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Guanine H

8・Aza伊lanine (8AG) 7・Methylguanine (7MG)

Guanine 8AG 7MG

CH30

CH30

3，4-Dimethoxyphenylglyoxal

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06-Methylguanine

(06MG) Guanine CH30

Expected t1uorophore (Ex 400 nm， Em 520 nm)

Fig.4・1 Demethylation and f1uorescence derivatization of guanine derivatives

民10bile phase C H3CN ( 2-18 % ) in 20 mM Na圃acetate buffer (pH 3.75)

4 MNaOH in 0.5 M Na-acetate

buffer (pH 6.0)

50 mM DMPG in 20 % methylcellosolve in 0.5 M Na- acetate buffer ( pH 6.0) 4加IHBr

High pressure pump

Fluorescence detector Ex 400 nm，

Em510 nm 0.8 mL/min

p

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0.4 mL/min

CJ唱。コ

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^Column

I吋ector TSK- geIODS-120T Reaction bath (110 ⁰ C)

1司1aste Fig.4・2 Schematic diagram of the post-column fluorescence derivatization HPLC system

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クロマトグラム

Fig. 4-3 (A)にモデル化合物5種の混液(各25nmol/mL)の クロマトグ

ラムを示す。 これらの物質は18 分以内に良好に分離された。 一方、 Fig. 4-3 (B)にHBr添加後、 脱メチル化用の反応コイルを通さず直ちにアルカリ溶液

を加え、 DMPG試薬による蛍光誘導体を行った時に得られたクロマトグラ ムを示す。 06MG由来のピークは全く検出されず、 06MGの検出にはHBr

による脱メチル化反応が必要であることが分かった。

4-2

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脱メチル化反応条件の検討

4-3

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06MGをDMPGと反応可能なGuanineに導く ための脱メチル化反応条件 N

の検討を行った。

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(%)NJ�J (1) 反応温度

反応コイルの加熱温度を80-110OCの範囲で検討した。 ただし、 機器の構 成上蛍光誘導体化反応の温度も脱メチル化反応と同じになる 。 反応温度の上 昇に従って蛍光も増加した。 120t以上では気泡の発生によりベースライン の乱れが見られた。 従って 、 反応温度は1100Cに設定した。

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HBr濃度

06MGの脱メチル化 時に用いる酸性溶媒として種々の濃度のHI、 HBr、

HCl、 HCI04及びHN03について検討した(Fig. 4-4) 。 検討した溶媒の中 では4MHIが最も良い結果を与えた。 しかし、 HIは非常に酸化されやすく 扱い難いため 、 本研究ではHBrを用いた。 また、 HBr濃度が高いほど06MG 由来のピークも高い値を示した。 本法では4MHBrを使用した。

54

(2)

HBr (4 M) HBr (3 M) ID(4M) ID(3M) E百αM) HCI (4加の HCI04(4加の HN03(4 M)

。 50 100

Peak height (arbitrary unit)

Fig.4・4 Effect of the acids on the conversion of 06-methylguanine into guanine

56

(3) コイル長さ

脱メチル化反応に 使用する反応コイルの長さを0-30 mの範囲で検討し た(Fig. 4-5 ) 0 06MG由来のピークは、 反応コイルが長くなるに従い脱 メチル化反応が進行し増加した。 本法では30 mに コイル 長さを設定した。

なお、 30 mのコイルは約5分の反応時間に相当する。

一方、 Guanine、 8AG、 7MGのピークは、 コイルが長くなるに従い若干 低くなるが、 GMPのピークはコイル長さ が10 mの時 に最大 となった。 GMP はHBr存在下加熱に よりリボース5 -リン酸部位が切れ、 DMPG との反応性 の高 い Guanineになったものが蛍光誘導体化されるものと 考えられた。

4- 4 蛍光誘導体化条件の検討

(1) pH

蛍光誘導体化反応に おけるpHの検討を行 った(Fig. 4- 6) 0 pH 5.5以 上では、 ベースラインノイズが著しく増大した。 そのためpH が4.6-5.2 になるように試薬の流量を設定した。 本システムは、 高濃度の酸及びアルカ リを使用するため厳密に pHを固定できないが、 pH4.5以降は、 検討した

グアニン類の蛍光ピークの挙動はほぼ同じであるため 、 メチルグアニン類の 測定の際は既知の濃度の GMP、 8AGなどを内標準物質として添加し、 蛍光 誘導体化反応時のばらつきを補正した。

(2) 試薬濃度

DMPG試薬濃度を0-50mMで検討した(Fig. 4-7) 0 GMP、 Guanine、

06MGはDMPG濃度 が40mMでほぼ一定 となった。 一方、 8AG、 7MG は DMPG濃度の増加 と共に 増加した。 試薬の可溶性を考慮し、 DMPG濃度を

50mM に 設定した。

4- 5 検量線及び検出限界

検量線 (0-1 nmol/HPLC注入量)はすべて原点を通る直線を示した。 相 関係数は、 γ= 0.9989- 0.9996 であった。 GMP、 Guanine、 8AG、 7MG及 び06MGの検出限界(S/N = 3 )は、 それぞれ4.2 、 1.7， 18 、 22及び2.3 pmol/HPLC注入量であった。

57

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Reaction coillength (m)

2

3

4 5

Fig.4・5 E住ect of the reactioo coil Ieogth (0.5 mm i.d.) 00 the demethylatioo of 06-methylguaoioe

Curves: l=Guanine; 2=06.Methylguanine; 3=GMP;

4=8・Azaguanine; 5=7・MethyIguanine.

