β-Lg と κ-CN がグリアジンの溶解挙動に与える影響について

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以 上 、β-Lg と κ-CNの 加 熱 複 合 体 は グ リ ア ジ ン と 類 似 し た 溶 出 挙 動 を 示 し た こ と か ら 、 両 者 は 同 様 の 疎 水 性 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、β-Lg お よ び κ-CN を 各 々 加 熱 さ せ た 場 合 は 、と も に 溶 出 挙 動 に 変 化 は み ら れ な か っ た (Fig.24, 25)。 こ の こ と か ら 、β-Lg は κ-CN と 加 熱 複 合 体 を 形 成 す る と 疎水性が高まり、グリアジンとの疎水性相互作用性が強くなることが推察された。

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50 2.4. β-Lg に よ り 水 溶 化 し た グ リ ア ジ ン の 特 定

前 述 の 試 験 の 結 果 、β-Lｇ に よ り グ リ ア ジ ン の 一 部 が 水 溶 化 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 グ リ ア ジ ン は ア ル コ ー ル に 可 溶 化 す る タ ン パ ク 質 の 総 称 で あ り 、 多 く の 異 性 体 が 存 在 す る が 、電 気 泳 動 解 析 や 遺 伝 子 解 析 に よ り 4 つ (α-、β-、 γ-、ω-) の タ イ プ に 分 け ら れ て い る 。 そ こ で 、 ど の グ リ ジ ア ジ ン が 水 溶 化 し た の か 解 析 す る た め SDS-PAGE に 供 し た 。し か し 、多 く の バ ン ド が 検 出 さ れ グ リ ア ジ ン の 特 定 に は 至 ら な か っ た 。 そ こ で 、Acid-PAGE に 供 し た と こ ろ 、 ω-グ リ ア ジ ン と 同 位 置 に ス メ ア バ ン ド が 検 出 さ れ た (Fig.29)。さ ら に 、N 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 解 析 し た と こ ろ 、夾 雑 タ ン パ ク 質 が 多 く 解 析 で き な か っ た 。

そ こ で 、水 溶 化 し た グ リ ア ジ ン を RP-HPLC に て 解 析 し 、文 献 値 (Herbert, 2009; Frances, 2005 ) の 溶 出 パ タ ー ン と 比 較 す る と 、 リ テ ン シ ョ ン タ イ ム 10 分 か ら 22分 に 溶 出 す る ω-グ リ ア ジ ン と 同 位 置 に 特 異 的 な ピ ー ク が 検 出 さ れ た (Fig.30) た め 、 ピ ー ク の 一 部 を 分 取 し N 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 し た 。 取 得 し た N 末 端 配 列 を DDBJ の FASTA に て 相 同 性 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、 Triticum aestivum 由 来 の omega -5 gliadin と 85%の 高 い 相 同 性 を 示 し た (Fig.31)。こ の こ と か ら 、β-Lg の 作 用 に よ り ω-グ リ ア ジ ン が 水 溶 化 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。

次 い で 、RP-HPLC に て 水 溶 化 し た ω-グ リ ア ジ ン 量 (％) を 算 出 し た と こ ろ 、β-Lg 無 添 加 生 地 で は 0.14、β-Lg添 加 で は 0.65 を 示 し た (Table 8)。強 力 粉 の グ リ ア ジ ン に 含 ま れ る ω-グ リ ア ジ ン 量 を 定 量 し た と こ ろ 、 グ リ ア ジ ン の 約 11.5％ が ω-グ リ ア ジ ン で あ っ た (Fig.32, Table 9) た め 、β-Lg の 作 用 に よ り ω-グ リ ア ジ ン の 約 6％ が 水 溶 化 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。

2.5. 各 グ リ ア ジ ン と β-Lg お よ び κ-CN の 分 子 間 相 互 作 用 に つ い て

前 述 の 試 験 の 結 果 、β-Lg と ω-グ リ ア ジ ン が 疎 水 性 相 互 作 用 に よ り 会 合 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。そ こ で 、グ リ ア ジ ン か ら 各 グ リ ア ジ ン を 分 画 し (Fig.33, 34)、β-Lg お よ び κ-CNと 各 グ リ ア ジ ン と の 分 子 間 相 互 作 用 を フ ァ ー ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に て 解 析 し た 。 そ の 結 果 、β-Lg は ω-グ リ ア ジ ン に 対 し て 強 い 陽 性 反 応 を 示 し た (Fig.35)。一 方 、β-Lg と κ-CN の 混 合 加 熱 試 料 も 同 様 に 作 用 さ せ β-Lg 抗 体 と の 反 応 試 験 を 行 っ た と こ ろ 、ω-グ リ ア ジ ン 以 外 の 他 の グ リ ア ジ ン に も 陽 性 反 応 を 示 し た 。 ま た 、κ-CN に お い て も 同 様 に 試 験 し た と こ ろ 、 各 グ リ ア ジ ン と も に 陽 性 反 応 を 示 し た 。

以 上 の こ と か ら 、β-Lg は ω-グ リ ア ジ ン と 疎 水 性 相 互 作 用 し 、そ れ に よ り 、 同 グ リ ア ジ ン を 水 溶 化 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た (Fig.36)。ま た 、β-Lg は κ-CN と 複 合 体 を 形 成 す る こ と で 、κ-CNを 介 し て β-Lg は グ リ ア ジ ン と 会 合 す る こ

