製パン性向上に対する ω-グリアジンの作用

96

97

98

99

100 3. 要 約

こ れ ま で の 結 果 か ら 、ω-グ リ ア ジ ン の 存 在 が 製 パ ン 性 に 大 き な 影 響 を 及 ぼ す こ と を 明 ら か に し た 。タ ン パ ク 質 含 量 が 同 じ に も 関 わ ら ず 製 パ ン 性 が 異 な る 小 麦 粉 が 存 在 す る が 、そ の 理 由 に つ い て 詳 細 は 不 明 で あ る 。本 草 で は 、そ の 製 パ ン 性 に ω-グ リ ア ジ ン の 量 が 関 与 し て い る こ と が 推 察 さ れ た の で 、 製 パ ン 性 が 異 な る 3 種 (キ タ ノ カ オ リ 、 春 よ 恋 、 ハ ル ユ タ カ) の 小 麦 粉 (タ ン パ ク 質 12％) の ω-グ リ ア ジ ン 量 (mg/g 小 麦 粉) を RP-HPLC に て 測 定 し た 。 そ の 結 果 、製 パ ン 性 が 良 好 な 小 麦 粉 、キ タ ノ カ オ リ で は 0.81、製 パ ン 性 が や や 劣 る 春 よ 恋 お よ び ハ ル ユ タ カ は 、 そ れ ぞ れ 0.66 お よ び 0.62 で あ り 、3 者 間 の 製 パ ン 性 と ω-グ リ ア ジ ン 量 に は 相 関 性 が み ら れ た 。 ま た 、 グ リ ア ジ ン の 表 面 疎 水 性 度 (F.I./mg) を 測 定 し た と こ ろ 、そ れ ぞ れ 107.5、112.2 お よ び 119.7を 示 し 、製 パ ン 性 の 優 れ た 小 麦 粉 は ω-グ リ ア ジ ン 量 が 多 い た め 、生 地 の 伸 展 性 が 大 き く な り 、 高 い 製 パ ン 性 を 示 す も の と 推 察 さ れ た 。

ま た 、グ リ ア ジ ン を 生 地 に 加 え る こ と で 、製 パ ン 性 が 向 上 す る こ と が 知 ら れ て い る が 、 そ の グ リ ア ジ ン に 含 ま れ る ω-グ リ ア ジ ン の 量 が 多 い グ リ ア ジ ン 程 、グ リ ア ジ ン の 表 面 疎 水 性 度 が 低 く 、生 地 の 伸 展 性 が 大 き く な る こ と で 製 パ ン 性 が よ り 向 上 す る こ と を 明 ら か に し た 。

以 上 の こ と か ら 、ω-グ リ ア ジ ン が 生 地 の 伸 展 性 に 関 わ っ て い る こ と が わ か り 、従 来 未 解 明 で あ っ た 製 パ ン 性 の 機 序 の 一 要 因 を 明 ら か に す る こ と が で き た 。こ れ ら 成 果 は 、ω-グ リ ア ジ ン を 制 御 す る こ と に よ る 小 麦 粉 生 地 の 加 工 性 お よ び 製 品 の 品 質 向 上 に 繋 が る こ と が 期 待 さ れ る 。

101

総 括

小 麦 種 子 に は 他 の 穀 類 に み ら れ な い グ リ ア ジ ン と グ ル テ ニ ン の 2 種 の タ ン パ ク 質 が 存 在 し 、小 麦 粉 に 水 を 加 え 混 捏 す る と 両 者 の 複 合 体 で あ る 粘 弾 性 を 示 す グ ル テ ン が 形 成 さ れ る 。こ れ が 小 麦 粉 生 地 の 骨 格 と な り 、そ の 性 状 に よ っ て 菓 子 類 、麺 類 、パ ン 類 な ど 小 麦 粉 の 用 途 が 決 定 さ れ る 。グ ル テ ン は グ リ ア ジ ン と グ ル テ ニ ン が ジ ス ル フ ィ ド (SS) 結 合 、 水 素 結 合 、 イ オ ン 結 合 、 疎 水 性 相 互 作 用 な ど 様 々 な 結 合・相 互 作 用 に よ っ て 形 成 さ れ る 複 雑 な 複 合 体 で 、グ リ ア ジ ン お よ び グ ル テ ニ ン と 共 に 不 溶 性 で あ る こ と か ら 、形 成 機 序 に つ い て は 現 象 論 の 解 析 に 留 ま り タ ン パ ク 質 科 学 的 視 点 か ら の 研 究 は 不 十 分 で 、 未 だ 形 成 機 序 は 解 明 さ れ て い な い 。

