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一方， MES添 加 液 で は
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1. 7%と 前 者 に 比 べ て そ の 形 成 率 は 明 ら か に 低 か っ た . パ ル ス 電 界 強 度 に つ い て み る と ， そ の 強 度 が 高 い ほ ど ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 は 高 い が 1.5 kV. cm‑1以 上 で は 8%前 後 と 大 差 が な か っ た . パ ル ス 電 界 の 印 加 時 に 顕 微 鏡 観 察 を 行 っ た 結 果 ， 1.75kV・
cm‑1以 上 の パ ル ス 電 界 を 与 え る と ， タ マ ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト の 破 壊 が 多 く ，2.0 kV . cm‑1で は 特 に 顕 著 で あ っ た (Table4・2.).4・2す . 交 流 印 加 時 開 お よ び パ ル ス 堰
電 気 的 細 胞 融 合 の た め の そ の 他 の 2種 の 電 気 パ ラ メ タ ー に つ い て 検 討 し た . 交 流 印 加 時 間 に つ い て は ， 20， 40お よ び 60秒 の 時 間 を 設 定 し た . そ の 結 果 ， ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 は ， 40秒 で 最 大 と な り 6.0%
の ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 と な っ た . 60秒 で は 三 重 以 上 の 多 重 融 合 が 誘 起 さ れ ， ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 は 4.0%と む し ろ 低 下 し た(Table4・3.).
一 方 ， パ ル ス 幅 は そ の 幅 が 狭 い ほ ど ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 が 高 く ， 50μ 秒 の パ ル ス 幅 で 最 大 値 5.7%と な っ た (Table 4・4.). 顕 微 鏡 下 で 観察した結果， 100お よ び 150μ 秒 の パ ル ス 幅 を 用 い る と ， ネ ギ お よ び タ マ ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト の 損 傷 が 顕 著 で ， 150μ 秒 に お い て は 特 に 破 裂 す る プ ロ ト プ ラ ス ト が 多 か っ た .
4・2・4. 細 胞 密 度
ネ ギ と タ マ ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト を 等 量 混 合 し て ， 0.5， 1.0， 1.5およ び 2.0X 105個 .ml‑1の 細 胞 密 度 を 設 定 し ， 未 融 合 細 胞 ， ヘ テ ロ カ リ オ ン ， ホ モ カ リ オ ン お よ び 三 重 以 上 の 融 合 細 胞 を 調 査 し た (Fig.4・2.).
細 胞 密 度 を 0.5，1.0， 1.5お よ び 2.0X 105個 .ml‑1と す る と ， 総 融 合 細 胞 率 は そ れ ぞ れ 9.8，20. ，1 24.4および 27.2%と 融 合 率 が 向 上 し た . し か し ， ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 に つ い て み る と ， 1.5 X 105個 .ml
‑1の 細 胞 密 度 の 場 合 に 最 高 値 7.1%となった. 2.0X 105個 .ml‑1で は む し ろ 低 下 し て 5.8%と な っ た . ま た ， 細 胞 密 度 が 高 く な る と ， 三 重 以
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Protoplast density
Fig.4‑2. E妊ectsof protoplast density on fusion formation between japanese bunching onion and bulb onion. Protoplast fusion was conducted by use of Shimadzu somatic hybridizer SSH‑10 and fusion chamber FTC‑64. Parameters of electrofusion: AC field， 1 MHz， 80 V • cm‑¥ 20 sec; DC field， 1.5kV・cm七
50μsec pulse width; two pulse treatments at a 10 sec interva1. Data were mean values from four replications.
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上 の 融 合 細 胞 が 顕 著 に 増 大 し た . す な わ ち ， 0.5 X 105個 .ml‑1の場合，
三 重 以 上 の 融 合 率 は 2.1%であるが， 1.0， 1.5お よ び 2.0X 105個 .ml
‑ 1で は ， そ れ ぞ れ 8.3，13.3お よ び 14.4%とその割合が高くなった.
一 方 ， ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 は 4.0‑‑‑7.0%と 検 討 し た 細 胞 密 度 開 で は 大 差 が な か っ た .
第 3節 考 察
植 物 の プ ロ ト プ ラ ス ト は 電 気 刺 激 に よ り 融 合 す る こ と が Senda et al.(1979)に よ っ て 示 さ れ て 以 来 ， 電 気 細 胞 融 合 の 基 礎 技 術 の 開 発 が 進 められた (Zimmermannand Scheurich，1981). 電 気 細 胞 融 合 が 開 発 される以前は， PEG (Kao and Michayluk， 1974) な ど の 化 学 的 処 理 に よ っ て 細 胞 融 合 が 行 わ れ ， 一 部 の 試 験 で は 現 在 で も 利 用 さ れ て い る . しかし， PEGは 細 胞 発 達 に 対 し て 阻 害 的 で あ り (Belarmino et a， l.1996) ， か つ ， そ の 取 り 扱 い が 煩 雑 で あ る こ と か ら ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 体 細 胞 雑 種 を 作 出 す る に あ た っ て は 電 気 細 胞 融 合 に よ る こ と と
した.
