Edwardsiella tarda 人為感染試験 - 魚類細胞性免疫機構における IFNγrel の機能解明

Edwardsiella tarda

は本学部海洋資源科学科間野伸宏博士より分与されたウナギ

分離株を用いた。菌は使用時まで

20%

グリセロール加トリプトソイ培地に懸濁

し、

-80°C

で保存した。保存した

E. tarda

をトリプトソイ寒天培地（フナコシ）

を用いて画線培養し、25°C で一晩培養した。形成されたコロニーを採取し、トリプトソイ培地（フナコシ）で

25°C 130 rpm

で

12

時間振騰培養した後、リン酸緩衝液（

20 mM

リン酸ナトリウム、

145 mM NaCl

、

pH 7.2

）で

3

回洗浄（

1000 ×g

、

25°C

、

10

分）し、

40%

致死濃度（

OD

595

= 0.22

、

1.2 × 10

⁸

CFU/ml

）となる様にリン酸緩衝液に再懸濁した。懸濁液を

1

匹あたり

100 μl

となる様に

OB1

系統ギンブナに腹腔内投与した。その後、頭腎、体腎、脾臓、肝臓、腸管および鰓を摘出し、

RNeasy Mini Kit

を用いて全

RNA

を回収後、

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

を用いて

cDNA

を合成した。

4.2.5 GVHR

の誘導とドナー由来細胞のソーティング

第

2

章において述べた方法により

GVHR

を誘導し、移植

0、3、 7、 14

日後にレシピエントの頭腎および体腎から白血球を回収し、Hoechst33342と

CD4

および

CD8α

に対するモノクローナル抗体を用いて染色を施した。セルソーター（

FACS

Aria II, BD）を用いてドナー由来 CD4

または

CD8

陽性

T

細胞をそれぞれ

1 × 10

⁵ 個ソーティングし、分取した細胞より

RNeasy Mini Kit

を用いて全

RNA

を回収後、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて

cDNA

を合成した。

4.2.6

鱗移植実験

<遺伝子発現解析>

アロ抗原感作のため、OB1系統より

S3N

系統のギンブナ体側に

10

枚の鱗移植を行った。移植

0

、

3

、

5

、

7

日後に、移植した鱗および移植部位の表皮を採取し、

ReliaPrep RNA Tissue Miniprep

（

Promega

）を用いて全

RNA

を回収し、

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

を用いて

cDNA

を合成した。対照実験として、同個体の反対側に同系（syngeneic）の個体間（S3N系統より

S3N

系統へ）で移植を行い、上記と同様に全

RNA

を回収後、

cDNA

を合成した。

<IFNγ

及び

IFNγrel

の投与効果

>

レシピエント

S3N

に、体重

1g

当たり

0.1 μg

となる様に組換え

IFNγ2、 IFNγrel

1

または

IFNγrel 2

を腹腔内に投与した。IFN投与から

24

時間後に、アロ抗原感

作のため

OB1

系統より

S3N

系統のギンブナに

10

枚の鱗移植を行った。移植

3

日後より移植片の拒絶過程を

12

時間おきに観察し、移植した鱗の黒色素胞が崩壊した時点を拒絶完了とした。

4.2.7

リアルタイム

PCR

IFNγrel

および

IFNγ

遺伝子の発現を検討するため、上記で述べた方法により

作製した

cDNA

を用いてリアルタイム

PCR

を行った。標的遺伝子の増幅の際には、参照として測定ごとに同一プレート上にハウスキーピング遺伝子（EF1α）

を入れたウェルを準備し、

Thermal Cycler Dice Real Time System II

（Takara）で反

応を行い、

mRNA

の相対定量を行った。標的遺伝子として用いたギンブナ

IFNγ1

、

IFNγ2、IFNγrel 1

および IFNγrel 2遺伝子、並びにハウスキーピング遺伝子として用いた EF1α遺伝子に特異的なプライマーの配列を

Table 4-1.

に示した。

PCR

は、

5 μl

の希釈した

cDNA、 12.5 μl

の

SYBR Premix Ex Taq II

（Takara）および

200 nM IFNγ1

、

IFNγ2

、

IFNγrel 1

、

IFNγrel 2

および

EF1α

に特異的なプライマーを加え、

25 μl

の反応液とした。最初に

95°C

で

30

秒の反応を行った後、

95°C

で

5

秒、60°C で

30

秒の反応を

45

サイクル行った。それぞれの標的遺伝子と

EF1α

の組み合わせについて∆Ct値を用いて標準化を行った。

各遺伝子の発現は内部標準遺伝子

EF1α

に対する相対発現量を

2

^-∆Ctで、または、

標準サンプルに対する目的サンプルの相対遺伝子発現量を

2

^-∆∆Ctで求めた。全ての反応は少なくとも

duplicate

で行った。なお、

∆Ct

値および

∆∆Ct

値は以下のように求めた。

∆Ct = Ct

_{ターゲット遺伝子}

- Ct

_EF1α

∆∆Ct = ∆Ct

_{目的サンプル}

- ∆Ct

_{標準サンプル}

4.2.8

凍結切片用ブロックの作製

ギンブナをベンゾカインで麻酔し、尾部血管より採血後、各組織を摘出し、

4% PFA-PBS

に入れ

4°C

で

12

時間固定した。固定後の組織を

30%スクロース加

PBS

に置換し、

4°C

にて

12

時間脱水処理した。その後、組織を液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結し、O.C.T. コンパウンド（サクラファインテック）に包埋した。作製したブロックは、薄切まで-80°Cで保存した。