本 研 究 で は 、製 パ ン 業 界 で は 既 知 の 知 見 と し て 知 ら れ て い る 、脱 脂 乳 の 加 熱 程 度 に よ っ て 製 パ ン 性 に 真 逆 の 作 用 を 示 す こ と に 着 眼 し 、小 麦 粉 タ ン パ ク 質 と 乳 タ ン パ ク 質 に お け る 分 子 間 相 互 作 用 な ら び に グ ル テ ン 形 成 と の 関 係 に つ い て 研 究 を 行 っ た 。

脱 脂 乳 の 製 パ ン 性 に は β-ラ ク ト グ ロ ブ リ ン (β-Lg) の 挙 動 が 大 き く 関 与 す る こ と 、 未 変 性 β-Lg は 製 パ ン 性 を 阻 害 し 、β-Lgが κ-カ ゼ イ ン (κ-CN) と 加 熱 複 合 体 を 形 成 す る と そ の 製 パ ン 性 阻 害 作 用 は 消 失 す る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、β-Lg と 親 和 性 を 示 す 小 麦 粉 タ ン パ ク 質 が ω-グ リ ア ジ ン で あ る こ と を 突 き 止 め 、同 グ リ ア ジ ン が 脱 離・水 溶 化 す る と 生 地 の 伸 展 性 が 小 さ く な り 、製 パ ン 性 が 低 下 す る こ と を 明 ら か に す る な ど 、従 来 未 解 明 で あ っ た 脱 脂 乳 お よ び 乳 タ ン パ ク 質 の 製 パ ン へ の 影 響 の 機 序 な ら び に 、そ の 知 見 を 基 に 生 地 の 形 成 機 序 お よ び 同 伸 展 性 の 発 現 に つ い て そ の 一 端 を 明 ら か に し た 。 ま た 、 同 タ ン パ ク 質 含 量 の 小 麦 粉 に お け る 製 パ ン 性 の 差 異 を 解 明 す る 上 で 、 ω-グ リ ア ジ ン が 分 子 マ ー カ ー と し て 利 用 で き る 可 能 性 を 見 出 し た 。

以 下 に 、 研 究 成 果 の 概 要 を 記 述 し た 。

Ⅰ 製 パ ン 性 に 影 響 を 与 え る 乳 タ ン パ ク 質 の 特 定

1. 乳 タ ン パ ク 質 の 熱 変 性 と 製 パ ン 性 の 関 係

非 加 熱 の 脱 脂 乳 と 60~80℃ で 30 分 間 加 熱 処 理 し た 脱 脂 乳 を 用 い て 製 パ ン 試 験 を 行 っ た と こ ろ 、脱 脂 乳 無 添 加 の パ ン の 値 を 100 と し た 場 合 、パ ン 比 容 積 は 非 加 熱 脱 脂 乳 添 加 で は 90.2±1.1 (±SD) と 低 下 し た が 、60℃ 、70℃ お よ び 80℃ で は そ れ ぞ れ 96.4±1.8、98.0±1.9 お よ び 100.4±1.7 を 示 し た 。 パ ン の

102

ク ラ ム (内 相) の 硬 さ は 非 加 熱 脱 脂 乳 添 加 で 138.0±11.3と 高 い 値 を 示 し た が 、 加 熱 脱 脂 乳 で は そ れ ぞ れ 132.5±4.9、130.0±14.8お よ び 105.0±14.0 を 示 し た 。

非 加 熱 脱 脂 乳 で は 比 容 積 が 小 さ く 硬 い パ ン と な っ た が 、加 熱 脱 脂 乳 で は 加 熱 温 度 の 上 昇 に 伴 い 比 容 積 お よ び 硬 さ と も に 無 添 加 と 近 似 し 、80℃ 、30 分 処 理 で は 製 パ ン 性 は 低 下 し な い こ と が 確 認 さ れ た 。