ネ ギ と タ マ ネ ギ の 細 胞 融 合 の み な ら ず ， 一 般 に ネ ギ 属 植 物 の 細 胞 融 合 に 関 す る 報 告 は 極 め て 少 な く ， 唯 一 ， Buiteveld et al.(1998)によっ て リ ー キ と タ マ ネ ギ と の 体 細 胞 雑 種 が 報 告 さ れ て い る に す ぎ な い . さ ら に ， 彼 ら の 細 胞 融 合 は PEGに よ っ て 行 わ れ て お り ， ネ ギ は も と よ り ネ ギ 属 植 物 の 電 気 細 胞 融 合 の 試 験 例 は な い . そ こ で ， ネ ギ と タ マ ネ ギ
と の 体 細 胞 雑 種 の 作 出 を 目 的 と し て ， 再 現 性 が あ り 簡 便 な 電 気 細 胞 融 合 技 術 の 体 系 化 を 検 討 し た . ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 最 適 な 電 気 細 胞 融 合 条 件 を 明 ら か に す る た め に ， ネ ギ は 液 体 培 養 細 胞 由 来 の 白 色 の プ ロ ト プ ラ ス ト を 単 離 し ， 一 方 の タ マ ネ ギ は 葉 身 由 来 の 葉 緑 体 を 有 す る プ ロ ト プ ラ ス ト を 利 用 す る こ と と し た . こ の こ と に よ っ て ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 融 合 細 胞 ( ヘ テ ロ カ リ オ ン )， ネ ギ あ る い は タ マ ネ ギ 関 士 の 融 合 細 胞 ( ホ モ カ リ オ ン ) を 判 別 し ， 数 値 化 す る こ と が で き た .
細 胞 融 合 は ， 高 周 波 電 界 に よ っ て プ ロ ト プ ラ ス ト が 泳 動 す る 過 程 ，
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細 胞 同 士 が 対 合 し て パ ー ル チ ェ イ が 形 成 さ れ る 過 程 ， さ ら に 一 過 性 の 方 形 波 電 界 に よ り 接 着 し た プ ロ ト プ ラ ス ト 同 士 が 融 合 す る 過 程 の 3段 階 を 経 て 成 立 す る ( 野 田 ・ 十JH，1989).細 胞 融 合 条 件 を 確 立 す る に あ た っ て ， ま ず ， 細 胞 懸 濁 液 と パ ー ノ レ チ ェ イ ン の 形 成 頻 度 に 関 す る 試 験 を 行 っ た . 細 胞 懸 濁 液 の 組 成 は ， 細 胞 の 接 着 に 有 効 と さ れ る 塩 化 カ ル シ ウ ム(Nea et al.，1987;野田・十川， 1989)の 濃 度 と p H安 定 化 剤 と し て 頻 用 さ れ る MESを 組 み 合 わ せ て 検 討 し た . 高 周 波 電 界 を 印 加 し て ノ ミ ー ノ レ チ ェ イ ン の 形 成 を 促 進 す る た め の 細 胞 懸 濁 液 と し て は ， カ ル シ ウ ム の 濃 度 は 低 濃 度 の
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""'0.5mMの 範 囲 が 適 当 で あ っ た . カ ル シ ウ ム 濃 度 が 2.5m M以 上 で は ， プ ロ ト プ ラ ス ト の 泳 動 は ほ と ん ど 観 察 さ れ な か っ た . 細 胞 懸 濁 液 中 の イ オ ン 濃 度 が 高 い と プ ロ ト プ ラ ス ト が 元 来 有 す る 荷 電 量 が 低 下 し ， そ の 結 果 ， 泳 動 力 が 低 下 し た と 考 え ら れ る (Zimmermann and Scheurich， 1981).一方， MESの 添 加 は カ ル シ ウ ム 濃 度 が 1""'2.5m Mの 条 件 下 で は ， パ ー ル チ ェ イ ン 形 成 に 有 効 で あ っ た が ， カ ル シ ウ ム 無 添 加 あ る い は 0.5 m M添 加 の 条 件 下 で は ， そ の 効 果 は 明 ら か で は な か っ た .細 胞 の 融 合 は 方 形 電 圧 に よ り 誘 起 さ れ ， 電 気 締 胞 融 合 に お い て は パ ル ス 電 界 強 度 が 最 も 重 要 な パ ラ メ タ ー と さ れ る こ と か ら ( 野 田 ・ 十J11 ， 1989) ， 本 条 件 に つ い て 詳 細 に 検 討 し た . ま た ， 前 試 験 に 引 き 続 き プ ロ
