D．データ解析: ΔΔC
t法
NOTE: PCRアレイデータ解析ウェブポータル
下記アドレスのPCRアレイデータ解析ウェブポータルをご利用ください：
http://www.sabioscience.com/pcrarraydataanalysis.php
PCRアレイデータ解析ウェブポータルはリアルタイムPCR装置から得られるC
t値からΔΔC
tの自動計算を行い、コント
ロール評価まで行います。表フォーマット、スキャッタープロットデータ、3-Dプロファイル、ボルケーノプロットの結
果が得られます。
技術情報
技術情報
RT 2 TM PCRアレイ&アッセイ FAQ集
サンプル調製について
Q： 信頼できるqRT-PCR結果を得るために、RNA精製ステップは重要ですか？
A： 遺伝子発現解析実験において最も重要な必要条件は、実験ごとに一貫性のある、高品質なRNAを調製することです。
DNA、タンパク質、糖や有機溶媒によるコンタミが実験の成功を危ういものにします。RNAサンプルのゲノムDNA コンタミは遺伝子発現解析結果の品質を落とします。DNAコンタミはRNA濃度のOD値をつり上げ、RT-PCR実験の 間違ったポジティブシグナルの原因にもなります。RNaseコンタミはRNAサンプルを分解し、シグナルの値を低く して、PCRの間違ったネガティブシグナルの原因になります。RNAサンプル中に残った糖、コラーゲン、高分子ま たは有機溶媒は、DNaseの活性を阻害します。これはゲノムDNA除去のためのDNase処理に影響します。これらの コンタミは逆転写酵素とDNAポリメラーゼも阻害し、逆転写効率を低くしてPCR感度を下げます。
Q： 細胞や組織サンプルから高品質のRNAを精製するための手技上のポイントは何です か？
A： RNA抽出法においてRNaseがNo.1の脅威です。さらに、組織サンプルからRNAを抽出するときは、阻害作用のあ る混入物を一緒に精製してしまうことが主な問題になります。脅威を最小限に抑えるため、いつでも手袋をしてくだ さい。RNase-free試薬とRNase-free器具を必ず使用してください。さらに、通常組織／細胞溶解ステップはグアニ ジンイソチオシアネート（タンパク質変性剤）入りの溶解バッファーを用いて行ってください。RNA抽出時に十分量の 溶解バッファーを使用することがとても重要になります。組織／細胞ペレットに対して少なくとも10倍の溶解バッフ ァー（10X
4溶解バッファー／
1組織または細胞ペレット）を推奨しています。培養細胞から抽出するよりも組織サ ンプルから高品質のRNAを抽出することの方が難しく、RNaseを高レベルに含む組織やホモジナイズしにくい組織 は特に難しいです。例えば、肝臓、心臓、皮膚などです。多くの組織サンプルは、除くのが難しい混入物（糖、コラ ーゲン、脂肪、脂質、繊維）を含み、RNA調製物から除かれないと、次に続く酵素反応に影響します。組織サンプル のホモジナイズに溶解バッファーを多量に使用するとRNase分解からRNAを守ることができます。TRI reagentを 使用したRNA抽出とスピンカラムを用いたRNA精製の組み合わせを使ってください。この組み合わせが通常阻害性 の混入物なしのRNA調製物をもたらします。
Q： 遺伝子発現解析実験に用いるための高品質のRNAを細胞や組織サンプルから調製す るための最も信頼できる方法は何ですか？
A： SAバイオサイエンス社はRT
2qPCR-Grade RNA Isolation Kit（品番PA-001）をおすすめしています。培養細胞や 調製してすぐの白血球細胞は、直接このキットを使用できます。動物組織から高品質のRNAを抽出するには、このキ ットを使用する前にTRI reagentを使用して組織をホモジナイズしてフェノールクロロホルム抽出をしてください。
Q： cDNA合成のテンプレートとして使うRNAサンプルを保存する溶液のおすすめは何 ですか？
A： 最も良い結果を出すには、全てのRNAサンプルはRNase-free水に溶解してください。あるいは、RNase-free 1mM Sodium Citrate（pH6.5）または10mM Tris buffer（pH7.0）も使用可能です。DEPC処理水は使用しない でください。多くのDEPC調製物は逆転写反応やPCRを阻害する分子をコンタミしています。長期間保存する場合に は、RNase-free水に-70℃で保存か、上記バッファーに-70℃保存か、エタノールまたはイソプロパノール沈殿して ください。凍結融解を繰り返さないように、RNAサンプルは1反応ごとに小分けにすることをおすすめします。
Q： RNAサンプルの品質を評価するために何をすればいいですか？
A： 全てのRNAサンプルは分光光度法（10mM Tris pH8.0に希釈）と電気泳動法で評価し、下記の規格にあうことを確 認してください。
・トータルRNA濃度（A260）；40/5以上
・A
260: A
280比； 1.8から2.0
・SABioscience社ホームページ 引 用
・RT
2TM
Array
※商品案内26ページ参照 商 品
SABiosciences Corporation メーカー略号：SPA
