図
図 1 6 E s r 41 部分欠失変異体の予想二次構造 部分欠失変異体の予想二次構造
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各
各 E s r 4 1 部分欠失変異体の二次構造を 部分欠失変異体の二次構造を m f o ld (Z u k e r , 2 0 0 3 ) を用いて解析した。斜体太 を用いて解析した。斜体太 字は
字は Rh o 非依存性ターミネータ一の 非依存性ターミネータ一の 5 ' 側直上流のステムループ構造（ 側直上流のステムループ構造（ s t em -2 ) を示す。 を示す。
_______stem-1 stem-2 Rho-independent terminator________
________ 10__________ 20 30 40 50 60 70
5GAUGC\JCUhGGCh\JCACAUlJUUCUCCAlJGGGGlJA\JUCCClJCCGCCGGCAdUAUGUGUUGCUGGCGUUUUUUUAU-3'
fiase-paring sice Hfq-binding sice Hfq-binding sice for ler mRNA ?
図
図 1 7 E s r4 1 の予想される各機能領域 の予想される各機能領域
3
. 考 察 Hfq
Hfq
依 存 性 のsRNA sRNA
は 、 標 的mRNA mRNA
と の 塩 基 対 形 成 領 域 、Hfq Hfq
結 合 領 域 、Rho Rho
非 依 存 性 タ ー ミ ネ ー タ 一 領 域 の 少 な く と も3 3
つ の 機 能 的 な 要 素 を 有 し て い る 。 標 的mRNA mRNA
と 部 分 的 な 相 補 性 を 持 つ 塩 基 対 形 成 領 域 は 、 多 く のsRNA sRNA
で 明 確 に さ れ て お り 、 こ の 領 域 で 形 成 さ れ る 塩 基 対 形 成 を 介 し て 標 的mRNA mRNA
の 翻 訳 や 安 定 性 を 制 御 す る 。 ま た 、GC-rich GC-rich
な 回 文 配 列 の 直 後 に ポ リU U
配 列 が 続 くRho
Rho
非 依 存 性 タ ー ミ ネ ー タ 一 の 役 割 も 明 確 に さ れ て い る 。sRNA sRNA
に 限 ら ず 、 多く のRNA RNA
の3, 3,
末 端 に 位 置 す るRho Rho
非 依 存 性 タ ー ミ ネ ー タ 一 の 第 一 義 的 な 役 割 は 、 転 写 を 終 結 さ せ る こ と で あ る 。 ま た 、 タ ー ミ ネ ー タ 一 の 一 部 で あ る ス テ ム 構 造は 、 転 写 後 の
RNA RNA
を3 3
,エ キ ソ リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ に よ る 分 解 か ら 保 護 す る と い う 一 般 的 な 役 割 を 持 つAbe Abe （ （ and and Aiba Aiba
，1996; 1996; Aiba Aiba etal. etal.
，1991) 1991)
。 一 方 で、sRNA 、sRNA
のHfq
Hfq
結 合 領 域 は 不 明 な 点 が 多!/ !/
ヽ。 こ れ ま で に フ ッ ト プ リ ン ト 法 な ど のin vitroの解 析 か ら
OxyS (Zhang OxyS (Zhang et et al., al., 2002) 2002)
や 、Spot42 (Meller Spot42 (Meller et et al., 2002b)、 al., 2002b)、 DsrA (Brescia DsrA (Brescia etal” 2003)、RyhB (Geissmann and Touati, 2004)、RybB (Balbontfn et al., 2010) etal” 2003)、RyhB (Geissmann and Touati, 2004)、RybB (Balbontfn et al., 2010)
な ど の い く つ か の
sRNA sRNA
に お い てHfq Hfq
結 合 領 域 が 同 定 さ れ た 。 こ れ ら のHfq Hfq
結 合 領 域 はsRNA sRNA
の 内 部 の ス テ ム ル ー プ 構 造 の 近 傍 に 存 在 す る 一 本 鎖A U A U
リ ッ チ 配 列 で あ る 。 し か し な が ら 、RyhB RyhB
に お い て 、 フ ッ ト プ リ ン ト 法 か ら 同 定 さ れ たHfq
Hfq
結 合 領 域 を 変 異 さ せ て も、invivoで のRNA RNA
量 と 標 的mRNA mRNA
抑 制 機 能 に 影 響 が な か つ たGeissmann and Touati, 2004; Hao et al.,2011) Geissmann and Touati, 2004; Hao et al.,2011) （ （
。 こ の こ と は、in vitroで 同 定 さ れ た
Hfq Hfq
結 合 領 域 の 中 に、in vivoで のsRNA sRNA
機 能 と は 相 関 し な い 領 域 が 含 ま れ る 可 能 性 を 示 唆 す る 。 こ れ は 、 こ れ ま で のsRNA sRNA
のHfq Hfq
結 合 領 域 に 関 す る 複 数 の 報 告 に 共 通 す る 課 題 で あ る 。 こ れ ら の こ と を 踏 ま え 本 研 究 で は、m 、m
