に示す。

本研究では、腸管出血性大腸菌

0157:H7 Sakai

^{株の野生株として}

SKI-5142 (Iyodaand Watamabe, 2005)

^{を、非病原性大腸菌}

K-12

^{株の野生株とし}

て

MG16554/acZ

^株

Sud（o etal.

^，

2014)

を用いた。本研究で用いた

MG16554/acZ

株の親株である

MG1655 (CGSC#6300)

^株は、抑

Z>C

の転写制御領域にトランスポゾンの揷入がない株である

B（arkeret al., 2004

^)。

K-12

^{株の}

A/g

^{欠損株である}

NS1201

株は以下のように構築した。

TM587

株の染色体上の、

hfq

^遺伝子を

FRT-c

^如遺伝子

-FRT

カセットで置換した領域を、

トランスダクシヨンにより

MG1655

株染色体に移すことで、

NS1201

^株を得

た。物遺伝子の欠失の確認は、物欠損株の表現型である生育遅延を確認することで行った。

NS1202

^株は、

pCP20

^を用いた

FRT

の部位特異的組換えにより

NS1201

^株から

ポ遺伝子を除去することで得た。

故遺伝子除去の確認は、株のクロラムフエ

ニコールへの感受性観察に

より

行った。

桃

^遺伝子と

/acZ

遺伝子の二重欠損株である

NS1203

^{株は以下のように}

構築した。

MG16554/acZ

株の染色体上の、かば遺伝子を

^{如遺伝子で置換した}

領域を、

トランスダクシヨンにより

NS1202

株染色体に移すことで、

NS1203

株を得た。

/acZ

遺伝子の欠失の確認は、

^ブロモ

-4

^-クロ ^ロ

-3-

^{インドリル}

-p-D

^-ガ

ラクトピラノシド（

X-gal)

^{を含む}

寒天培地を用いた呈色反応の有無の観察により行った。

7 9

flhD

^遺伝子と

/acZ

遺伝子の二重欠損株である

NS1211

^{株は以下のよう}

に構築した。

JW1881

^{株の染色体上の、}

flhD

^遺伝子を

FRT-fem

^遺伝子

-FRT

^力セ

ットで置換した領域を、

トランスダクシヨンにより

MG1655d/acZ

^{株染色体に}

移すことで、

NS1211

^{株を得た。}

flhD

遺伝子の欠失の確認は、

flhD

^{欠損株の表現}

型である遊走性の低下を確認することで行った。

NS1212

^株は、

pCP20

^を用いた

FRT

の部位特異的組換えにより

NS1211

^株から

fern

遺伝子を除去することで得た。

遺伝子除去の確認は、株のカナマイシンへの感受性観察により行った。

^{プラスミド}

本研究で用いたプラスミド、及びオリゴヌクレオチドをそれぞれ表

^、

表

^に示す。

E s r41 ^{、及び} E sr41 変異体発現プラスミドの構築

pRS-Esr41

^はび

^{の予想される転写制御}

^領域^{、财} esr41

^の

^コード

^領

域（

Esr41

^の

^末端を

^{とした場合の}

-483

^から

+114)

^を含む

DNA

^が

pRS414

^に

クローニン

グされた

pBR

^{タイプのプラス}

^ミドで

^{ある（}

Sudoetal.,2014

^)。

pRS-Esr41stmul

^{、及び}

pRS-Esr41stmu2

は以下のように構築した。

#41-Rev-stem-mul

^、

#41-Fwd-16nt

^の

^{末端リン酸化プライマ}

—t

^{ット、及び}

#41-Rev-stem-mu2

^、

#41-Fwd-42nt

^の

末端リン酸化プライマーセットを用いて、

pRS-Esr41

^{プラスミド}

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

RS-Esr41stmul

^{断片、及び}

RS-Esr41stmu2

^{断片を増幅させた。各}

DNA

断片を分子内ライゲーシヨン反応に

より連結させ、この構築プラスミドを五

coRI

で処理、精製することで、

Esr41stmul

断片、及び

Esr41stmu2

^{断片を得た。この}

DNA

^断片と

EcoRl

^{で処理した}

pRS414

をフイゲーシヨン反応により連結させることで

pRS-Esr41stmul

^{、及び}

pRS-Esr41stmu2

^を得た。

pRS-Esr41-28Hbm

^{、及び}

pRS-Esr41-41Hbm

は以下のように構築した。

互いの

3’

