本 章 第1節 及 び 第2節 の 研 究 に よ って,嗅 覚 が 農 薬 感 知 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ とが 明 らか に され た。 し か し,調 べ た 農 薬3種 に対 す る嗅 覚 器,味 覚 器,孔 器 の 電 気 生 理 学 的 応 答 は対 照 と比 較 して統 計 学 的 に有 意 差 を示 したが,そ れ ら の 応 答 値 は きわ め て 小 さ く,ま た,応 答 様 式 もレalanine及 びNaC1の もの と は,か な り異 な って い た 。 この よ うな 各 化 学 感 覚 器 官 の 応 答 は,ど の よ うな 感 覚 情 報 を中 枢 神 経 系 に入 力 し,そ こで どの よ う に知 覚 さ れ た の か は 不 明 で あ る 。 本 節 で は,こ れ らの 問 題 を 解 明 す る 手 が か り を 得 る た め に,条 件 付 け (conditioning)手 法 を用 い た 行 動 実 験 を行 い,農 薬 に 対 す る各 化 学 感 覚 の 役 割 に つ い て さ ら に 詳 細 な 検 討 を 行 っ た 。
材料と方法
供 試 魚 と して40尾 の コ イ(589±154g)を 用 い た。 コ イの 入 手,飼 育 条 件 及 び 実験 に 用 い た 脱 塩 素 水 道 水 の 化 学 組 成 は 第1章 第1節 で 述 べ た もの と同 様 で あ る。
供 試 農 薬 は,除 草 剤 のbenthiocarb原 体 を用 い,農 薬 原 体 をacetone(残 留 農 薬 試 験 用,和 光 純 薬 工 業)に 溶 解 し た 。 そ の 溶 液 を所 定 の 濃 度 に な る よう に,蒸 留 水 で 希 釈 し,各 濃 度 の 試 験 液 を作 成 し た 。 こ こ で 用 い た 農 薬 濃度 の 表 記 は,試 験 液 中 に 含 まれ る農 薬 原体 の 成 分 濃 度 で 示 し た 。 各 試 験 液 のpHは,実 験 に 用 い た 最 高濃 度 にお い て,6.57で あ っ た 。 本 研 究で 用 い た 各 農 薬 の 濃 度 は その 農 薬 の 半 数 致 死 濃 度(48hr‑L('50,1.7mg〃)の 値 を基 準 と し,そ の 対 数 倍 希 釈 を行 っ た もの で あ る 。
コ イのbenthiocarb溶 液 に よ る条 件 付 け実 験 は,ま ず,供 試 魚1尾 を 図2‑11に 示 した ア ク リ ル 製 の 実 験 水 槽(60x15×15cm一 水 深)に 収 容 し,同 図 に示 した よ うに 実 験 水 槽 後 半 部 に 設 け た暗 所 内 で 安 静 に させ た 。 実 験 水 槽 の 周 囲 を暗 幕 で 囲 み,実 験 者 が コイ か らみ られ な い よ う に して 実 験 を 行 っ た 。 実 験 水 槽 上 部 の 導 管 か ら500m1/minの 脱 塩 素水 道 水 を常 に流 し,水 槽 前 後 の 側 面 中 央 に あ るそ れ ぞ れの 排 水 口 か ら排水 を 行 っ た 。 水 槽 に 注 水 さ れ た 脱 塩 素 水 道 水
