20 0 去

Carcinogen treatment and DNA isolation from rat Iiver usingGNO恥fE™ DNA ISOLATION KIT

Table 4-1

0.4 rnL 0.1 rnL 5 mg/mL methylated

DNA

(in 0.1 M Phosphoric acid) 500 nmoVrnL 8AG (IS)

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DNA hvdrolvsis Protocol

Sprague-Dawley rat (Mail， 70・100_g)

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Rat liver ;200 mg 70 oC， 60 min

1.48 mL

SamDle for HPLC 40μL

RNase MIXX 唱‘一一一

16μL 4μL Sample

1

M

_{_}

�

a-acetate buffer pH 6.0

↓

Apply to HPLC 80μL

20μL 400μL SALT OUT MIXTURE

4 oC， 10 min Centrifuge， 10 min Supernatant

1.6mL 10m島1 Tris-HCI bufTer pH ^7.5

(containing 1 mM EDTA)

6.4 rnL (Eliminate the excess EtOH by blotting or air drying the

DNA) DNA

preciDitate

(A) ^{38 ω}

成主 7 ω

(2) in vivo

ラット肝臓由来のDNAを基準操作に従って処理し得られたクロマトグラ ムをFig.4-10(A)に示す。MNUを投与しないラットからは7MG及び06M G は検出されなかったが、 M N Uの腹腔内投与により、 ラットの肝臓由来のD

(-。Eze-守)

02ト

N A中により生じた7MG及び06MGの測定が可能であった。 時間-濃度曲 線をFig. 4-10(B)の示す。 このように本法はアルキル化剤投与によるDNA 障害の検出が可能である。

小括

HBrによる脱メチル化反応及びDMPG反応を組み込んだポストカラム蛍 光誘導体化HPLCシステムを開発した。 また、 このシステムをメチル化剤 処理したDNA 中における7MG及び06MGの測定へ適用した。 今回開発し た蛍光試薬DMPGを用いるポストカラムHPLCによる測定法の感度は従来 の自然蛍光に基づく方法とほぼ同じであったが、 選択性には優れていた。 人 における DNA付加物の検出 ・定量は、 癌や遺伝病の診断 ・評価に役立つも のと考えられる。 本法は生体中のグアニン塩基に対するアルキル化剤の影響 を調べる上で有用であり、 今後、 生体試料中の修飾グアニン類の測定及び関

連酵素の活性測定への適用が可能である。

4-9

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総括

本研究では 、 フェニルグリオキサールがグアニン関連化合物と選択的に反 応し蛍光物質を生成することに基づき、 より高感度な試薬の開発を第一目的 とした。 6種のアルコキシフェニルグリオキサール類を合成した結果、 フエ ニルグ リオキサールより高い蛍光強度を示す MPG、 DMPG及びMDPG試薬 類を見出した。 次に実試料分析への応用を目的として 、 これらの試薬をグア ニン関連物質の 逆相HPLCにおける 高選択的 高感度蛍光検出用試薬として の適用化を試みた。 3種の試薬によって生成するグアニン関連物質は逆相 HPLCによって分離可能であることを証明し、 かつそれらの生成物はそれぞ

れ単一の蛍光ピークとして観察された。 反応条件も 、 30mMリン酸ナトリ ウム緩衝液(pH7.0)を用いる5分間の反応時間で蛍光誘導体化が可能であ ることを実証し、 核酸関連物質の検出用誘導体化反応としては極めて穏和な 条件を構築することができた。 3種の試薬のうちDMPGと MDPGは同程度 の感度を有していたが 、 MDPGは溶媒に溶け難いため蛍光試薬としては