^{末端が対合する}

5-SgrSmodule

^、

BamHI-3-SgrSmodule

^{のプライマーセッ}

トを用いた

PCR

^{により}

Hfq-binding module

^{断片を得た。次に、}

EcoRI-5-#41

^、

3-SgrSmodule-#41-28bp

のプライマーセット、または

EcoRI-5-#41

^、

3-SgrSmodule-#41-41bp

のプライマーセットを用いて、

pRS-Esr41

^{を鋳型にした}

PCR

^により

Esr41-28bp

^{断片、及び}

Esr41-41bp

^{断片を得た。}

EcoRI-5-#41

^、

BamHI-3-SgrSmodule

^{のプライマ}

^一

'"I?

^{ットを用いて、}

Hfq-binding module

^断片、及

び

Esr41-28bp

^{断片を鋳型にした}

PCR

^{により、これら}

^{つの断片を連結させ}

Esr41-28Hbm

^{断片を得た。同様の}

PCR

^により、

Hfq-binding module

^{断片、及び}

Esr41-41bp

^{断片を連結させ}

Esr41-41Hbm

^{断片を得た。}

EcoRl

^{、及び如}

/wHI

^で処

理した

Esr41-28Hbm

^{断片、または}

Esr41-41Hbm

^断片と

£coRI

^、及び

5awHI

^で処

理した

pRS414

をライゲーシヨン反応により連結させることで

pRS-Esr41-28Hbm

^、

及び

pRS-Esr41-41Hbm

^を得た。

各

Esr41

部分欠失体発現プラスミド（

pRS-Esr4146-10

^、

pRS-Esr41411-15

^、

pRS-Esr41416-20

^、

pRS-Esr41421-25

^、

pRS-Esr41426-30

^、

pRS-Esr41431-35

^、

pRS-Esr41436-41)

は以下のように構築した。各

,末端リン酸化プライマーセッ

ト（

pRS-Esr4146-10: #41-Rev-5nt, #41-Fwd-llnt; pRS-Esr4Mll-15: #41-Rev-10nt,

#41-Fwd-16nt; pRS-Esr4M16-20: #41-Rev-15nt, #41-Fwd-21nt; pRS-Esr41421-25:

#41-Rev-20nt, #41-5p-25; pRS-Esr41426-30: #41-Rev-25nt, #41-Fwd-31nt; pRS-Esr41A31-35: #41-Rev-30nt, #41-Fwd-36nt; pRS-Esr41436-41: #41-Rev-35nt,

8 1

#41-Fwd-42nt)

^{を用いて、}

pRS-Esr41

^{プラスミド}

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

各

DNA

断片を増幅させ、その

DNA

断片を分子内ライゲーシヨン反応により連結させ、この構築プラスミドを

£CoRl

で処理、精製することで、各

Esr41

^部分欠

失体

DNA

^{断片を得た。この}

DNA

^断片と

EcoRl

^{で処理した}

pRS414

^{をライゲー}

シヨン反応により連結させることで各

Esr41

部分欠失体発現プラスミド

(pRS-Esr4146-10

^、

pRS-Esr41411-15

^、

pRS-Esr41416-20, pRS-Esr41421-25 N pRS-Esr41426-30

^、

pRS-Esr4M31-35

^、

pRS-Esr41436-41)

