化キャリア/CyDs PPRXs の粒子径および -電位：

TE

に溶解した各種

PEG

化キャリアに

10 mM Tris-HCl (pH 7.4)

で調製した -CyD 飽和溶液 (145

mg/mL)

あるいは -CyD 飽和溶液 (232 mg/mL) を添加し、軽く混和後、

4ºC

で

103

12

時間静置した。その後、粒子径・-電位測定装置 (Malvern 製 Zetasizer Nano) により粒子径および -電位を測定した。

pDNA/PEG 化キャリア/CyDs PPRXs の粒子径および -電位：TE に溶解し

た pDNA 5 L (1 g/L) と

TE

に溶解した種々のチャージ比に相当する PEG 化キャリアを加え、軽く混和後、

15

分間室温でインキュベートした。 その後、

Tris-HCl (10 mM, pH 7.4)

で調製した -CyD 飽和溶液

(145 mg/mL)

あるいは

-CyD 飽和溶液 (232 mg/mL) を添加し、軽く混和後、4ºC で 12 時間静置し、

粒子径・-電位測定装置 (Malvern 製 Zetasizer Nano) により粒子径および -電 位を測定した。

pDNA 複合体の酵素安定性：HBSS に溶解した種々の濃度の PEG 化キャリ

ア

5 L

に、TE に溶解した pDNA 2 L (0.1 g/L) を加え、軽く混和後、15分 間室温でインキュベートした。 反応緩衝液 (40 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、10

mM CaCl

2、

6 mM MgCl

2、

2 mM DTT) 1 L

、

DNase I (1 unit/mL) 1 L

を添加し、

37ºC

で 2 時間インキュベート後、

10% (w/v) SDS 5 L

を加え、さらに 37ºC で

1

時間インキュベートした。 本反応液に重層用試薬 (60% (v/v) グリセロール、

1 mM EDTA、0.004% (w/v)

ブロモフェノールブルー、0.004% (w/v) キシレンシ アノール

) 2 L

を添加し、泳動用緩衝液

(Tris-borate EDTA : TBE ; 45 mM

ホウ酸、

1 mM EDTA)

で調製した 1% アガロースゲルを用い、100 V の定圧条件下で約

40

分間泳動した。 泳動終了後、アガロースゲルを EtBr (100 ng/mL) を含む

TBE

溶液中で 40 分間振とうし、染色した。 染色終了後、

FUJIFILM

製トラン スイルミネーター

(FLA-9000)

によりゲルを撮影した。

pDNA/PEG 化キャリア/CyDs PPRXs の化学的安定性：

TE

に溶解した種々の

濃度の PEG 化キャリアに、TE に溶解した pDNA 2 L (0.1 g/L) を加え、軽 く混和後、

15

分間室温でインキュベートした。その後、-CyD 飽和水溶液

(145 mg/mL)

あるいは -CyD 飽和水溶液 (232 mg/mL) 200 L を添加し、軽く混和後、

4ºC

で

12

時間静置した。得られた PPRXs を、

4、 25

および 37ºC の条件下、

104

それぞれ 24、

48

および 72 時間インキュベートした。 その後、

PPRXs

を希釈 し、

CyD

を解離させた後、サンプル溶液

5 L

に

10% (w/v) SDS

を

5 L

添加 し、1 時間インキュベートした。 重層用試薬 (60% (v/v) グリセロール、1 mM

EDTA、0.004% (w/v)

ブロモフェノールブルー、0.004% (w/v) キシレンシアノー ル) 2 L を添加し、泳動用緩衝液 (Tris-borate EDTA : TBE ; 45 mM ホウ酸、

1 mM EDTA)

で調製した 1% アガロースゲルを用い、

100 V

の定圧条件下で約 30 分 間泳動した。 泳動終了後、アガロースゲルを

EtBr (100 ng/mL)

を含む

TBE

溶 液中で 30 分間振とうし、染色した。 染色終了後、FUJIFILM 製トランスイル ミネーター (FLA-9000) によりゲルを撮影した。

16. pDNA/PEG 化キャリア/CyDs PPRXs 中の pDNA 会合率の算出

TE

に溶解した pDNA 5 L (1 g/L) と

TE

に溶解したチャージ比 2 に相当 する PEG 化キャリアを加え、軽く混和後、

15

分間室温でインキュベートした。

その後、-CyD 飽和溶液 (145 mg/mL) あるいは -CyD 飽和溶液 (232 mg/mL) を添加し、軽く混和後、

4ºC

で

12

時間静置し、遠心分離

(5,000 rpm, 10 min, 4ºC)

後、上清中に含まれる

pDNA

の濃度を分光光度計 (Nano Drop 製 ND-1000) を 用いて Operation Software により算出した。なお、会合率は添加した pDNA の 濃度を 100% として、上清中に含まれる pDNA の濃度を差し引くことにより 算出した。