ト プ ラ ス ト 間 の 融 合 を 行 う 過 程 に お い て も ， 細 胞 懸 濁 液 組 成 に つ い て さ ら に 検 討 す る こ と と し た . そ の 結 果 ， 電 気 細 胞 融 合 の た め の 細 胞 懸 濁 液 と し て は 0.5mMの 塩 化 カ ル シ ウ ム 液 が 適 当 で ， MESの 添 加 に よ っ て ヘ テ ロ カ リ オ ン の 形 成 率 が 低 下 す る こ と が 明 ら か と な っ た . パ ノ レ ス 電 界 強 度 に つ い て は ， 1.5 kV ・cm‑1以 上 で ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 は 8%前 後 と 大 差 か な か っ た (Table4・2.).また， 1.75kV ・cm‑1以 上 で は 破 裂 す る プ ロ ト プ ラ ス ト が 多 く 観 察 さ れ る こ と か ら ， 好 適 な パ ル ス 電 界 と し て は ，1.50kV.cm‑1が 適 当 と 考 え ら れ た .
そ の 他 の 電 気 条 件 と し て ， プ ロ ト プ ラ ス ト が 泳 動 し て パ ー ル チ ェ イ ン が 形 成 さ れ る た め の 交 流 印 加 時 間 を 検 討 し た .60秒 で は 5個 以 上 の 細 胞 が つ な が り ， パ ル ス 電 界 を 印 加 す る と 三 重 以 上 の 融 合 細 胞 が 多 く
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な っ た . 従 っ て ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 頻 度 は 低 下 す る こ と が 示 さ れ ， 40 秒 が 適 当 と 判 断 さ れ た (Table4・3.). さ ら に ， パ ル ス 幅 と し て は ， 50
と 100μ 秒 で ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 は 5%以 上 と 高 か っ た . 150μ 秒 で は 破 裂 す る プ ロ ト プ ラ ス ト が 顕 著 に 多 い こ と か ら ， パ ル ス 幅 が 長 い と 融 合 綿 胞 へ の ダ メ ー ジ が 大 き い と 考 え ら れ た . 実 際 の 運 用 で は ， 細 胞 融 合 率 が 高 く ダ メ ー ジ の 少 な い 50μ 秒 が 適 当 と 判 断 さ れ た .
以 上 の 細 胞 懸 濁 液 お よ び 電 気 融 合 の 好 適 条 件 を 踏 ま え て ， こ れ ま で に 数 値 的 な 解 析 が な さ れ て い な か っ た 細 胞 密 度 に つ い て 検 討 し た . 細 胞 密 度 が 高 く な る に し た が っ て ， 全 細 胞 融 合 率 の 向 上 し た . そ の 効 果 は 主 と し て 三 重 以 上 の 多 重 融 合 に 起 因 し て い た . ヘ テ ロ カ リ オ ン を 獲 得するためには1.5X105個 .ml‑1の 密 度 が 適 当 で ，7 % 以 上 の ヘ テ ロ カ リ オ ン 形 成 率 と な っ た (Fig.4・2.). リ ー キ と タ マ ネ ギ と の PEGに よ る 細 胞 融 合 に お い て は ， 約 2%の 融 合 率 (Buiteveldet al.， 1998) が 報 告 さ れ て い る こ と に 比 較 す る と ， 極 め て 高 率 と 考 え ら れ る . 従 来 ， 細 胞 融 合 に 際 し て 細 胞 密 度 の 設 定 は 経 験 的 に 実 施 さ れ て い た が ， 当 試 験 に お い て は 数 値 的 に 解 析 し 最 適 密 度 を 決 定 す る こ と が で き た .
以 上 の よ う に ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 電 気 細 胞 融 合 を 行 う た め の 基 礎 と な る 知 見 が 得 ら れ ， こ れ ら を 組 合 わ せ る こ と に よ っ て 再 現 性 が あ り ， か つ ， 効 率 的 な 細 胞 融 合 法 が 確 立 し た も の と 考 え ら れ る . 前 輩 の ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト か ら の 植 物 体 再 生 系 に 従 い ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 融 合 細 胞 を 培 養 す る こ と に よ っ て ， 体 細 胞 雑 種 の 育 成 が 実 現 可 能 と 考 え ら れる.