^を得た。

融合遺伝子発現プラスミドの構築

pMW-'lacZter

^{、及び}

pMWbla-'lacZter

は以下のように構築した。

MfeI-pRSter4-5p、lacZ seq

のプライマーセット、及び

SphI-5'pRS

^、

HindIII-ter-3’-pRS

のプライマーセットを用いて、

pRS414

^{プラスミド}

DNA

^を鋳

型にした

PCR

^{により、大腸菌}

rrnB

オペロンの転写ターミネーター配列が

^コピ

一タンデムに連結した

ter4

^{断片、及び}

配列と開始コドンを持たない

/flCZ

^と、

その

^'端に

crp

の転写ターミネータ一配列を持つ

'lacZter

^{断片を増幅させた。}

Mfel^、

及び

EcoRI

^{で処理した}

ter4

^断片と

EcoRl

^{で処理した}

pMW218

^{をライゲーシヨン}

反応により連結させて、構築されたプラスミ

^ト'^を Sphl

^と

///wdlll

^{で処理した。こ}

の

DNA

^断片と

Sphl

^と

Hindlll

^{で処理した}

'lacZter

断片をライゲーシヨン反応により連結させることで

pMW-'lacZter

^を得た。

MfeI-5-bla

^{、及び}

EcoRI-3-bla

^のプ

ライマーセットを用いて、

pBR322

^{プラスミド}

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

bla

プロモーター断片を増幅した。

Ecom

^{で処理した}

pMW-'lacZter

^と

Mfe^{\ 、}

^及び

£coRI

^{で処理した}

プロモーター断片をライゲーシヨン反応により連結させる

ことで

pMWbla-'lacZter

^を得た。

pMW-lacZter

は以下のように構築した。

MfeI-pRSter4-5p

^、

HindIII-ter-3

^，

-pRS

のプライマーセツトを用いて、

pRS415

^{プラスミド}

DNA

^を鋳

型にした

PCR

^により

配列と開始コドンを含む

lacZ

^{と、その}

^{端に}

crp

^の転

写ターミネータ一配列を持つ

lacZter

^{断片を増幅させた。}

Mfel

^{、及び}

i//«dIII

^で処

理した

lacZter

^断片と

Ecom

^{、及び}

///ndlll

^{で処理した}

pMW218

^{をライゲーシヨ}

ン反応により連結させることで、

pMW-lacZter

^を得た。

pMW-pchA19aa

^、及び

pMW-ler

は以下のように構築した

p。chA 5, EcoRI

^、

SphI-3-pchA19aa

のプライマーセツトを用いて、

SKI-5142

^{から抽出したゲノム}

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

pchA

^{の転写制御領域と}

pchA

^の

^{末端}

^アミノ

酸のコード領域を含む

pChA19aa

^{断片を増幅した。}

EcoRl

^{、及び}

Sphl

^{で処理した}

pchA19aa

^{断片、及び}

pMW-'lacZter

をライゲーシヨン反応により連結させること

で

pMW-pchA19aa

^を得た。

EcoRI-5-ler-p4

^、

SalI-3'-ler

のプライマーセツトを用いて、

SKI-5142

^{から抽出したゲノム}

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

ler

^{の開始コド}

ンに近い方のプロモーターと

ler

^の

^{末端}

アミノ酸のコード領域を含む

ler

断片を増幅した。

EcoRI

^、及びぬ

^{！で処理した}

ler

^{断片、及び}

pMW-'lacZter

^をラ

イゲーシヨン反応により連結させることで

pMW-ler

^を得た。

pMWbla-pchA19aaN

^{及び}

pMWbla-lerdl

は以下のように構築した。

EcoRI-5-pchA-p2^、SphI-3-pchA19aa

のプライマー

セツ

トを

用いて、SKI-5142

から抽出したゲノム

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

pchA

^の

^{プロモーターを}

^含まず、

ァ

の

^{末端}

アミノ酸のコード領域を含む

pchAAp

^{断片を増幅した。}

^五coRI^、

RXI Sphl

^{で処理した}

pchAAp

^{断片、及び}

pMWbla-'lacZter

^{をライゲーション反応}

により連結させることで

pMWbla-pchA19aa

^を得た。

EcoRI-5-ler-p4

