Con
tr ol + AM D3100
SD F1 0. 1 n g/ m l
SD F1 0. 1 n g/ m l + A M D3100
SD F1 1 ng/ m l
SD F1 1 ng/ m l + A M D3100
SD F1 10 ng/ m l
SD F1 10 ng/ m l + A M D3100
（cells/ml）
＊＊ ＊＊ ＊＊
N o. of s pe rm in U ppe r c ha m be r
57
図4．ケモタキシススライドを用いたSDF1濃度勾配下における精子のふるまいの観察結果
（A）本実験に用いたケモタキシススライドの写真とSDF1濃度勾配が存在する観察エリアの 拡大写真
（B）SDF1濃度勾配下での精子運動の一例、Yellow arrowhead: 非対称的な鞭毛の屈曲
（C）高濃度方向（Right）または低濃度方向（Left）へ遊走した精子におけるターン運動率の 比較、Student’s t-test, mean ± S.E. n = 3.
A
B
No gradient
SDF1 gradient
SDF1 concentration gradient
Observation Area L
E F T
R I G H T
Turn movement rate（%）
0 10 20 30 40
■ Left
□ Right
C
0s 1s 2s 3s
4s 5s 6s 7s
58
図5. カルシウムチャネルによる精子内カルシウムイオン濃度調節とSDF1による精子走化性 の関連解析の結果
（A）SDF1濃度勾配の有無による精子の細胞内カルシウムイオン濃度の比較（コントロール の値を１としたときの相対値）、Student’s t-test, mean ± S.E. *p < 0.05 vs Control. n = 6.
（B）CatSperチャネル阻害剤であるNNC添加によるSDF1の精子走化性への影響、Student’s t-test, mean ± S.E. *p < 0.05 vs Control. n = 4.
A B
0 0.5 1 1.5 2
Relative fluorescence intensity
0 100000 200000 300000 400000
No. of sperm in Upper chamber
（cells/ml） ＊
SDF1 + NNC
＊
Control
SDF1
SDF1
59
図6. CXCR4阻害剤であるAMD3100添加による精子のCOCまでの遊走への影響解析の結果
（A）本実験で用いた12ウェルディッシュ（縦３ウェル×横４ウェル）の写真
（B）COCならびに精子の配置位置を示した図
（C）無処理精子（Control）もしくはAMD3100処理精子における共培養３時間後のCOCを 配置したウェルならびに反対側の対称的な位置にある空のウェルの観察例、Yellow arrowheads: 精子の凝集像, Black arrowheads: COC, Bars = 500 µm.
（D）共培養３時間後のCOCを配置したウェルならびに反対側の対称的な位置にある空の ウェルに存在していた精子数の比較、Tukey-Kramer test, mean ± S.E. Control: n = 26, AMD3100: n = 16, Different letters indicate a significant difference (p<0.05).
A
C
D
□COC-containing well
■Empty well COC-containing well
Empty well
Sperm-added well
Sperm-added well
COC-containing wellEmpty wellNo. of sperm
B
Control AMD3100
100 2030 4050
6070
a
b b
b
60
図7. ウシ精子におけるNTR発現解析ならびに雌性生殖器におけるNT発現解析の結果
（A）RT-PCRによる精巣、卵母細胞、卵丘細胞におけるNTRの発現
（B）ウエスタンブロッティングによるウシ精子におけるNTR1の発現
（C）免疫組織化学による精子におけるNTR1の局在、Green: NTR1, Blue: Hoechst 33342, Bars = 10 µm.
（D）ウエスタンブロッティングによるウシ精子におけるNTR2の発現
（E）免疫組織化学による精子におけるNTR2の局在、Green: NTR2, Blue: Hoechst 33342, Bars = 10 µm.
（F）ウエスタンブロッティングによる子宮および卵管におけるNTの発現 NTR2
Oocytes Cumulus cells Testis
NTR1
β-actin
A
B
KDa 129
9170 54 42 33 28
16
D
B C
E
Uterus Oviductβ-actin KDa
15
43 KDa
128 254
92 71 55
43
34
F
61
図8. NT添加によるウシ精子の受精能への影響解析の結果
（A）ウエスタンブロッティングによる精子中のチロシンのリン酸化量の定量の一例
（B）NT添加の有無による精子中のチロシンのリン酸化量の比較、Tukey-Kramer test, mean
± S.E. *p < 0.05, **p < 0.01 vs Control. n = 6.
（C）PNAを用いたレクチン組織化学によりウシ精子先体を可視化した観察例、Green: PNA (sperm acrosome), Blue: Hoechst 33342, Bar = 20 µm.
（D）NT添加の有無による精子の先体喪失率の比較、Tukey-Kramer test, mean ± S.E. *p <
0.05, **p < 0.01 vs Control. n = 4.
α-tubulin
KDa
Control 0.1µM 1µM 10µM 129 91 70 54 42 33 28
54
Protein tyrosine phosphorylation
NT 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Control 0.1µM 1µM 10µM
NT
A B
0 10 20 30 40 50
Control 0.1µM 1µM 10µM 100µM NT
Spermacrosomal disappearancerates(%)Relative intensities
D C
＊ ＊＊
＊＊
＊＊ ＊＊
＊
62
図9. 体外受精時のNT添加による胚盤胞細胞数への影響解析の結果
（A）体外受精時から８日目のコントロール区の胚盤胞の画像例、Red: Propidium iodide (TE), Blue: Hoechst 33342 (ICM), Bar = 50 µm.
（B）体外受精時から８日目のNT添加区の胚盤胞の画像例、Red: Propidium iodide (TE), Blue:
Hoechst 33342 (ICM), Bar = 50 µm.
（C）体外受精時から８日目のICM細胞数、TE細胞数、総細胞数の比較、Student’s t-test, mean ± S.E. *p < 0.05 vs Control. Control: n = 11, NT: n = 14.
A B
C
0 20 40 60 80 100 120 140 160