DMPGが最も優れた試薬であると思われる。 DMPGを用いてグアニン関連 化合物11種の蛍光誘導体の分離条件を検討し、 ほぼそれらを分離するこ とができた。 グアニン関連化合物の検出限界(S/N=3)は40-400

fmol/HPLC注入量レベルであり、 フェニルグリオキサール試薬よりも約4 倍高感度であった(第1章)。

DMPG試薬を用いて構築したプレカラム蛍光誘導体化HPLCをヒト尿中 のグアニン関連化合物の実試料計測法へ適用した。 尿試料に過剰に存在する

未知の蛍光物質により、 微量のグアニン関連化合物の測定が阻害された。 不 要の蛍光物質の除去及び微量のグアニン関連化合物の濃縮を目的に 、 回相抽 出用ミニカートリッジを用いた試料の前処理条件の検討を行った。 弱酸性条 件下、 陰イオン交換カートリッジを用い、 簡単に妨害物質の除去が可能で 、

またグアニン関連化合物の濃縮も可能であった。 設定したHPLC操作法に より、 ヒト尿中に存在していた G DP、 dGDP、 GMP、 dGMP及びcGMPを 測定することが可能であった。 なお、 本法は尿中の cGMPをHPLC定量し

たものとしては初めてのものである(第2章)。

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66 67

酵素活性測定への応用として、 細胞内情報伝達に関与しているサイクリッ クヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性測定法の開発をラット脳組織 をサンプルとして試みた。 従来より用いられている放射性同位体を用いる方 法に比べて簡便に測定できた白 また、 試料に共存する他の酵素により生成(又

は減少)するグアニン関連化合物についても分離、 検出でき、 酵素活性に及 ぼす種々の賦活剤、 阻害剤の影響を容易に調べることができる(第3章)。

発癌、 遺伝子病等に関与するメチルグアニン類の測定へ応用した。 06MG は、 DMPGにより直接蛍光誘導体化されなかった。 そこで、 06MGをHBr によりGuanineに変換した後、 蛍光誘導体化を行うポストカラム誘導体化 HPLCを開発し、 メチル化剤で処理したin vitro 及びin vivoDNA中のメチ

ルグアニン類の測定を行った(第4章)。

以上、 本研究において合成開発した蛍光試薬DMPGはHPLCにおけるグ アニン関連化合物に対する高選択的な蛍光誘導体化試薬として活用でき、 反 応時間、 感度などの点でPGO試薬より優れていた白 今後、 生体試料の様々 な組織、 DNAやRNA等における高分子生体物質の分析への応用も期待され る。

謝辞

本研究に際し、 御懇切な御指導と御鞭撞を賜りました九州大学薬学部薬品 分析化学教室 財津 潔教授に謹んで感謝致します。 また、 本研究に際し、

御助言をいただきました(株)同仁化学研究所 大倉洋甫九州大学名誉教授 に感謝致します。 本研究を遂行するにあたり、 直接御指導、 御協力頂きまし た九州大学薬学部薬品分析化学教室助教授 甲斐雅亮博士に謹んで感謝致 します。 併せて御助言を頂きました(株)中外製薬 能回 均博士ならびに

第一薬科大学助手 米倉さゆり博士に謹んで感謝致します。 実験に御協力頂 きました境 一恵、 小倉和宏、 久保田留美ならびに和田美穂子の諸氏に深く 感謝致します。

また、 数々の討論に参加頂きました薬品分析化学教室の皆様方に謹んで感 謝致します。

実験の部

各章に共通の事項

(1) 水( 蒸留水)

脱イオン水を蒸留して使用。

(2) ガラス器具

中性洗剤で洗浄後、 水で2倍希釈した市販硝酸に少なくとも一昼夜浸し 、 水道水及び蒸留水で洗浄後、 乾燥して使用。

(3) 試薬及び試薬溶液

特記しない限り市販の特級品あるいは得られる最上級品を使用。

核酸塩基誘導体 : 市販のものをメチルセロソルブ: 水(7 : 3 、 v/v)に溶

かし、 -20t暗所保存下で約3ヶ月使用可能。 使用時水で希釈して用い た。

(4) 機器

分光蛍光光度計 : 目立MPF-4型分光蛍光光度計を使用。 通常スリット幅 は 、 励起側、 発光側とも に 10 nm に設定。 測定セルは角型石英セルを使用。

