第 4 章 現場診断に対応した超簡易迅速なウイルス遺伝子検出法の開発
4.3 成績
4.3.4 GEM RT-LAMP および GEM LAMP 法に対する血清および糞便の影響
ウ イ ル ス の 検 出 限 界 は そ れ ぞ れ 4×10-3.7 TCID50/reaction お よ び 2×10-1.3 TCID50/reaction であった（表 4-2）。血清存在下において、GEM RT-LAMP法を用 いたウイルスRNAの検出限界はブタおよびアシカの血清を除いてコントロール と同等であった（表 4-3）。しかし、ブタおよびアシカの血清を 10倍希釈するこ とにより、コントロールと同等の検出限界となった。一方 GEM LAMP法におい て、ウイルス DNAの検出限界はコントロールと同等であった
糞便試料を用いた場合、10 倍から 100 倍希釈した糞便試料を用いることで、
コントロールと同程度の検出限界となった（表 4-4）。
図 4-1 ウイルス核酸抽出のための RNA GEM の至適反応温度。ウイルス RNA および DNA は連続希釈したRNA ウイルス（CDV）および DNA ウイルス（PRV）
と RNA GEM を混合し、様々な温度下で 5 分間静置することによって核酸を抽
出し、続けて RT-PCR およびPCR を行った。
図 4-2 RT-LAMP 反応に対する RNA GEM の影響。95 °Cで 0 分から5 分間高熱
処理した RNAGEM を用いた。
図4-3 95 °Cで1分間高熱処理したRNA GEMを用いたRT-LAMP反応の目視検 査。図 a から図c は自然光下で、図 dおよび図 e は UV下である。それぞれの試 薬の陰性色および陽性色は、図 a； SYBR green I: オレンジおよび黄色、図 b；
PI: 淡いピンクおよび白みがかったピンク、図c； HNB: バイオレットおよびス カイブルー、図 d； SYBR green I: 黄色および緑、図e； PI: 赤およびオレンジ、
である。
表 4-2 GEM RT-LAMPおよび GEM LAMP法の検出能力の比較
RNA virus TCID50/reaction
Method 4×102.7 4×101.7 4×100.7 4×10-1.7 4×10-2.7 4×10-3.7 4×10-4.7
GEM RT-LAMP + + + + + ± -
Standard RT-LAMP + + + ± - - -
Modified RT-LAMP ± - - - - - -
DNA virus TCID50/reaction
Method 2×104.3 2×103.3 2×102.3 2×101.3 2×100.3 2×10-1.3 2×10-2.3
GEM LAMP + + + + + ± -
Standard LAMP + + + ± ± - -
Modified LAMP + + + + ± ± -
結果の再現性を確認するために、全ての操作を 3点併行で行った。+ は 3点 全て陽性の場合を、± は 3点の内陽性と陰性の両方を含む場合を、- は 3 点全 て陰性の場合を示す。
表 4-3 GEM RT-LAMPおよびGEM LAMP 法に対する血清の影響
RNA virus TCID50/reaction
% (v/v) animal 4×102.7 4×101.7 4×100.7 4×10-1.7 4×10-2.7 4×10-3.7 4×10-4.7
100 Cattle + + + + ± ± -
Pig - - - - - - -
Horse + + + + ± ± -
Dolphin + + + + ± ± -
Penguin + + + + + ± -
Sea lion - - - - - - -
10 Pig + + + + ± ± -
Sea lion + + + + ± ± -
DNA virus TCID50/reaction
% (v/v) animal 2×104.3 2×103.3 2×102.3 2×101.3 2×100.3 2×10-1.3 2×10-2.3
100 Cattle + + + + ± ± -
Pig + + + + + ± -
Horse + + + + + ± -
Dolphin + + + + + ± -
Penguin + + + + + ± -
Sea lion + + + + ± ± -
結果の再現性を確認するために、全ての操作を 3 点併行で行った。+ は 3 点 全て陽性の場合を、± は 3 点の内陽性と陰性の両方を含む場合を、- は 3 点全 て陰性の場合を示す。100 %（v/v）および 10 %（v/v）は未希釈の血清と 10倍 希釈した血清を示す。
表 4-4 GEM RT-LAMPおよびGEM LAMP 法に対する糞便の影響
RNA virus TCID50/reaction
% (w/v) animal 4×102.7 4×101.7 4×100.7 4×10-1.7 4×10-2.7 4×10-3.7 4×10-4.7
10 Cattle - - - - - - -
Pig + + - - - - -
Horse - - - - - - -
Dolphin + + - - - - -
Penguin + + + + + ± -
Sea lion + + - - - - -
1 Cattle + + + + + ± -
Pig + + + + ± ± -
Horse + + + + + ± -
Dolphin + + + + + ± -
Sea lion + + + + + ± -
DNA virus TCID50/reaction
% (w/v) animal 2×104.3 2×103.3 2×102.3 2×101.3 2×100.3 2×10-1.3 2×10-2.3
10 Cattle + + + ± - - -
Pig + + + + + + -
Horse + + ± - - - -
Dolphin + + + + + + -
Penguin + + + + + ± -
Sea lion + + + + + ± -
1 Cattle + + + + + ± -
Horse + + + + ± + -
結果の再現性を確認するために、全ての操作を 3 点併行で行った。+ は 3 点 全て陽性の場合を、± は 3 点の内陽性と陰性の両方を含む場合を、- は 3 点全 て陰性の場合を示す。10 %（w/v）および 1 %（w/v）は 10倍希釈した糞便およ び 100 倍希釈した糞便を示す。