71
4.4.
考察・結論IFNγrel 1
およびIFNγrel 2
はともにpoly(I:C)による in vitro
での刺激後に発現72
GVHR
誘導時、経時的にドナー由来T
細胞をソーティングし、その遺伝子発 現を解析したところ、IFNγrel 1およびIFNγrel 2
の遺伝子発現の高い時期と、ド ナー由来T
細胞が活発に増殖する時期が一致した。そして、組織学的な観察に おいてもGVHR
誘導に伴いIFNγrel
を産生するT
細胞の増加が認められた。ま た、移植3
日後より移植片上の黒色素胞の崩壊が認められる移植後5
日目にか けてIFNγrel 1
、IFNγrel 2
およびIFNγ1
の発現上昇が認められた。さらに、移植24
時間前にレシピエントにIFNγrel 1
を投与した場合には、移植片拒絶にかかる 時間が有意に短縮された。したがって、IFNγrelは細胞性免疫応答に関与してい ると考えられる。哺乳類において、
IFNγ
は血管内皮細胞における、エフェクター細胞の接着と 血管外遊走を促進するはたらきが知られている(Duijvestijn et al., 1986)
。また、ア ロ抗原移植(Hidalgo and Halloran, 2002)や純系―F1マウスのGVHD
モデル(Puliaev et al., 2004)において、IFNγ
がIL2
などのサイトカインと協調し、アロ反 応性のCTL
の分化を助けることが知られている。さらに、アロ抗原拒絶反応において、
IFNγ
がTAP1.2
やCIITA
など抗原プロセシングに関わる免疫プロテアソームの中心となる分子の発現を上昇・活性化させ、MHCクラス
I
やクラスII
分子の発現を増強させ、抗原の認識を促進させることが知られている(Sims et al.,1997; Spivey et al., 2011)。魚類においては、ニジマスで IFNγ
がMHC
クラスII
遺伝子の発現上昇を引き起こすこと(Zou et al., 2005)
やメダカにおいてアロ抗原 拒絶反応にMHC
クラスII
分子が関与することが報告されている（坂内ら、2011
年、第23
回日本比較免疫学会学術集会）。これらのことから、GVHRやアロ抗 原拒絶反応におけるIFNγ
およびIFNγrel
の発現上昇やIFNγrel 1
による拒絶促進73
効果を理解するには、エフェクター細胞の遊走数や局在の変化、細胞傷害活性 やサイトカイン産生能といった細胞の状態の変化に加え、標的細胞や抗原提示 細胞における
MHC
分子の発現の変化に着目する必要があると考えられる。フローサイトメトリー法による解析により、
CD4、 CD8
およびIgM
陽性細胞 の一部に、IFNγ1/2
、IFNγrel 1
およびIFNγrel 2
を産生する細胞が認められた。IgM
抗体陽性細胞の中には、表面免疫グロブリン（sIgM
）を細胞膜表面に発現するB
細胞と、IgMと結合するFc
受容体を発現するNK
細胞が含まれている。ギンブ ナにおいて、IgM陽性を示す細胞中に、非特異的細胞傷害活性を示す細胞集団 が存在し、NK
細胞と考えられている(Toda et al., 2009)
。一方、哺乳類において は、NK
細胞はIFNγ
の強力な産生細胞であることが知られている。従って、今 回認められたIFNγ
およびIFNγrel
を産生するIgM
陽性細胞は、NK
細胞である 可能性がある。魚類におけるNK
細胞の知見はまだ限られており(Fischer et al.2006, 2013; Shen et al., 2004)、本研究における知見が NK
細胞研究の足がかりと なることが期待される。IFNγrel
は、細胞内寄生細菌に対する感染防御反応、GVHR
、同種移植片拒絶反応など細胞性免疫が主要な役割を担う免疫反応において高い発現を示した。
また、IFNγrelは
T
細胞をはじめとしたリンパ球により産生され、細胞性免疫反 応に伴い産生細胞数、発現量ともに上昇することが明らかとなった。これらの ことから、IFNγrel
は細胞性免疫に関与することが示された。しかし、IFNγrel 1
は移植片拒絶反応の促進に関与し、IFNγrel 2
はpoly(I:C)による刺激や E.tarda
感 染に伴い発現が高まることから、IFNγrel 1とIFNγrel 2
の間においても細胞性免 疫における役割の違いが示唆された。また、第3
章においてIFNγrel 1
および74
IFNγrel 2
における標的細胞内における核内移行の違いや利用する転写因子STAT
の相違が示され、両リガンドは互いに異なる作用機序で機能を示すことが明ら かとなっている。
以上より、IFNγrelは魚類細胞性免疫において、互いに異なる経路を利用し、
異なった機能を示すサイトカインであると考えられる（
Fig. 4-10
）。75
Table 4 – 1. Oligonucleotide primer sequences.