そ こ で 、そ の 要 因 を 探 る た め 、脱 脂 乳 の 未 変 性 ホ エ ー タ ン パ ク 質 態 窒 素 含 量 (WPNI； mg/g 試 料) を 測 定 し た 。そ の 結 果 、非 加 熱 脱 脂 乳 で は 8.75±0.54 (±SD) を 示 し た の に 対 し 、60℃ お よ び 70℃ 処 理 で は そ れ ぞ れ 7.20±0.66 お よ び 6.91±0.33 と 穏 や か に 値 が 低 下 し た が 、80℃ 処 理 で は 1.13±0.04 と 著 し く 低 下 し 、WPNI が 小 さ い 脱 脂 乳 ほ ど 製 パ ン 性 が 阻 害 さ れ な い こ と か ら 、未 変 性 の ホ エ ー タ ン パ ク 質 が 製 パ ン 性 の 低 下 に 関 与 す る こ と が 推 察 さ れ た 。

2. ホ エ ー タ ン パ ク 質 の 製 パ ン 性 に 及 ぼ す 加 熱 処 理 の 影 響

前 述 の 試 験 の 結 果 、非 加 熱 脱 脂 乳 の 添 加 に よ る 製 パ ン 性 の 低 下 に 未 変 性 の ホ エ ー タ ン パ ク 質 の 関 与 が 示 唆 さ れ た の で 、非 加 熱 脱 脂 乳 よ り 分 離 し た ホ エ ー タ ン パ ク 質 を 生 地 に 添 加 し 、 製 パ ン 試 験 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 比 容 積 は 81.6±3.1、硬 さ は 138.9±14.3 を 示 し 、ホ エ ー タ ン パ ク 質 は 製 パ ン 性 を 低 下 さ せ た 。

ま た 、 ホ エ ー タ ン パ ク 質 を カ ゼ イ ン と 混 合 し て 製 パ ン 試 験 を 行 っ た 結 果 、 非 加 熱 で は 比 容 積 が 79.4±2.3、硬 さ が 210.4±10.8 と 大 き く 製 パ ン 性 が 低 下 し た が 、 加 熱 (80℃ 、30 分 間) で は 比 容 積 が 93.4±4.3、 硬 さ が 113.0±5.0 を 示 し 、 無 添 加 と 有 意 な 差 は な く 製 パ ン 性 の 低 下 が 抑 制 さ れ た 。

非 加 熱 脱 脂 乳 の 添 加 に よ る 製 パ ン 性 の 低 下 は 、ホ エ ー タ ン パ ク 質 の 作 用 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。な お 、カ ゼ イ ン と 混 合 し 加 熱 し た 場 合 、お よ び 先 に 示 し た よ う に 加 熱 脱 脂 乳 で は 製 パ ン 性 阻 害 が み ら れ な い こ と か ら 、加 熱 脱 脂 乳 に お け る ホ エ ー タ ン パ ク 質 の 製 パ ン 性 阻 害 作 用 の 消 失 に カ ゼ イ ン の 関 与 が 示 唆 さ れ た 。

3. 2D-PAGE に よ る 乳 タ ン パ ク 質 の 熱 変 性 の 挙 動 解 析

加 熱 に よ る 乳 タ ン パ ク 質 の 挙 動 を 2D-PAGE に て 解 析 し た 。 一 次 元 目 の Blue-Native-PAGEで は 、非 加 熱 脱 脂 乳 で 1,200kDa 付 近 に カ ゼ イ ン ミ セ ル (α-、

β-、κ-CN)が 確 認 さ れ た が 、 加 熱 脱 脂 乳 で は カ ゼ イ ン ミ セ ル よ り も 高 分 子 量 域 に タ ン パ ク 質 の 存 在 が 確 認 さ れ た 。次 に 、二 次 元 目 を SDS-PAGE (Me+) に て 泳 動 し た と こ ろ 、加 熱 脱 脂 乳 で は カ ゼ イ ン ミ セ ル に 含 ま れ る κ-CN が 尐 な く な り 、1,200kDa 以 上 の 高 分 子 量 域 に κ-CN お よ び β-ラ ク ト グ ロ ブ リ ン

103

(β-Lg) の バ ン ド が 確 認 さ れ た 。κ-CN と β-Lg は SS 結 合 し 複 合 体 を 形 成 す る こ と が 既 に 報 告 さ れ て い る が 、本 結 果 よ り 、カ ゼ イ ン ミ セ ル 表 面 を 被 覆 し て い る κ-CN は β-Lg と SS結 合 す る こ と で カ ゼ イ ン ミ セ ル か ら 脱 離 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。