は,常 に 暗 所 内 にい る コ イ の 吻 部 に 流 れ る よ うに流入 口の 位 置 を 調 節 し た 。 次 い で,ペ リス タ ル テ ィ ッ ク ポ ン プ を 用 い て,2.5m1/minの 一 定 速 のbenthiocarb溶 液 を 上 記 導 管 部 に設 置 した 混 合 部 に 注 入 し,脱 塩 素 水 道 水 に よ っ て 希釈 され たbenthiocarb溶 液 が コ イ の 吻 部 に お い て,1.7×103ｵg〃 の 濃 度 にな って 流 れ る よ うに調 節 し た。 コ イの 嗅 覚 器,味 覚 器,孔 器 等 の 化 学 感 覚 器 のbenthiocarbに よ る刺 激 方 法 は,ま ず,20秒 間 の 農 薬 注 入 を行 い,注 入 終 了 後, 直 ち に,水 槽 後 部 に 設 置 した 電 極 に よ って コイ の尾 部 に電 気 シ ョ ック(DC24V,0.2A)を 与 え,農 薬 に よ る 条 件 刺 激 と 逃 避 行 動 を学 習 させ た。 電 気 シ ョ ッ ク に よっ て コ イ は 驚 き暗 所 か ら 飛 び 出 し,水 槽 前方 に突 進 す る 。 突 進 に よ る水槽 の 前 面 壁 との 衝 突 を 防 ぐた め,前 面 壁 に はス ポ ン ジ を用 い た ク ッ シ ョ ンを 設 置 した 。以 上 の 操 作 を行 っ た後,1時 間 以 上Ii/min脱 塩 素 水 道 水 を 水 槽 内 に流 し,水 槽 内 に残 留 す るbenthiocarbを 洗 浄 除 去 した 。 この 間 に,コ イ は 安 静 に な る と と も に,化 学 感 覚 器 官 の 順 応 か ら 回復 す る。 その 後,再 びbenthiocarbに よ る条 件 刺 激 と電 気 シ ョ ック を 繰 り返 し行 っ た 。 この 条 件 付 けは,1日 に5〜6回 行 いf2〜3日 間 行 っ た 。 条 件 付 けの 完 了 した コ イ,す なわ ち,電 気 シ ョック を行 わ な く と も,benthiocarbに よ る条 件 刺 激 に よ っ て 確 実 に 暗 所 か ら前 方 へ の逃 避 行 動 を 示 した もの を 次 の 実 験 に用 い た 。
条 件 付 けの 完 了 し た コイ は,以 下 に示 す 処 理 を 行 っ た 。
力 ニ ュー レに よ る 化 学 感 覚 刺 激:実 験 は鼻 孔 に カ ニ1レ を 装 着 し た コ イ及 び 口腔 内 に カ ニ ュ ー レ を 装 着 した コ イ を 用 い,条 件 刺 激 液 で 化 学感 覚 器 を 刺 激 した と きの 逃避 行 動 を観 察 し た。 前 者 は 試 験 液 を カ ニ ュー レ を通 して 鼻孔 へ 送 る こ とに よっ て 嗅 覚 器 の み の 刺 激 を 行 い,後 者 は 口腔 内 へ 送 る こ と に よ って 口腔 内 の 味覚 器の み の刺 激 を 行 った 。 カ ニ ュー レの装 着 方 法 は, 1/5000濃 度 のMS222麻 酔 薬で 軽 く麻酔 した後,嗅 覚 器 刺 激 の 場 合,図2‑12,a,bに 示 す
よ う に両 眼 の 中 間 点 の 頭 蓋 に 歯 科 用 ド リル で 小 孔 を開 け,モ ク ネ ジ(直径2mm,長 さ10mm) を取 り付 け,2本 の カニ ュ ー レ用 の シ リ コ ン チ ュ ー ブ(外 径2mm)を 手 術 用 縫 合 糸 を 用 い て モ ク ネ ジ に固 定 した 。 固定 さ れ た シ リ コ ンチ ュー ブ を前鼻 孔 か ら嗅 上 皮 に損 傷 を与 え な い よ うに 注 意 しな が ら挿 入 し,後 鼻 孔 か ら外 へ 出 し た。 シ リコ ン ・チ ュ ー ブの 鼻 腔 内 に入 る 部 分 の 側 面 に あ らか じめ 孔 を 開 けて お き,そ の 開 口部 が ち ょう ど鼻 腔 内の 嗅 上 皮 の 真 上 にな る よ う に 設 定 した 。 