^、

SalI-3'-ler

のプライマーセツトを用いて、

SKI-5142

^{から抽出したゲノム}

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

/er

^の

^{プロモーターを}

^含まず、

/er

^の

^{末端}

^{アミノ酸の}

^{コー}

^ド領域

を含む

lerAp

^{断片を増幅した。及}

oRI

^{、及び}

Sail

^{で処理した}

lerAp

^断片と

EcoRI

^、

及び

Sail

^{で処理した}

pMWbla-'lacZter

をライゲーシヨン反応により連結させることで

pMWbla-lerdl^を

^得た。

pMWbla-lershort

^{、及び}

pMWbla-ler 4149-155

は以下のように構築した。

EcoRI-5-ler-p4

^、

ler-SalI-174-3p

^{のプライマー}

^{セツ}

^ト、及び

EcoRI-5-ler-dl49-155

^、

SalI-³¹-ler

のプライマーセツトを用いて、

SKI-5142

^{から抽出したゲノム}

DNA

^を

鋳型にした

PCR

^により

/er^{のプロモーターを}

^{含まず、/ぴ}

^の

^{開始コドンまでを含}

む

lershort

^{断片、及び}

/er^{のプロモーターを}

^含まず

、/er^の 149-155

^{領域を欠失し}

た

ler<4149-155

^{断片を増幅した。}

EcoRl

、及びで処理した

ler short

^断片、ま

たは

ler4149-155

^断片と五

coRI

^{、及びぬ}

^{！で処理した}

pMWbla-'lacZter

^をライゲ

一シヨン反応により連結させることで

pMWbla-ler short

^{、及び}

pMWbla-ler 4149-155^を

^得た。

pMWbla-ler-fesr41

は以下のように構築した。

bla-ler 160-Rev

^、

#41-17-26 fusion ler 171-Fwd

^の

5’

末端リン酸化プライマーセツトを用いて、

pMWbla-lerdl

プラスミド

DNA

^{を鋳型にした}

PCR

^により

MW-ler-fesr41

^{断片を増幅させた。}

MW-ler-fesr41

断片を分子内ライゲーシヨン反応により連結させ、この構築ブラスミドを五

coRI

^{、及び}

&/I

で処理、精製することで、

ler-fesr41

^{断片を得た。こ}

の

DNA

^断片と

EcoEl

^{、及び}

Sail

^{で処理した}

pMWbla-'lacZter

^{をライゲーシヨン}

反応により連結させることで

pMWbla-ler-fesr41

^を得た。

pMW-pflhDC-lacZは以下のように構築した。EcoRI-FlhDC-Fwd^、 BamHI-5-flhDC-proのプライマーセッ卜を用いて、SKI-5142^{から抽出したゲノム} DNA^{を鋳型にした}PCR^によりflhDCの転写制御領域のみを含むPflhDC^断片を

増幅した。£coRl^、及びで処理した PflhDC^とpMW-lacZter^{をライゲーシ}

ヨン反応により連結させることでpMW-pflhDC-lacZ^を得た。

FlhDC発現プラスミド

pTWV-flhDCは以下のように構築した。 EcoRI-FlhDC-Fwd^、 BamHI-FlhDC-Revのプライマーセットを用いて、SKI-5142^{から抽出したゲノム} DNAを铸型にしたPCR^によりflhDCの転写制御領域、及びコード領域を含む

flhDC^{断片を増幅した。}£coRI、及びで処理した flhDC^{断片と}pTWV228

をライゲーシヨン反応により連結させることでpTWV-flhDC^を得た。

pMW-flhDC ftillは以下のように構築した。pTWV-flhDC^を£coRI^、及び

Sailで処理、精製することで、EcoRI-flhDC-Sall^{断片を得た。}EcoRI-flhDC-Sall

断片とEcoRl^{、及び} Sail^{で処理した}pMW219をライゲーシヨン反応により連結させることでpMW-flhDCfull^を得た。

pMW-flhDC/11は以下のように構築した。 EcoRI-FlhDC-Fwd^、 flhD-107rev-add150のプライマーセット、及び BamHI-FlhDC-Rev^、flhD-150Fwd

のプライマーセットを用いて、SKI-5142^{から抽出したゲノム}DNA^{を鋳型にした} PCR{^こよりflhD-5UTR^{断片、及び}flhDC ORF^{断片を得た。次に、}EcoRI-FlhDC-Fwd^、 BamHI-FlhDC-Revのプライマーセッ卜を用いて、flhD-5UTR^{断片、及び}flhDC ORF^{断片を鋳型にした}PCR^{により、これら}2^{つの断片を連結させ}flhDCdl^断片