そ こ で 、β-Lg を 生 地 に 添 加 し 製 パ ン 試 験 を 行 っ た と こ ろ 、 比 容 積 は 80.2±5.3、 硬 さ は 215.7±19.0 を 示 し 、 製 パ ン 性 を 大 き く 低 下 さ せ た 。 ま た 、 β-Lg を κ-CN と 混 合 加 熱 さ せ た と こ ろ 、 比 容 積 105.4±4.3、 硬 さ 86.0±5.0 を 示 し 、 製 パ ン 性 が 回 復 し た 。

以 上 の 結 果 か ら 、非 加 熱 脱 脂 乳 の 製 パ ン 性 阻 害 の 原 因 物 資 は ホ エ ー タ ン パ ク 質 の β-Lg で あ る こ と 、ま た そ の 製 パ ン 性 阻 害 は 加 熱 処 理 に よ っ て β-Lg が κ-CN と SS 結 合 に よ る 高 分 子 複 合 体 を 形 成 す る こ と に よ っ て 消 失 す る こ と を 明 ら か に し た 。

Ⅱ グ ル テ ン 形 成 に 及 ぼ す 乳 タ ン パ ク 質 の 影 響 要 因 に つ い て

非 加 熱 脱 脂 乳 の 製 パ ン 性 阻 害 要 因 で あ る β-Lg が 作 用 す る 小 麦 粉 タ ン パ ク 質 の 検 索 を 行 っ た 。β-Lg を 添 加 し て 小 麦 粉 生 地 を 作 製 し 、純 水 (S1)、50mM ト リ ス-塩 酸 緩 衝 液 (pH7.8、S2)、50%プ ロ パ ノ ー ル 溶 液 (S3)、0.1M 酢 酸 溶 液 (S4)お よ び 1％SDS 溶 液 (S5) に て 順 次 分 画 し 、得 ら れ た 各 可 溶 性 画 分 を SDS-PAGE (Me+) に 供 し た 。 そ の 結 果 、β-Lg の 添 加 に よ っ て S1 画 分 に 無 添 加 で は み ら れ な い 55kDa の タ ン パ ク 質 が 確 認 さ れ 、S3お よ び S4 画 分 に 溶 出 す る グ リ ア ジ ン は 減 尐 し た 。β-Lg・κ-CN 加 熱 複 合 体 を 添 加 し た 場 合 で は 無 添 加 と 同 様 な 溶 解 挙 動 で あ っ た 。そ こ で 、グ リ ア ジ ン 抗 体 を 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト を 行 っ た と こ ろ 、55kDa タ ン パ ク 質 は グ リ ア ジ ン で あ る こ と を 確 認 し た 。さ ら に 、同 タ ン パ ク 質 に つ い て N 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 分 析 し 、DDBJ の FASTA に て 既 知 の タ ン パ ク 質 と の 相 同 性 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、Triticum aestivum 由 来 の omega-5 gliadin と 85％ の 相 同 性 を 示 し た 。

グ リ ア ジ ン は α、β、γ、ω グ リ ア ジ ン の 4 つ が 存 在 し 、 強 い 疎 水 性 相 互 作 用 に よ っ て 会 合 体 を 形 成 し て い る 。そ こ で 、ω-グ リ ア ジ ン が グ リ ア ジ ン 会 合 体 か ら 脱 離 し 水 溶 化 す る 要 因 を 検 討 す る た め 、フ ァ ー ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 を 改 良 し て そ れ ぞ れ の グ リ ア ジ ン と β-Lg の 分 子 間 相 互 作 用 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。 各 グ リ ア ジ ン を PVDF 膜 に 吸 着 さ せ た 後 、β-Lg 溶 液 に 浸 し 振 盪 反 応 を 行 っ た 。β-Lg 抗 体 と の 反 応 を 試 験 し た 結 果 、β-Lg は ω-グ リ ア ジ ン に 対 し て 強 い 陽 性 反 応 を 示 し た 。 ま た 、 各 グ リ ア ジ ン に κ-CN を 同 様 に 作 用 さ せ