高速液体クロマトグラフ:送液ポンプ は横河LC100 P を2台使用。

サンプリングインジェクター: Rheodyne 7125 sy ri ndge- loadin g sam ple imector (20μL文は100μL)を使用。

蛍光検出器:12ーμLのフローセルを装着した目立F-1000型分光蛍光光 度計(第1章) 、 又は15-μLのフローセルを装着した東ソ- F S-8010蛍 光検出器(第2-4章)を使用。

試薬送液ポンプ : ジーエルサイエンスMPD-5DLダブルプラ ンジャー高圧 低流量ポンプ 及び東ソ一CCPM を使用(第4章)。

記録計 :日立D-2500型イン テグ レーターを使用。

pHメーター:堀場F-12型 pHメーターを使用。

融点 : Yanaco融点測定装置で測定。

MSスペクト ル :JEOLJMN-3500データシステムを装備した JEOL JMS- D300型質量分析計を使用。

遠心分離器:目立分離用小型超遠心分離器 CS 120 を使用。

70

(5) 緩衝液

50mMリン酸ナトリウム緩衝液( pH6.0 ) :リン酸二水素ナトリウムー 水和物3.45 gを水に溶かして全量500mLに調製。 これにリン酸水素二ナ トリウム二水和物1.78 gを水で全量200mLに調製したものを加え pH6.0 に調整した。

30mMリン酸ナトリウム緩衝液( pH7.0) :リン酸二水素ナトリウムー 水和物2.07 gを水に溶かして全量500mLに調製。 これにリン酸水素二ナ トリウム二水和物1.07 gを水で全量200mLに調製したものを加え pH7.0 に 調整した。

第1章に関する実験

(1) フェニルグリオキサール誘導体の合成

フェニルグリオキサール誘導体の合成は H. A. Rileyら83)の合成法を一部 変更して行ったω。

4'- Methoxyacetophenone、 3'，4'- D imethoxyacetophenone 、 3'，4'，5'­

T rimet h oxyace t oph e non e又は3'，4'-Methylenedi oxyacetophenone CA ld ri ch製 :それぞれ7.5 g、 9.0 g 、 10.5 g又は8.2 g ; 0.05 mol )をあ らかじめS e02 7.0 g (0.06 mol)を溶かしたジオキサン45mL、 水1.4mL

に 加え、 100-120'Cで3---4 時間還流。 還流後THF 50 mLを加えろ過し、

ろ液を減圧下溶媒を留去。 得られ た油状性物質に水150mLを加え、 100t で20 分還流。 反応液を熱時 ろ過し、 冷却後得られるオレンジ色の組結品を 水で再結品。 無色針状品の MPG、 DMPG、 TMPG 、 MDPGを得 た( MPG:

収率58 % 、融点100-1020C 、Anal. Calcd. For C9HlO04 ， C 59.34%， H 5.49 %，

035.17%， Found， C 60.55%， H 5.37%，034.08%、m/z=164[M+] ; DMPG : 収率55%、 融点98-99t、 Anal. Calcd. For CloH1 205' C 56.07%， H 5.61%，

o 38.32%， Found， C 56.51%， H 5.70 %，0 37.79%、m/z=194[M+]; TMPG : 収率50 %、 融点86-88'C、 Anal. Cal cd. For Cl1H1 406， C 54.55%， H 5.79%，

039.66%， Foun d， C 55.02%， ^H 5.60%，039.38%、m/z=224[M+]; MDPG : 収率40 % 、 融点104- 107'C 、 Anal. Cal cd. For C9H805， ^C 54.55%， H 4.04 %，

o 41.41%， Found ， C 54.78%， H 4.03%，0 41.19%、 m/z=178[M+])ロ

71

(2) MPG、 DMPG及び MDPG溶液

各10mmolを量り、 MPG、 DMPGは2mL、 MDPGは3mLのDMSO に 溶解させた後、 水を 加え て全量を5mLとし調製した。 遮光、 4t保存で少