4.2.9

凍結切片標本の作製及び免疫組織化学染色

作製した凍結ブロックを、クリオスタット

HM520

（MICROM）を用いて

8 μm

に薄切し、スライドグラスに貼り付けた。薄切した組織を

1

時間風乾した後、

スライドグラスを

37°C

の

PBS

中に

5

分間浸し、この操作を

3

回繰り返して洗浄

し、

O.C.T.

コンパウンドを除去した。その後、

2% BSA-PBS

を添加して室温で

20

分間ブロッキングし、各

1

次抗体をそれぞれ

4.2.1

で述べた濃度となるように

PBS

または

XL-Enhancer Immunostain（アプロサイエンス）で希釈し、4°C、12

時間反応させた。その後、0.1% Tween-20加

PBS（PBST）で 5

回洗浄し、二次抗体を終濃度

4 μg/mL

となる様に添加し、室温にて

90

分間反応させた。その後、

PBST

で

5

回洗浄し、

1 μg/mL

の

DAPI

加

PBS

にて核染色し、

PBS

にて

1

回洗浄後、

ProLong Gold

（

Life Technologies

）で封入した。蛍光顕微鏡

IX71

と撮影装置

DP73（いずれも Olympus）を用いて、蛍光観察及び撮影を行った。なお、二次

抗体添加以降の操作は可能な限り遮光した。

4.2.10

フローサイトメトリー

PMA

とイオノマイシンによる刺激後、細胞を表面抗原に対するモノクローナル抗体（mAb）を用いて

4°C

で

45

分間反応させた。0.5% FBS加

PBS

にて

3

回遠心（400 ×g、5分、4°C）洗浄した後、2% PFA-PBSに

1 × 10

⁷個/mlとなる様に懸濁し、室温で

15

分間固定した。

3

回洗浄後、

0.1%

サポニン、

0.5% FBS

加

PBS

に

1 × 10

⁶個/mlとなる様に懸濁し、20分間室温で静置し膜透過処理を行った。

その後、抗インターフェロン抗体をそれぞれ

4.2.1

で述べた濃度となるように加え、4°Cで

45

分間反応させた。3回遠心（400 ×g、5分、4°C）洗浄後、二次抗

体を加えて

4°C

で

30

分間反応させた。さらに、

3

回遠心（

400 ×g

、

5

分、

4°C

）洗浄後、2.5 μg/mLの

PI

加

PBS

で核を染色した。解析には

FACSCanto（BD）を

用い、PI陽性のリンパ球集団における、各抗体の陽性細胞数を求めた。

4.2.11

統計解析

IFN

γの投与効果の有意差検定は

one-way ANOVA

による分散分析の後、

Turkey

の多重比較検定によって行った。

4.3.

結果

4.3.1

細胞性免疫反応における

IFNγrel

の発現解析

IFNγrel

の機能解明のため、組織発現解析や刺激剤や細胞性免疫反応における

IFNγrel

の発現動態解析を行った。

正常個体において、

IFN

rel

が最も高く発現している臓器は脾臓であり、つづいて腸管、鰓であった。一方、IFNγは腸管、脾臓、末梢血リンパ球の順に高い発現を示した。（Fig. 4-1）

二本鎖

RNA

刺激後の

IFNγrel

の発現動態を調べるため、脾臓より白血球を回

収し、

Poly(I:C)

刺激後の遺伝子発現解析を行った。その結果、刺激後早期から

IFNγrel 2

の発現が上昇し、

IFNγrel 1

および

IFNγ

は

IFNγrel 2

に遅れて発現上昇が認められた（Fig. 4-2）。

細胞性免疫反応における

IFNγrel

の発現動態を調べるため、まず、

GVHR

誘導

に伴う

IFNγrel

の発現動態を解析した。第

1

章と同様な方法を用いて

GVHR

を

誘導し、移植後経時的にドナー由来

T

細胞をソーティングし、リアルタイム

PCR

法により

IFNγrel

および

IFNγ

の発現動態を調べた。その結果、GVHRの誘導に

伴い、

T

細胞における

IFNγrel

の発現上昇が観察された（Fig. 4-3）。また、

GVHD

の標的組織である腎臓において、

IFNγrel

および

IFNγ

を産生している

CD4T

細胞が認められた（

Fig. 4-4

）。

鱗移植実験時の発現動態を調べたところ、IFNγrel 1および

IFNγrel 2

は移植後

5

日目をピークとして発現が上昇した。IFNγ1も発現の上昇が認められたが、

IFNγrel

ほど発現は高くなかった（Fig. 4-5）。

次に、細胞内寄生菌である