装 着 さ れ た シ リコ ンチ ュ ー ブ の 外 径 は実 験 に用 い た コ イ の 前 鼻 孔 の 内 径 と ほ ぼ 一 致 し, チ ュー ブ は前 鼻 孔 で 密 着 して い る。 しか し,後 鼻 孔 の 内 径 は 少 し大 き い た め,チ ュー ブ の 上 に シ リ コ ン ・チ ュー ブ の リ ング(外 径3mm,内 径2mm)を 被 せ,後 鼻孔 に密 着 させ た(図2‑12, b)。 この 操 作 を 左 右 両 鼻 孔 に 行 った 。 昧 覚 器 刺 激 の 場合 は,テ フロ ン ・チ ュ ー ブ を 加 熱 に よ っ て 整 形 し,頭 蓋 や 口腔 の 形 状 にあ わ て 装 着 し,さ らに,頭 蓋 に取 り付 けた モ ク ネ ジ(嗅 覚 器 刺 激 の と き に用 い た もの と同 様 の 方 法)に よ って 固定 した(図2‑12,c)。 装 着 され た カ ニ ュ ー レ
は左 右 の 口蓋 部 組 織 に密 着 して 開 口 して お り,そ の 開 口部周 辺 領 域 に分 布 す る味 蕾 を試 験 液 で 直接 刺 激 す る よ うに した 。
化 学 感 覚遮 断:第1章 第1節 で 述 べ た 方 法 に従 って 嗅 覚 遮 断,孔 器 感覚 遮 断 を行 っ た 。 条 件 付 け の 完了 した コイを 用 い,鼻 孔 カ ニ ュー レの装 着,口 腔 内 カ ニ ュー レ装 着,嗅 覚 遮 断, 孔 器 感 覚 遮 断 の4組 の 組 み合 わ せ に よ って 各 化 学 感 覚 器 官 を 刺激 す る実験 を 行 っ た(図2‑13)。
同 図 のaは 嗅 覚 器 の み 刺 激 され,bは 主 に 口腔 内味 覚 器 が 刺 激 さ れ るが,口 腔 内 に注 入 され た 刺 激 液 が,呼 吸 水 に よ っ て 希 釈 さ れ っ っ,鯉 か ら排 出 され た とき,体 表 に散 在 す る 皮 膚 味 蕾 と孤 立 化 学 感 覚 細 胞 も刺 激 さ れ る。cは 嗅 覚 器 以 外 の 化 学 感 覚 器 が 刺激 さ れ,dは 味 覚 器 及 び 孤 立 化 学 感 覚 細 胞 が 刺 激 さ れ る。 刺 激 液 の 濃 度 は,1.7ｵg〃,1.7×104ｵg〃,1.7×10%g〃 の3段
階 の 濃 度 を用 い た。 ま た,対 照 と して,蒸 留 水 に対 す る反 応 も 調 べ た 。一一度 実験 に用 い た コ イ は,再 び 実 験 に 用 い な か った 。
化 学 感 覚 器 官 の 刺 激 に よ る反 応 の 評 価 は,刺 激 の 開始 後3分 間 コイ の行 動 を観 察 し,コ イ が 暗所 か ら前 に 逃 避 した り,水 面 に浮 上 しジ ャ ン プ し よう とす る 行 動 が み られ た 場 合 に1点 を, 暗 所 か ら逃 げ な か っ た が,暗 所 内で 落 ち付 き な く盛 ん に動 き回 る行 動 を0.5点 の 得 点 を 与 え, 10例 の コ イ の 平 均 得 点 を 求 め た 。 ま た,コ イ1尾 につ き,一 つ の 濃 度 の刺 激 液 に 対 して10回 実 験 を 行 い,確 実 に逃 避 行 動 の み られ た と きの 反 応 数 か ら,下 記 の反 応 率(Responserate,以 後,Rrと 記 す)を 計 算 した 。
Rr‐Numberofresponsex100 10
これ を10例 の コ イで 調 べ,そ の 平 均 値 で あ る平 均 反 応 率(MeanResponserate,以 後, MRrと 記 す)に よ って 反 応 の 大 き さ を 比 較 した。 平 均 反 応 率 が ・1'i以 上 の と き を,コ イ が そ