17. pDNA/PEG 化キャリア/CyDs PPRXs からの pDNA 放出実験

pDNA 30

g を含む各種

CyDs PPRXs

に各容量

(100

、300、

500

および

700L)

の

PBS (pH 7.4)

を添加し、スターラーバーを用いて

100 rpm

で攪拌し た。 経時的に採取した試料 20 L を遠心分離 (5,000 rpm, 3 min, 4ºC) し、上清 中に放出された pDNA の濃度を分光光度計 (Nano Drop 製 ND-1000) を用い、

Operation Software

により算出した。

18. 各種細胞の培養

Colon-26 細胞の培養：マウス結腸がん由来

Colon-26

細胞 (8 x 10⁵ 個) を

105

10% (v/v) FBS

含有 RPMI 1640 培地 (L-グルタミン 300 mg/L、NaHCO₃

2000 mg/L

、ペニシリン

1 x 10

⁵

U/L

、ストレプトマイシン

0.1 g/L) 10 mL

に懸濁し、

プラスティックディッシュ (100 mm) に播種して、

37ºC、 5% CO

₂ 濃度下で培養 した。セミコンフルエントに達した細胞をディッシュから剥離し、

3,000 rpm

で

3

分間遠心分離後、上清を取り除き、得られたペレットを 10% (v/v) FBS 含有

RPMI 1640

培地に、1.5 x 10⁵ 個/mL の密度で分散した。 この細胞懸濁液を 24

well-plate

に

2 x 10

⁵ 個

/well

になるように播種し、

6

時間培養した細胞をトラン スフェクション実験および細胞障害性の実験に用いた。

19. 培養細胞への細胞障害性およびトランスフェクション

pDNA/キャリア複合体の調製：1.5 mL エッペンドルフチューブに各種培地を

加え、HBSS に溶解した pDNA (2 g) を添加した後、HBSS に溶解した各種濃 度のキャリアを添加し、軽く混和後、15 分間室温でインキュベートし、pDNA/

キャリア複合体とした。

細胞障害性の検討：WST-1 法により評価した。Colon-26 細胞を 24 well-plate に 2 x 10⁵ 個/well になるように播種し、10% (v/v) FBS 含有培地で 6 時間培養 した。細胞を無血清培地 400 L で 2 回洗浄した後、pDNA (2 g)/キャリア複 合体を含む無血清培地を

200

L 添加し、

37ºC

、

5% CO

2 濃度下で

3

時間イン キュベートした。 その後、pDNA/キャリア複合体を除去し、10% (v/v) FBS 培 地含有培地 400 L を添加し、さらに 21 時間培養した。 その後、

HBSS 270 L

および WST-1 試薬 30 L の混和液を添加し、5% CO₂ 濃度下で 30 分間イン キュベートした後、マイクロプレートリーダー

(Bio-Rad

製

Model 550

；測定波 長 : 450 nm、参照波長 : 655 nm) により吸光度を測定した。 なお、細胞生存率 はキャリア非添加時を 100% として算出した。

トランスフェクション：

Colon-26

細胞を

24 well-plate

に

2 x 10

⁵ 個

/well

にな るように播種し、10% (v/v) FBS 含有培地で 6 時間培養した。 細胞を無血清培 地 400 L で 2 回洗浄した後、pDNA (2 g)/キャリア複合体を含む無血清培地

106

を 200 L 添加し、37ºC、5% CO₂ 濃度下で 3 時間インキュベートした。 その 後、

pDNA/

キャリア複合体を除去し、

10% (v/v) FBS

培地含有培地

400 L

を添 加し、さらに 21 時間培養した。

細胞抽出液の調製：トランスフェクション終了後の細胞を PBS (-) 400 L で

1

回洗浄後、PBS (-) で 5 倍希釈した細胞溶解剤 300 L を添加し、15 分間室 温でインキュベートし、さらに凍結

(-80ºC)

および融解

(37ºC)

を

3

回繰り返 した。得られた細胞溶解液を 10,000 rpm で 10 分間遠心分離し、その上清を細 胞抽出液とした。

ルシフェラーゼ活性の測定：細胞抽出液 20 L をルミノメーター用試験管

(Röhren Tubes、SARSTEDT)

に採取し、これに Luciferase Assay Substrate 100 L を添加した。 ルミノメーター (EG&G BERHTOLD 製 Lumat LB 9507) で 10 秒間の発光量を測定し、レニラルシフェラーゼ活性を評価した。

細胞抽出液中のタンパク質の定量：細胞抽出液 10 L に BCA Protein Assay

Kit

溶液を 200 L 添加し、37ºC、30 分間インキュベートした。 その後、マイ クロプレートリーダー (Bio-Rad 製 Model 550) にて 570 nm における吸光度 を測定した。 細胞溶解剤で

BSA

を希釈したものを標準液に用いて検量線を作 成し、上記ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度より相対発光量 (RLU) を 算出した。

ドキュメント内 利用した制御放出システムの構築 (ページ 100-106)