第 4節 摘 要
本 章 で は ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 体 細 胞 雑 種 の 獲 得 を 目 指 し て ， 効 率 的 で 再 現 性 の あ る 電 気 細 胞 融 合 条 件 に つ い て 検 討 し た . 細 胞 懸 濁 液 の 組 成 ， 電 気 融 合 の た め の パ ラ メ タ ー ， お よ び 細 胞 密 度 の 各 要 因 の 水 準 を 組 合 わ せ た 実 験 を 行 い ， こ れ ら の 最 適 条 件 を 明 ら か に し た . 得 ら れ た 結 果 は 以 下 の と お り で あ る .
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( 1 ) 懸 濁 培 養 細 胞 由 来 の 白 色 の ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト と 葉 緑 体 を 有 す る 葉 身 由 来 の タ マ ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト と を 用 い て ， 細 胞 融 合 試 験 を 行 っ た . そ の 結 果 ， 両 者 が 融 合 し た ヘ テ ロ カ リ オ ン の 判 別 が 可 能 と
なった.
(2)電 気 細 胞 融 合 の た め の 細 胞 懸 濁 液 と し て は 0.5m Mの 塩 化 カ ノレシウム液が適当であった.
(3)電 気 融 合 条 件 と し て ， パ ル ス 電 界 強 度 は 1 .50kV.cm‑1， 交 流 印 加 時 間 は 40秒 ， ま た パ ル ス 幅 は 50μ 秒 が そ れ ぞ れ 最 適 と 考 え
られた.
(4)ヘ テ ロ カ リ オ ン を 獲 得 す る た め に は 1 .5X105傭・ ml‑1のプロ ト プ ラ ス ト 密 度 が 適 当 で ， こ の 条 件 で 7 %以 上 の ヘ テ ロ カ リ オ ン が 形 成 さ れ た .
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第 V 章 ネ ギ と タ マ ネ ギ の 体 細 胞 雑 種 の 育 成
第E章 で ネ ギ の プ ロ ト プ ラ ス ト か ら の 植 物 体 再 生 系 を 確 立 し ， さ ら に 続 く 第 N 章 で は ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 効 率 的 な 電 気 細 胞 融 合 法 を 明
らカhにした.
本 章 で は ， 第E章 お よ び 第N章 で 確 立 し た 手 法 に よ り ， ネ ギ と タ マ ネ ギ と の 体 細 胞 雑 種 の 開 発 を 検 討 す る . 同 時 に ， 近 年 急 速 に 発 展 し た DNA解 析 技 術 を 応 用 し て ， 得 ら れ た 体 細 胞 雑 種 植 物 の 核 お よ び 締 胞 質 ゲ ノ ム の 動 向 を 明 ら か に す る .
第
1
節 材 料 お よ び 方 法5・1・1. 供 試 品 種 お よ び そ の プ ロ ト プ ラ ス ト の 単 離
鳥 取 県 園 芸 試 験 場 で 選 抜 ・ 育 成 さ れ た 伯 州 ネ ギ ' 系 の 品 種 で ， 中 生 品 種 改 良 伯 仲15号 ，(Allium fistulosum L.， 2n=2x=16)お よ び 早 生 品 種 早 ど り 伯 州 ，(A. fistulosum L.， 2n=2x=16) を 用 い た . 一 方 の 融 合 親 と し て ， 細 胞 質 雄 性 不 稔 (CMS) 遺 伝 子 を 持 つ タ マ ネ ギ(A. cepa L.， 2n=2x=16)品種 せきほく， (宮浦ら， 1985) を 用 い た . ネ ギ お よ び タ マ ネ ギ の プ ロ ト プ ラ ス ト は 第E章 で 確 立 し た 懸 濁 培 養 細 胞 か
ら単離した.
5・1・'2. ネ ギ の 細 胞 質 の 不 活 性 化
ネ ギ 2品 種 の 細 胞 質 の 不 活 性 化 は ， 両 品 種 の プ ロ ト プ ラ ス ト に 種 々 の 濃 度 の ヨ ー ド ア セ ト ア ミ ド ( IOA) 処 理 を 行 い ， 最 適 な IOA濃 度 を 検 索 し た . そ の 処 理 濃 度 は ， 0， 2.5， 5， 10及 び 20m Mと し た . ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト を 単 離 し た 後 0.63 M マ ニ ト ー ル ， CPW無 機 塩 (Frearson et al.， 1973)お よ び 5m M MESを 含 み pHを 5.8に 調 整 し た そ れ ぞ れ の 濃 度 の IOA液 に ネ ギ プ ロ ト プ ラ ス ト を 懸 濁 し ， 4 oC，
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