の 刺 激 液 に対 して 感 知 して い る もの とみ な した 。
結 果
図2‑14に 条 件 付 け過 程 にお け る学 習 速 度 を 示 した。 コ イ の反 応 は,魚 体 の半 分 以 上 が 暗 所 か ら前 に逃 げ 出 した と きを1点 と して,10例 の 平 均得 点 に よ っ て プ ロ ッ トさ れ た 学 習 曲線 と し て 示 さ れ て い る 。 同 図 のaは 無 処 理 の コ イ を用 い て,嗅 覚 器,味 覚 器,孔 器,孤 立 化 学 感 覚 細 胞 に 対 して 同 時 に条 件 刺 激 を 繰 り返 し行 っ た と きの学 習 曲線 で あ る。 条 件 刺 激 を 繰 り返 して 与 え る に っ れ て 反 応 得 点 は増 加 し,9回 目の条 件 刺 激で0.9点 に達 し,そ の後,1点 近 くを 維 持 して い るた め,ほ ぼ学 習 した と み な され る 。一 方,同 図 のbは 嗅 覚 遮 断 処 理 を 行 っ た コ イ を 用 い て,味 覚 器,孔 器,孤 立 化 学 感 覚 細胞 に 対 して 条件 刺 激 を 繰 り返 し行 っ た と きの 学 習 曲 線 で あ る 。 学 習 曲 線 は増 加 を示 さ ず,14回 の条 件 刺 激 の繰 り返 し にお い て,8回 目の 条 件 刺 激 で 得 られ た0.6点 が 最 大 得 点 で あ った 。
各 化 学 感 覚 器 官 をbenthiocarb溶 液(1.7ｵg〃,1.7×104ｵg〃,1.7×10gｵg〃)に よ って 刺 激 した と き の 平 均 反 応 率 を 図2‑15に 示 した 。 コイ の 嗅 覚 の み 刺 激 した と きの 平 均 反 応 率 は, 調 べ た い ず れ の 濃 度 のbenthiocarbに 対 して も60%以 上 の 値 を 示 した(図2‑i5,a)。1.7×
104ｵg〃 のbenthiocarbに 対 して 最 も 高 い値 の9496を 示 し た が,高 濃 度 の1.7×106Fg〃 で は,そ れ よ り少 し低 く7896で あ っ た。 主 と して 味覚 を刺 激 し た 実 験(図2‑15,b),味 覚 ・孔 器 ・孤 立 化 学 化 学 感 覚 細 胞 を 同 時 に刺 激 した 実 験(図2‑15,c),味 覚 ・孤 立 化 学 感 覚 細 胞 を 同 時 に刺 激 した 実 験(図2‑15,d)の い ず れ の場 合 にお い て も6096以 上 の 平 均 反 応 率 が 得 られ な っか っ た 。 し か し,調 べ た 中で 最 も 高 い 濃 度で あ る1.7×10sｵg〃 のbenthiocarbに 対 して 比 較 的 高い 平 均 反 応 率 が示 され,と くにscの 実験 にお いて4896を 示 した 。
各 濃 度 のbenthiocarbで 嗅 覚 を刺 激 した と きの反 応 率 を 図2‑16に 示 し た 。benthiocarbに 対 して 逃 避 反 応 を 示 した 閾 値 は1.7ｵg〃 で あ った 。
考 察
本 研 究 で 用 い た 条 件 付 け手 法 に よ る実 験 は,個 別 の化 学 感 覚 器 官 の 感 知 能 力 を 調 べ る の に有 効 な 方 法で あ っ た 。 と く に,カ ニ ュ ー レを通 して の嗅 覚 刺激 は,希 釈 され る こ とな く嗅 上 皮 を 直 接 刺 激す るだ けで な く,刺 激 後 の試 験 液 は水 槽 外へ 排 出 され る ため,他 の 化 学 感 覚 器 官 を刺 激 し な い 。 カ ニ ュー レを 通 して の 味覚 刺 激 にお い て も,口 腔 内 の 味 蕾 を直 接 刺 激 す る た め,主