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と が 示 唆 さ れ 、 そ れ に よ り 、Fig.26, 27 で 得 ら れ た 様 に ω-グ リ ア ジ ン の 水 溶 化 が 抑 制 さ れ 、 製 パ ン 性 低 下 が 消 失 す る と 考 え ら れ た 。

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2.6. ω グ リ ア ジ ン の 溶 解 性 に 与 え る β-Lg の 影 響

前 述 の 試 験 の 結 果 よ り 、β-Lg は ω-グ リ ア ジ ン と 疎 水 性 相 互 作 用 し 、 同 グ リ ア ジ ン を 水 溶 化 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た た め 、β-Lg が ω-グ リ ア ジ ン の 溶 解 性 に 影 響 を 与 え る の か 検 討 を 行 っ た 。β-Lg 無 添 加 で は ω-グ リ ア ジ ン は エ タ ノ ー ル 濃 度 50、70％ に 溶 解 が み ら れ た (Fig.37A)。グ リ ア ジ ン は 一 般 的 に 70％ エ タ ノ ー ル に 溶 解 す る タ ン パ ク 質 で あ る と 知 ら れ て い る が 、ω-グ リ ア ジ ン は 他 の グ リ ア ジ ン と 比 較 し 、Gln (45～50mol%) が 多 く 局 在 し て い る こ と か ら (Fig.38)、 各 グ リ ア ジ ン の 中 で も 疎 水 性 度 が 低 い と さ れ て お り (Marchylo, 1989)、 こ の 結 果 か ら も ω-グ リ ア ジ ン の 疎 水 性 度 の 低 さ を 確 認 す る こ と が で き た 。 一 方 、β-Lg 存 在 下 に お い て は ω-グ リ ア ジ ン は エ タ ノ ー ル 濃 度 0、10、30、50、70％ 全 て の 画 分 に 溶 解 し 溶 解 性 が 変 化 し た (Fig.37B)。

ω-グ リ ア ジ ン は 、β-Lg の 作 用 に よ り エ タ ノ ー ル 濃 度 0％ つ ま り 純 水 に 溶 解 す る 程 度 に ま で 疎 水 性 度 が 低 下 す る こ と が わ か り 、こ の 作 用 が 製 パ ン 性 阻 害 の 要 因 で あ る こ と が 推 察 さ れ た 。

β-Lgと ω-グ リ ア ジ ン と の 相 互 作 用 に つ い て 現 在 報 告 は な い が 、ω-グ リ ア ジ ン は 各 グ リ ア ジ ン の 中 で 唯 一 シ ス テ イ ン 残 基 を 有 し て お ら ず (Payne, 1985; Shewry, 1983) 疎 水 性 度 が 最 も 低 い こ と か ら 、 水 溶 性 の β-Lg と 相 互 作 用 し や す い も の と 推 察 さ れ た 。 さ ら に 、β-Lg は レ チ ノ ー ル 結 合 タ ン パ ク 質 と 同 じ 機 能 を 持 っ て お り 、 あ る 特 定 領 域 の 疎 水 性 ポ ケ ッ ト (Fig.39) を 介 し て 親 油 性 物 質 を 結 合 し 水 溶 性 複 合 体 を 形 成 す る と の 報 告 が あ る (Fugate, 1980; Futterman, 1972; Papiz, 1986; Spector, 1970 )。 こ の こ と か ら 、 親 水 性 の β-Lgと 疎 水 性 の ω-グ リ ア ジ ン が 水 溶 性 複 合 体 を 形 成 し 、ω-グ リ ア ジ ン を 水 溶 化 さ せ る の で は な い か と 推 察 し た 。

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65 3. 要 約

本 章 で は 、 脱 脂 乳 中 の β-Lg に よ る 製 パ ン 性 低 下 の 要 因 な ら び に β-Lg と κ-CN の 加 熱 複 合 体 に よ る 製 パ ン 性 低 下 作 用 の 消 失 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、β-Lg は 各 グ リ ア ジ ン の う ち 最 も 親 水 性 で あ る ω-グ リ ア ジ ン と 特 異 的 に 疎 水 性 相 互 作 用 に よ り 結 合 す る こ と が 明 ら か に な り 、さ ら に β-Lg は ω-グ リ ア ジ ン と 水 溶 性 複 合 体 を 形 成 し 、そ れ に よ り 、グ リ ア ジ ン 会 合 体 か ら 同 グ リ ア ジ ン を 水 溶 化 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 、β-Lg と κ-CN の 加 熱 複 合 体 で は 、こ の 様 な 現 象 は み ら れ ず グ リ ア ジ ン の 溶 解 性 は 変 化 し な か っ た 。 ま た 、 加 熱 脱 脂 乳 に お け る 製 パ ン 性 の 回 復 は 、 形 成 さ れ た β-Lg と κ-CN の 加 熱 複 合 体 の 疎 水 性 が グ リ ア ジ ン と 同 程 度 で 、 こ の た め 加 熱 複 合 体 が ω-グ リ ア ジ ン を 含 む 他 の グ リ ア ジ ン と 強 い 親 和 性 を 示 す こ と で 、ω-グ リ ア ジ ン の 水 溶 化 が 生 じ ず に 生 地 が 形 成 さ れ た た め と 推 察 さ れ た 。

こ れ ら の こ と か ら 、非 加 熱 あ る い は 低 加 熱 脱 脂 乳 の 添 加 に よ る 生 地 形 成 性 お よ び 製 パ ン 性 の 低 下 は 、ω-グ リ ア ジ ン に β-Lg が 結 合 す る こ と に よ り 、 同 タ ン パ ク 質 が 水 溶 化 す る こ と で 惹 起 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。