なくとも1週間は安定。

第2章に関する実験

(1) 尿試料

健常人の随時尿を0.45μm のフィルター で不純物を除去したのち使用 。 すぐに使用しない場合は-20tで保存。

(2) Britton-Robinson 緩衝液(pH2.0- 10.0)

酸混合液( リン酸3.92 g、 酢酸2.40 g及びホウ酸2.47 g/ L)と0.2 M 水 酸化ナトリウムとで 調整した。

(3) 尿中クレアチニン測定

和光純薬製 のクレアチニン測定キットを使用した。 10倍希釈した 尿試料 あるいはクレアチニン標準溶液(0-10mg/0.5 mLに除蛋白試液(タングス テン酸ナトリウムリン酸を含有)3.0 mLをふりまぜながら加え 、 室温で10 分間放置。 2500 rpm.以上で10分間遠心し、 上清を2.0mLとり25-30tの

水浴につけ、 22mMピクリン酸2.0mL及び0.75 M 水酸化ナトリウム2.0 mLを 加え20分間放置白 520 nmの吸光度を測定。 検量線を作成し試料中の

濃度を決定した。

(4) カートリッジ

TOYOPAK DEAE S (東ソー)を使用した。 カートリッジ上部にプラスチ ックシリンジ(テルモ、 1-2.5mL)を接続し、 このシリンジにより加圧し、

カートリッジに注入した溶液又は溶媒を通過させた。 カートリッジは使用前 に水0.6mLで3回洗浄した。

第3章に関する実験

(1) 1 mM EDTA、 1mM ジチオトレイトール含有 ショ糖溶液(250mM) a) ショ糖溶液(0.5 M) :ショ糖8.558 gを水50mLに溶解し調製した。

b) EDTA溶液(20mM) : EDTA74.5 mgを水10mLに溶解し調製し た。

c) ジチオトレイトール溶液(20mM) :ジチオトレイトール6.2mgを 水2.0mLに溶解し調製した(用時調製)。

ショ糖溶液(0.5 M) 5.0 mL、 EDTA溶液(20mM) 0.5 mL、 ジチオト レイトール溶液(20mM) 0.5 mL、 水4.0mLを混合し調製した。

(2) タンパク質の定量66)

a) 試薬

溶液A:ビシンコニン酸ナトリウム(同人化学)1.0 g、 炭酸ナトリウム 1.71 g、 酒石酸ナトリウム二水和物0.16 g、 水酸化ナトリウム0.4 g、 炭酸

水素ナトリウム0.95 gを水95.5mLに溶解し、 炭酸水素ナトリウムを用い てpH11.25に調整した。

溶液B:硫酸銅五水和物0.4 gを水9.6mLに溶解し調製した。

溶液C:溶液A15mLと溶液B 0.3 mLを混合し調製した。 (用時調製) b) 操作

試料あるいは標準溶液(牛血清アルブミンで作成)の100μ Lと溶液C2 mLを試験管にとり、 混合して37tで30分間インキュベートし、 562 nm

の吸光度( 試薬ブランク対照)を測定。 検量線を作成し試料中の濃度を決定 した。

(3) 250 mM トリス一塩酸緩衝液(pH7.6 )

トリス(ヒドロキシメ チル)アミノメタンを1.51 gを約30mLの水に溶 かし、 塩酸(0.1 M)でpHを7.6 に 調整後、 水で全量を50mLに 調製した。

(4) MnC12水溶液<0.5 M)

塩化マンガン四水和物0.99 gを水10mLに溶解し調製した。 用時希釈し て用い た。

ドキュメント内 九州大学学術情報リポジトリ (ページ 37-47)