に味 覚 に よ る反 応 を得 る こ と が で き る。 た だ し,口 腔 内 に注 入 され た刺 激 液 が,呼 吸 水 に よ っ て 希 釈 され つ つ,鯉 か ら排 出 さ れ た とき,体 表 に散在 す る 孤 立 化 学 感 覚 細 胞 も低 濃 度 の 刺 激 液
に よ っ て 刺 激 さ れ る 問 題 が 生 じ るた め,実 験 方 法 の さ らな る改 良 が 必 要で あ ろ う。 図2‑13のc に示 した 刺 激 方 法 は,口 腔 カ ニ ュ..̲.レに よ る方 法 で は有 効 に刺 激 され な い 体 表 の 味 蕾,孔 器, 孤 立 化 学 感 覚 細 胞 も 刺 激 す る こ とがで き る。 さ ら に,図2‑13のdに 示 した 刺 激 方 法 は,孔 器 感 覚 の 遮 断 に よ って 味 覚 器 と孤 立 化 学 感覚 細 胞 の 反応 を 調 べ る こ とが で き るが,味 覚 器 と孤 立
化 学 感 覚細 胞 の 反 応 を 分 離 す る こ と はで きな い 問 題 が残 され て い る。
本 章 第1節 で 行 ったY字 型 水 槽 を用 い た 忌 避 行 動 実験 で は,コ イが 農 薬 を 感 知 し て い る と思 わ れ るY字 型 水 槽 に設 置 した暗 所 内 で の 激 しい 動 きが 観 察 さ れ たが,暗 所 か ら逃 げ 出 さ な か っ
た た め,行 動 反 応 値 と して 評 価 され な か った 。 この こと は,Y字 型 水 槽 に よ る 忌 避 行 動 実 験 か ら得 られ た 忌 避 閾 値 は,農 薬 の 存 在 を検 知 す る閾 値 で は な く,農 薬 に対 して 耐 え る こ と が で き ず 逃 避 行 動 を解 発 す る 閾値 で あ る こ と を意 味 す る 。 これ に 対 し て,本 実験 の 条 件 付 け手 法 は, 農 薬 検 知 の 有 無 を 評 価 す る こ と が で き る。 検 知 閾 値の 決 定 に お け る条 件 付 け手 法 の 有 効 性 は, ナ マ ズ の1種 のchannelcatfishが ア ミノ酸 に 対 して条 件 付 け され た と きの,摂 餌 行 動 反 応 や 心 拍 の 反 射 反 応 を調 ぺ た 実 験 にお い て も報 告 され て い る(HollandandTeeter,1981)。 さ らに, 彼 らの 研 究 は,そ の ア ミノ酸 に 対 す る検 知 閾 値 が 電 気生 理 学 的 に求 め た 閾 値 と 一 致 して い る こ と を指 摘 して い る 。 この 検 知 閾 値 に っ い て は,本 研 究で 調 べ た 嗅 球 脳 波 応 答 や 忌 避 行 動 実 験 と の 比 較 か ら明 らか にす る こ とが で き る(図2‑17)。benthiocarbに 対 す る嗅 球 脳 波 か ら求 め た 閾 値 は,1。7×10‑'ｵg/1で あ り(本章 第2節),本 実 験 か ら得 られ た 条 件 付 け した コ イ に お け る忌 避 反 応 の 閾 値 と 同 じ濃 度 で あ っ た 。 この こ とか ら,benthiocarbの 存 在 を 知 る 検 知 閾 値 は1.7
×10‑'ｵg/1で あ る と い え よ う ・ コ イ は48h・‑LC,。 の 値 の10