54
vivoと、invitroの 実 験 を 組 み 合 わ せ る こ と で 、
Hfq Hfq
に よ るEsr41 Esr41
の 安 定 化 に 重 要 な 領 域 や 配 列 、 構 造 的 な 特 徴 の 解 明 を 目 指 し た 。野 生 株 と hfq欠 損 株 に お け る
Esr41 Esr41
部 分 欠 失 体 のRNA RNA
量 を 解 析 し た 結 果 、11-15 11-15
塩 基 領 域 欠 失 体 で は 、 野 生 型Esr41 Esr41
と 比 べRNA RNA
量 の 減 少 が 見 ら れ る と と も に 、 野 生 株 と hfq欠 損 株 で のRNA RNA
量 が 同 程 度 で あ っ た （図15A 15A
) 。 ま た11-15
11-15
塩 基 領 域 欠 失 体 はHfq Hfq
と の 結 合 能 が 低 下 し て い た （図15B 15B
) 。 こ れ ら の 結 果 は 、 野 生 株 とhfq欠 損 株 で のRNA RNA
量 を 解 析 す る こ と で 、 そ のRNA RNA
のHfq Hfq
結 合 能 を 角P P
析 可 能 で あ る こ と を 示 唆 す る 。 一 方 で 、31-35 31-35
塩 基 領 域 欠 失 体 で は 、 野 生 株 と 欠 損 株 間 でRNA RNA
量 に 差 が 見 ら れ た に も 関 わ ら ず 、Hfq Hfq
結 合 能 の 低 下 が 見 ら れ た 。 こ の こ と は 、 野 生 株 と ；^ ^
欠 損 株 で のRNA RNA
量 の 解 析 に よ る 、 そ のRNA RNA
のHfq Hfq
結 合 能 解 析 は 、 定 性 的 な 評 価 し か で き な い こ と を 示 す 。 ま た11- 11-15
15
塩 基 領 域 欠 失 体 よ り も31-35 31-35
塩 基 領 域 欠 失 体 の 方 が 、 野 生 株 に お け るRNA RNA
量 が 増 加 し て お り、w 、w vzTro vzTro
に お け るHfq Hfq
と の 結 合 能 も 高 か っ た （図15B 15B
) 。 こ の 結 果 は 、Hfq Hfq
結 合 能 の 高 さ とRNA RNA
の 安 定 性 に 相 関 が あ る こ と を 示 唆 す る 。本 研 究 の 結 果 、
Esr41 Esr41
のstem-2 stem-2
構 造 がHfq Hfq
と の 結 合 に 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。し か し 、stem-2 stem-2
の 構 造 を 維 持 す る よ う に 変 異 を 導 入 し たEsr41-stou2 Esr41-stou2
も
RNA RNA
の 安 定 性 が 低 下 し た （図12) 12)
こ と か ら 、stem-2 stem-2
の 構 造 だ け がHfq Hfq
に よ るEsr41
Esr41
の 安 定 化 に 重 要 な の で は な く 、 他 に 必 要 な 要 素 が 存 在 す る 可 能 性 が 高 い 。 そ の 必 要 な 要 素 の 一 つ と し て 挙 げ ら れ る の が 、 第2 2
章 の 考 察 で 述 べ たstem-2 stem-2
の ル ー プ 領 域 の5 5
，-UAUU-3, -UAUU-3,
配 列 で あ る 。 こ の 予 想 と 、 先 に 述 べ た 「sRNA sRNA
の 内 部 の ス テ ム ル ー プ 構 造 の 近 傍 に 存 在 す る 一 本 鎖A U A U
リ ッ チ 配 列 がHfq Hfq
結 合 領 域 に な る 」 と い う 報 告 は 合 致 す る 。 こ れ を 検 証 す る た め 、 ゲ ル シ フ ト 法 を 用 い た55
Esr41-stmu2
Esr41-stmu2
や 、 ル ー プ 領 域 の5 5
，-UAUU-3, -UAUU-3,
配 列 に 変 異 を 導 入 し た 変 異 体 のHfq Hfq
結 合 能 のinvitro解 析 、 ま たEsr41 Esr41
変 異 体 とHfq Hfq
の invivoに お け る 結 合 能 を 解 析 す る た め 、Hfq Hfq
の 免 疫 沈 降 法 を 用 い て 解 析 し た い 。こ こ ま で の 解 析 の 結 果 、
Esr41 Esr41
の 各 機 能 領 域 を 部 分 的 に 明 ら か に で き た(
(
図17) 17)
。stem-1 stem-1
の 構 造 の 重 要 性 は ま だ 明 確 に は 見 出 せ て い な い が 、5 5
,末 端 に 位 置 す る こ と 、stem-1 stem-1
が 短 く な る こ と が 予 想 さ れ る6 6 -10 -10
塩 基 領 域 のEsr41 Esr41
部 分 欠 失 体 （図16) 16)
は 、野 生 型Esr41 Esr41
と 比 べ てRNA RNA
量 の 減 少 が 見 ら れ る こ と （図16) 16)
か ら 、5, 5,
ェ キ ソ リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ か ら の 分 解 を 防 い で い る 可 能 性 が あ る 。 こ の 点 に つ い て 理 解 を よ り 深 め る こ と で 、Esr41 Esr41
全 体 の 機 能 領 域 を 解 明 し た い 。56