2ロー［＝i☆一［コ
3［コ憩［｝一［コ
4［睡コー□
5ロー薩鋼一一□
6［］懸一［コ
7□世一［コ
8［コーぐ匪蟄一一［コ
蟹
MM
図11pURA4βに変異を入れたときのスキッピング産物の解析
（A） pURA4βに変異を導入したレポーター遺伝子の構造と変異部位。
（B） Aで示した1〜8のプラスミドを野生株に導入し、105、104、103、102cellslmlに なるようMMプレートにスポットした。△＝はブランチ部位、○はブランチ部位の
下流配列、◇は3 スプライス部位、☆は5 スプライス部位の変異を示している。（C） 変異を入れたプラスミドの転写産物のスプライシングパターン。形質転換体から
回収した全RNAを用いてRT−PCRを行い（上段）、またサザンプロットでスキッピ
A
U2AF59／Prp2
T2591
幽→a切仰22D307N
ods 7劇3 0ds 7−7
（sηわ4，25レ28，32，m s77−453）
Ψ甲M517a・a・
C387Y A383E
o6た37r2 ρηコ27
（sηh29）
B
＝WT 豊 o
MM
MMU
図12 U2AF59／ρ明ρ2変異株にpURA4βを導入した時の スキッピングの解析
（A） これまでに分離されている分裂酵母U2AF59変異株におけるそれぞ
れの変異部位。μρ2．7、ρノρ2．2株はスプライシング変異株として 分離された。（B） ods7−7，0ds7−2、ρノp2．7、ρ巧ρ22株にpURA4βを導入し、 MMと
MMUプレートにパッチした。野生株（WT）はスキッピングが起こ
らないのでMMプレートで生育できないが、スプライシング変異
株として分離されたρ1p2．7、ρ1p2．2でもod3変異株と同様にMMプ
レートで生育できている。
A ∩。
m ㌦
｝ − 凶
ex。r櫻Sη卵』層 GU
↓
／ハ，．
↓
．u
B
MM
若
WT O
ミ
s
讐s h
MMU
図13ρ覇ρ7、画ρ70、画ρ72変異株にpURA4βを導入したとき のスキッピングの解析
（A） Prp1、 Prp10、 Prp12の機能部位。 Prp1はU41U6・U5 tri−snRNPのコンポーネン
トで、Prp10はSAP155、 Prp12はSAP130である。これらはスプライシングに おいて図のように機能するタンパク質である。また、Prp10とPrp12はU2 snRNPと共にブランチ部位の認識に関与すると考えられている。
（B） ρ1ρ7．ρ石ρ70、ρ1p72にpURA4βを導入し、 MM及びMMUプレートにパッチし
た。ρ1p1、ρ1p70．ρノp12の形質転換体はMMプレートで生育することができ
なかったことから、これらの変異株ではエキソンスキッピングは引き起こされ
sη177sη1737 sη177 sη1737
WT
ods 7
ods2 ods3
Sηh7
sηわ37
MM MMU
図14 s舶7とs納37の相補性検定
α煮a＋性変異株における相補性検定。各μra＋性変異株は野生株の一倍体又は
各σra≠性変異株と掛け合わせを行い、2倍体を形成させた。それぞれの2 倍体はpURA4βが保持されている。それをMMUとMMプレートにパッチ
して、26℃で培養した。
博 超
WT O
， 魯
。
十 ←
287bp｛：／［匪｝一［］25・bP
←一［麗［］…bp
極］15・bp
一鞘＿［r鶴
図15 0ds4． ods 7−3におけるエキソンスキッピングの検出
ods4、 ods 7−3株から回収したRNAを逆転写し、 tub−3とtub−4プライマーを用いて
pURA4βcDNAをPCRした。 PCR産物は5％アクリルアミドゲルで電気泳動し、エチ ジウムブロマイドで染色した（上段）。エキソンスキッピングによって作られた σfa4＋mRNAは、エキソンスキッピング特異的なプローブを用いたサザンプロットで 検出した（下段）。右に示したRT−PCR産物の構造は、ゲルから抽出したcDNAを
シークエンスして確認した。矢印はRT−PCRに用いたtub−3とtub−4プライマーの位置
を示している。1．分裂酵母コスミドライブラリーをhis3−URA4βを保持したods4株に導入
分裂酵母ゲノム
約14Mb 三面20鱒￠〜斬片に分断
S．ρombe Cosmid l＿ibrary
乙εσ2
ノ
Oob4株
。
↓
2．ライブラリーとレポーター、二つのプラスミドを持つ形質転換体を得た
〆〆酬 …皿 魎、、㌦総動幣
筏駄． 岬ノ
画職鞠一
ドキュメント内
魁拶斬薩蕉瀟
(ページ 68-73)