,0。 。 と い う 低 セ膿 度 の benthiocarbを 嗅 覚 で 検 知 し て い る も の と 思 わ れ る 。Y字 型 水 槽 を 用 い た 忌 避 行 動 実 験 か ら求 め た 忌 避 反 応 閾 値 は 検 知 閾 値 よ り10倍 高 い 濃 度 で あ っ た 。 し か し,忌 避 行 動 実 験 に お い て も, 忌 避 反 応 閾 値 のlIO濃 度(検 知 閾 値 に 相 当)のbenthiocarbに 対 し て ス タ ー ト地 点 の 暗 所 か ら の 逃 避 は 示 さ な か っ た が,安 静 状 態 を 失 い,暗 所 内 で 盛 ん に 動 き 回 る 行 動 が み ら れ た 。 し た が っ て,コ イ はL7×10‑'ｵg〃 のbenthiocarbを 嗅 覚 に よ っ て 検 知 し て い る が,実 際 に 忌 避 行 動 が 解 発 さ れ る 濃 度 は さ ら に10倍 高 い 濃 度 で あ る こ と が 明 ら か に さ れ た 。
本 実 験 の 結 果 は,嗅 覚 遮 断 し た コ イがbenthiocarbに よ る 条 件 刺 激 を 学 習 で き な か っ た こ と, ま た,無 処 理 の コ イ を 用 い て,条 件 付 け を 行 っ た と き,嗅 覚 刺 激 の み が1.7ｵg/1と い う 極 め て 低 い 濃 度 のbenthiocarbに 対 し て 有 効 な 逃 避 反 応 を 示 し,他 の 化 学 感 覚 器 官 の 刺 激 で は 反 応 し な か っ た こ と を 示 し た 。 さ ら に,本 章 第1節 で 述 べ た 嗅 覚 遮 断 コ イ に お け る 忌 避 行 動 実 験 及 び 嗅 覚 遮 断 メ ダ カ に お け る 忌 避 行 動 実 験(Hidaka,1989)に お い て も 嗅 覚 が 農 薬 に 対 す る 忌 避 行 動 に 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 こ れ ら の こ と か ら,嗅 覚 はbenthiocarb等 の 農 薬 の 感 知 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ とが 明 ら か で あ る 。 °
本 章 第2節 で 示 さ れ たbenthiocarbに 対 す る 味 覚 応 答 の 閾 値 は,1.7×103ｵg〃(10"a.aM)
で あ っ た の で(図2‑9),本 実 験 で 調 べ たbenthiocarbの1.7×1(fμ9〃(1σ52M)及 び1.7×
1(ρ μg〃(10‑Z.ZM)の 濃 度 で は,味 覚 器 は 感 知 で き る と 思 わ れ る 。 し か し,カ ニ ュ ー一レ に よ る 口 腔 内 の 味 蕾 刺 激 実 験(図2‑15,b)及 び 体 表 味 蕾 刺 激 実 験(図2‑15,c,d)の 結 果 は,い ず れ も 有 効 な 反 応 を 示 さ な か っ た 。 上 述 のHollandandTeeter(1981)の 実 験 は,嗅 覚 遮 断 し た 魚 に お い て も ア ミ ノ 酸 に 条 件 付 け が で き る こ と を 示 し,ア ミ ノ 酸 に 対 し て は,味 覚 に よ る 学 習 が 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た 。 こ の よ う な 条 件 付 け に お け る 農 薬 と ア ミ ノ 酸 の 差 異 は,ア ミ ノ