技術情報
・ RNA6000 Nano LabChipを使用したAgilent Bioanalyzer（トータルRNA〜100
/）または、アガロースゲル電 気泳動（トータルRNA1.5
0、2.0%アガロース、エチジウムブロマイド染色）の結果、28S rRNAと18S rRNAの シャープなバンドが得られているか。スメアなバンドがでていないか。バンド強度の比（28S : 18S）が〜2:1にな っているか。
・ RNA6000 Nano LabChipを使用したとき、RNAがRIN（RNA integrity）スコア7.0以上。
上記のQCテストに加えて、SAバイオサイエンス社ではRNAサンプルのクオリティチェック用プレートを販売してい ます（ヒト用；品番PAHS-999X、マウス用；PAMM-999X、ラット用；PARN-999X）。これらのアレイは、高 レベルと低レベルのハウスキーピング遺伝子、逆転写反応効率、PCR反応効率、ゲノムDNAや一般的なDNAコンタ ミを評価できます。
Q： RNA調製物にRNaseコンタミの疑いがあるときはどうすればいいですか？
A： SAバイオサイエンス社のRT
2qPCR-Grade RNA Isolation Kit（品番PA-001）のようなスピンカラムベースの方法 で再精製してください。
Q： トータルRNAからゲノムDNAコンタミを避ける、または除くためにはどうすればい いですか？
A： 全ての実験はDNA-freeな環境で行ってください。必ず、推奨のRNA抽出法にDNase処理ステップを入れてください。
または、スピンカラムベースの方法で再精製したあと、RNase-free DNaseでRNAを別に処理してください。必ず、
RNase-free DNaseの製造元が推奨している使用量とincubate時間を2倍にしてください。組織サンプルからRNA を抽出するときは、DNase処理とRNA抽出の前にTRI reagent（MOR社 品番：TR118）抽出をしてください。
RNA調製時のDNAコンタミを最小限にするために、SAバイオサイエンス社RT
2First Strand Kit（品番：C-03）を おすすめします。本キットには逆転写前のゲノムDNAの除去ステップが含まれます。
逆転写反応について
Q： mRNA由来のcDNAから増幅がえられたのか、またはゲノムDNAコンタミから増 幅が得られたのか、どうやって判断すればいいですか？
A： 最も厳密な方法は逆転写酵素なしのコントロール（NRT）です。mRNA由来のcDNAテンプレートがなければ、検出 されるPCR産物はゲノムDNAコンタミ由来のもののみになります。
qPCRについて
Q： qPCRマスターミックスに含まれるROXやFluorescein色素は何のために含まれま すか？
A： ROXとFluorescein色素は各リアルタイムPCR装置に対応して用いられ、蛍光のばらつきを標準化し、ウェルごとの 容量の変化量を補正し、わずかな量の違いや濃度の変化を調整し、検出の精密さを最適化するのが目的です。
Q： qPCRやqRT-PCRに用いられるネガティブコントロールは一般的に何ですか？
A： qPCRとqRT-PCR実験には以下の3つのネガティブコントロールがあります。
１． テンプレートなしのコントロール（NTC；No Template Control）は、DNAテンプレートとRNAテンプレート がなく、外部からの核酸のコンタミ用のコントロールになります。SYBR Green使用時にプライマーダイマー形 成のコントロールとしても使えます。
２． 逆転写酵素なしのコントロール（NRT；No Reverse Transcriptase Controlまたは、MRT；Minus Reverse Transcriptase Control）は、逆転写酵素なしでqRT-PCR実験での逆転写反応を行います。RNA調製物中の DNAコンタミの量を評価します。
３． 増幅物なしのコントロール（NAC；No Amplification Control）は、PCR反応からDNAポリメラーゼを除きます。
これは蛍光のバックグラウンド用のコントロールになります。
Q： qPCRやqRT-PCRに用いられるポジティブコントロールは一般的に何ですか？
A： qPCR実験で、間違ったネガティブシグナルがあるかを確認するために、ポジティブコントロールは不可欠です。下 記の2種類のものがあります。
１． 外因性；目的物質をコードするDNAやRNAを外から加えるポジティブコントロール。実験サンプルとは別のウ ェルやチューブでこれらのポジコンの実験を行えば、逆転写・PCR反応条件が最適なものであったかどうかのコ ントロールになります。さらに、実験サンプルに添加し、平行して実験すると、逆転写・PCR反応を阻害する何 かがサンプルに含まれるかどうかの評価になります。
２． 内在性；実験サンプルに内在する物質で、研究目的とは異なるポジティブコントロール。正規化のために使用され、
サンプル間の量や質の差を補正するために使用されます。
ドキュメント内
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