Primer name Sequence(5’→3’) Use
EF1-α/F ACCCCAAGGCTCTCAAATCT Expression analysis
EF1-α/R TCAACGCTCTTGATGACACC Expression analysis
IFNgrel1/F AGGAGGCCCAGAGTGGTTTG Expression analysis
IFNgrel1/R CAAGTGCAGGAAGGCTTGGA Expression analysis
IFNgrel2/F CCCAAAAGGACAAAGAGCAA Expression analysis
IFNgrel2/R AGCTGATGCAGATGAGAAGACA Expression analysis
IFNg1/F TGGGCGATCAAGGAAGATG Expression analysis
IFNg1/R ACTTCAGATTTTTGGTGTTTTTGG Expression analysis
IFNg2/F GTCCCTGAGAACCTGGACAA Expression analysis
IFNg2/R GTGCCAGCCTTTCTTTGGTA Expression analysis
76
Fig. 4-1. Tissue distribution of four isoforms of ginbuna IFN
γ
in untreated ginbuna crucian carp.Total RNA from various tissues was reverse-transcribed and amplified with specific primers for ginbuna crucian carp ifngrel 1, ifngrel 2, ifng1, ifng2, and ef1a (shown in Table 1). Expression levels were normalized to those of the ef1a gene.
77
Fig. 4-2 Expression of ifngrel 1 and ifngrel 2, along with ifng1 and ifng2, expression levels in poly(I:C)-stimulated splenocytes were determined by real-time RT-PCR. The expression levels were normalized to those of the ef1a gene and quantification values were calculated relative to the expression at 0 h after poly(I:C) stimulation.
78
Fig. 4-3 Expression of interferon gammas mRNA in donor derived CD4+ or CD8+ T cells from GVHR induced recipient. ifng1, ifng2, ifngrel 1 and ifngrel 2 expression levels in donor derived CD4 or CD8 T cells were determined by real-time RT-PCR. The expression levels were
normalized to those of the ef1a gene and quantification values were calculated relative to the expression in non-sensitized donor T cells.
79 Fig. 4-4 Histological analysis of interferon gamma producing cells in trunk kidney. Trunk kidney from recipient S4N at 14 days after the transplantation were prepared and immunologically stained. Each antigen was visualized as follows: green – CD4, magenta – CD8, red – (A) IFNγ, (B) IFNγrel 1, or (C) IFNγrel 2, blue – nucleic acid. Arrows indicate interferon producing CD4 + T cells. Arrow heads indicate interferon producing CD8 + T cells.
80
Fig. 4-5 Expression of interferon gamma mRNA during the course of allogeneic scale graft rejection. ifngrel 1 and ifngrel 2, along with ifng1, expression levels were determined by real-time RT-PCR. The expression levels were normalized to those of the ef1a gene.
81
Fig. 4-6 Expression of interferon gamma mRNA after E. tarda infection. ifng1, ifngrel 1 and ifngrel 2 expression levels in tissues were determined by real-time RT-PCR. The expression levels were normalized to those of the ef1a gene and quantification values were calculated relative to the expression in non-sensitized donor T cells.
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Fig. 4-7 Effect of administration of interferon gamma on scale graft rejection. Recipient fish were administrated 0.1 μg/ g of recombinant IFNγ2, IFNγrel 1, IFNγrel 2, or PBS at 24 hours before transplantation of allogeneic scales. Time to collapse of melanophore was measured and plotted. Asterisks indicate statistical significance (p < 0.05) using one-way ANOVA and succeeding Tukey’s multiple comparison test.
83
Fig. 4-8 Expression of interferon gamma mRNA in PMA and ionomycin-stimulated kidney lymphocyte. ifngrel 1 and ifngrel 2, along with ifng1 and ifng2, expression levels were determined by real-time RT-PCR. The expression levels were normalized to those of the ef1a gene and quantification values were calculated relative to the expression in non-stimulated cells.
84
Fig. 4-9 Detection of IFNγ- and IFNγrel-producing cells. After the PMA and ionomycin stimulation, cells were fixed, permeabilized and then labeled with antibodies against each lymphocyte subset and interferon gammas. Positive cells were gated according to control samples.
85
Fig. 4-10 Diagram of the ginbuna crucian carp IFNγrel 1 and IFNγrel 2 signaling
pathways.
86