8 5

ドキュメント内立教大学立教大学大学院大学院 •13.12,11 2013 Small Regulatory RNA Esr41 0157:H7 Sakai (ページ 83-96)

本 研 究 で は 、腸 管 出 血 性 大 腸 菌

株の野生株として

を、非病原性大腸菌

株の野生株とし

て

株

，

を用いた。本研究で用いた

株の親株である

株は、抑

の転写制御領域にトランス ポゾンの揷入がない株である

)。

株 の

欠損株である

株は以下のように構築した。

株の染色体上の、

遺伝子を

如遺伝子

カセットで置換した領域を、

トランスダクシヨンにより

株染色体に移すことで、

株を得

た。物遺伝子の欠失の確認は、物欠損株の表現型である生育遅延を確認する ことで行った。

株は、

を用いた

の部位特異的組換えにより

株から

ポ遺伝子を除去することで得た。

故遺伝子除去の確認は、株の クロラムフエ

より

桃

遺伝子と

遺伝子の二重欠損株である

株は以下のように

構築した。

株の染色体上の、かば遺伝子を

如遺伝子で置換した

領域を、

トランスダクシヨンにより

株染色体に移すことで、

株を得た。

遺伝子の欠失の確認は、

ブロモ

-クロ ロ

インドリル

-ガ

ラクトピラノシド（

を 含 む

寒天培地を用いた呈色反応の有無の観察 により行った。

7 9

遺伝子と

遺伝子の二重欠損株である

株は以下のよう

に構築した。

株の染色体上の、

遺伝子を

遺伝子

力セ

ットで置換した領域を、

トランスダクシヨンにより

株染色体に

移すことで、

株を得た。

遺伝子の欠失の確認は、

欠損株の表現

型である遊走性の低下を確認することで行った。

株は、

を用いた

の部位特異的組換えにより

株から

遺伝子を除去することで得た。

遺伝子除去の確認は、株のカナマイシンへの感受性観察により行った。

プラスミド

本研究で用いたプラスミド、及びオリゴヌクレオチドをそれぞれ表

、

表

に示す。

E s r41 、 及 び E sr41 変 異 体 発 現 プ ラ ス ミ ド の 構 築

はび

本研究では、腸管出血性大腸菌

^{株の野生株として}

^{を、非病原性大腸菌}

^{株の野生株とし}

^株

^，

^株は、抑

の転写制御領域にトランスポゾンの揷入がない株である

^)。

^{株の}

^{欠損株である}

^遺伝子を

^如遺伝子

^株を得

た。物遺伝子の欠失の確認は、物欠損株の表現型である生育遅延を確認することで行った。

^株は、

^を用いた

^株から

故遺伝子除去の確認は、株のクロラムフエ

^遺伝子と

^{株は以下のように}

^{如遺伝子で置換した}

^ブロモ

^-クロ ^ロ

^{インドリル}

^-ガ

^{を含む}

寒天培地を用いた呈色反応の有無の観察により行った。

^遺伝子と

^{株は以下のよう}

^{株の染色体上の、}

^遺伝子を

^遺伝子

^力セ

^{株染色体に}

^{株を得た。}

^{欠損株の表現}

^株は、

^を用いた

^株から

^{プラスミド}

^、

^に示す。

E s r41 ^{、及び} E sr41 変異体発現プラスミドの構築

^はび

^{の予想される転写制御}

^の

^領

域（

^の

^末端を

^{とした場合の}

^から

^を含む

^が

^に

^{タイプのプラス}

^{ある（}

^)。

^{、及び}

は以下のように構築した。

^、

^の

^{末端リン酸化プライマ}

^{ット、及び}

^、

^の

^{プラスミド}

^{を鋳型にした}

^により

^{断片、及び}

^{断片を増幅させた。各}

断片、及び

^{断片を得た。この}

^断片と

^{で処理した}

をフイゲーシヨン反応により連結させることで

^{、及び}

^を得た。

^{、及び}