58

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pH

Fig.4・6

Effect of pH 00 the post-columo f1uoresceoce derivatization of guanine and its methylated compounds with

DMPG

Curves: l=Guanine; 2=06-Methylguanine; 3=GMP;

4=8・Azaguanine; 5=7・Methylguanine.

59

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DMPG

concentration

(mM) Fig.4・7

4-6 メチル化DNAの調製(in vitro)

DNA溶液(Salrnon t e stis : 4 .0 mg/mL)にメチル化剤 である20mM Nも1e thyl- N-nitr osou r ea (MNU ) 溶液を加え、 37 tでインキュベートし た。 メチル化反応終了後、 冷エタノールを加え、 沈殿した メチル化DNAを 0.1 Mリン酸 溶液中 70t、 6 0分間 加水分解した。 加水分解した DNA溶液 10μLに 0.2 M酢酸ナト リウム緩衝液(pH 6 .5 ) 5μLを加え、 内部標準 物質として 20 n rnol/mL GMP溶液 5μLを加えHPLCに附した。

4- 7 メチル化DNAの調製(in vivo) 2

3

Spragu e -Dawley ラット (雄、 70-100 g)に 50mg/kgMNUを腹腔内投 与した。 対象には MNUの代わりに生理食塩水を腹腔内投与した。 投与後、

肝臓を取りだし-8 0tで保存した。 メチル化されたラット肝臓 DNA は市販 のDNAアイソレーションキット (フナコシ社製 )を用い単離した(Table 4- 1 )。 加水分解 は4-6と同様に行った。

4

5

4-8 メチル化DNAの計測

50

(1) in vitro

基準操作に従って処理し得られたクロマト グラムをFig. 4-8に示す。 メ チル化剤添加後直ちに 加水分解した試料は、 DNA中のグアニン含有ヌクレ オシド、 ヌクレオチドはリン酸による加水分解によりすべてGua nin eに変

換し、 他のグアニン類は全く検出されなかった(Fig. 4-8(B))。

一方、 メチル化剤添加後37 t、 120分間 インキュベートした試料は、 MNU 添加による7MG 及び06MGの生成が確認できた(Fig. 4-8 (A)) 。

次に、 MNU添加におけるインキュベーション時間及び添加 濃度について 調べた(Fig.4-9)0 7MG、 06MGの生成は インキュベーション時間 と共に 増加した。 120分の インキュベーション時間におけるMNU濃度を検討した ところ、 濃度の増加に伴い 7MG， 06MGの生成量は増大した。 20mMMNU のメチル化条件における7MG、 06MGの生成量は、 DNA 1 rng あ たりそれ

ぞれ4 nmol及び 496 prnolであった。

E町ect of DMPG concentration

₀₀

the post-column

t1uorescence derivatization of guanine and i臼methylated compounds

Curves: I=Guanine; 2 =06-Methylguanine; 3=GMP;

4=8・Azaguanine; 5=7・Methylguanine.

Carcinogen treatment and DNA isolation from rat Iiver usingGNO恥fE™ DNA ISOLATION KIT

Table 4-1

0.4 rnL 0.1 rnL 5 mg/mL methylated

DNA

(in 0.1 M Phosphoric acid) 500 nmoVrnL 8AG (IS)

勉盟副皇 ↓

DNA hvdrolvsis Protocol

Sprague-Dawley rat (Mail， 70・100_g)

I

^�一一I.P .injection of 50 m時g N-Meth句旬剛1りザ刷yμr}ト-N-n凶itrosoωu山uea

I

^{2，4， 8， 1凶6and 2μ4h}

Rat liver ;200 mg 70 oC， 60 min

1.48 mL

SamDle for HPLC 40μL

RNase MIXX 唱‘一一一

16μL 4μL Sample

1

M

_{_}

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a-acetate buffer pH 6.0

↓

Apply to HPLC 80μL

20μL 400μL SALT OUT MIXTURE

4 oC， 10 min Centrifuge， 10 min Supernatant

1.6mL 10m島1 Tris-HCI bufTer pH ^7.5

(containing 1 mM EDTA)

6.4 rnL (Eliminate the excess EtOH by blotting or air drying the

DNA) DNA

preciDitate

(A) ^{38 ω}

成主 7 ω

ドキュメント内 九州大学学術情報リポジトリ (ページ 32-37)