104

た て 試 験 し た と こ ろ 、κ-CN は 各 グ リ ア ジ ン と 強 い 相 互 作 用 に よ り 会 合 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 、β-Lg・κ-CN 加 熱 複 合 体 で は 、β-Lg 抗 体 に 対 し ω-グ リ ア ジ ン 以 外 の ω-グ リ ア ジ ン に も 陽 性 反 応 を 示 し 、κ-CN は 加 熱 複 合 体 の 状 態 で あ っ て も グ リ ア ジ ン と 相 互 作 用 し た 。

こ の こ と か ら 、ω-グ リ ア ジ ン が β-Lg と 結 合 し 、 グ リ ア ジ ン 会 合 体 か ら 脱 離 し 水 溶 化 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、β-Lg・κ-CN 加 熱 複 合 体 で は κ-CN が 他 の グ リ ア ジ ン と 強 い 親 和 性 を 示 す た め 、グ リ ア ジ ン 会 合 体 か ら ω-グ リ ア ジ ン は 脱 離 せ ず 、 ω-グ リ ア ジ ン の 水 溶 化 が 抑 制 さ れ た 。

以 上 の こ と か ら 、β-Lg に よ る 製 パ ン 性 の 低 下 作 用 は 同 グ リ ア ジ ン の 水 溶 化 に よ っ て 惹 起 さ れ る こ と が 推 察 さ れ た 。

Ⅲ グ ル テ ン 形 成 に 影 響 を 与 え る グ リ ア ジ ン の 分 子 間 相 互 作 用 に つ い て

1. ω-グ リ ア ジ ン の 脱 離 が グ リ ア ジ ン の 性 質 に 与 え る 影 響

β-Lg に よ り ω グ リ ア ジ ン が 水 溶 化 す る こ と で 、 粘 性 を 示 す グ リ ア ジ ン の 性 質 に 影 響 を 与 え る こ と が 推 察 さ れ た 。そ こ で 、グ リ ア ジ ン 0.5gに 純 水 0.8ml を 加 え て 生 地 を 作 製 し 、物 性 を 測 定 し た と こ ろ 、粘 り (gw/cm²) は 233.8±59.1 (±SD)、 硬 さ (gw/cm²) は 591.4±84.6 を 示 し た 。 一 方 、ω-グ リ ア ジ ン を 除 去 す る と そ れ ぞ れ 112.2±22.7 お よ び 652.2±97.7 を 示 し 、 粘 性 が 低 下 し 硬 く な っ た 。な お 、β-Lg・κ-CN 加 熱 複 合 体 を 作 用 さ せ た 場 合 、そ れ ぞ れ 183.3±47.4 お よ び 607.7±74.4 を 示 し 、 無 添 加 と 有 意 な 差 は み ら れ な か っ た 。

2. グ リ ア ジ ン の 性 状 に 対 す る 疎 水 性 相 互 作 用 の 影 響

グ リ ア ジ ン は 強 い 疎 水 性 相 互 作 用 に よ っ て 強 く 会 合 し て い る 。前 述 の 試 験 に お い て 、 グ リ ア ジ ン 会 合 体 か ら ω-グ リ ア ジ ン が 脱 離 す る と 、 そ の 物 性 が 大 き く 変 化 し た 。こ の 様 な 変 化 は 、ω-グ リ ア ジ ン の 脱 離 に よ っ て 、グ リ ア ジ ン 分 子 間 の 疎 水 性 相 互 作 用 が 増 大 し た こ と に よ る も の と 推 察 し た 。

そ こ で 、 表 面 疎 水 性 度 (F.I./mg) を 測 定 し た と こ ろ 、 グ リ ア ジ ン で は 240±4.0 (±SD) を 示 し た が 、ω-グ リ ア ジ ン が 脱 離 す る と 278±6.7 と 有 意 に 表 面 疎 水 性 度 が 上 昇 し た 。さ ら に 、動 的 光 散 乱 装 置 を 用 い て エ タ ノ ー ル 溶 液 に お け る 分 散 状 態 の 粒 子 径 分 布 を 測 定 し た と こ ろ 、ω-グ リ ア ジ ン の 脱 離 に よ っ て 粒 子 の 分 布 は 大 粒 子 側 に シ フ ト し 平 均 粒 子 径 は 214nm か ら 714nm に 変 化 し た 。

こ の こ と か ら 、ω-グ リ ア ジ ン が 脱 離 す る こ と に よ っ て 、グ リ ア ジ ン の 表 面