血管内皮細胞接着・増殖試験による内皮化促進性評価

ここでは，bFGF を micro-patterned a-C:H/MPC polymer 系に導入した micro-patterned a-C:H/bFGF/MPC polymer と micro-patterned a-C:H/MPC polymer 上における，bFGF 含浸の

HUVECの接着および増殖挙動への効果を評価した．細胞培養条件下において，細胞が増殖

できる足場が不足している状態をコンフルエントと呼ぶ．コンフルエント以降，培養細胞は 継代によって，新たに増殖した細胞が接着できる足場を提供されない場合，細胞内に張力が はたらかず浮き上がり，細胞死をむかえる．したがって，内皮細胞が完全に試料上を被覆し た時点をもって，細胞増殖は止まる．内皮細胞接着および増殖試験は 72 時間まで実施し，

micro-patterned a-C:H/bFGF/MPC polymer の試料表面が完全に内皮化 (内皮細胞による被覆) されることを確認して培養を終了した．これらの試料を観察時間毎に固定し，蛍光顕微鏡

(励起光波長535 nm) にて観察し，Figure 3-10 A–Jに，これら二種類のサンプル上における

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HUVEC接着・増殖試験後の観察画像を示した．

直径20 µm 程度の緑色の粒の一つ一つがHUVECであり，これらの画像において，画像

処理ソフトウェアを使用し，画像視野あたりに緑の領域が占める面積比を算出することで，

試料上における内皮化面積を評価した (Figure 3-11)．第2章に示したように，我々のグルー プにおける先行研究で，HUVECの接着は各サンプル上のmicro-patterned a-C:H上でのみ観 察され，MPC polymer部分には，HUVECは接着しなかった．また，HUVECは培養6時間

後にa-C:H島上に広がり，1つのa-C:H島から別のa-C:H島へ，HUVECが橋渡しするよう

に伸展していき，培養12時間後には，a-C:H島間の溝となっているMPC polymer領域をブ リッジするように伸展する様子が確認された．その結果，HUVECはa-C:H島が存在してい

ないMPC polymer部分を跨いで広がり，最終的には，サンプル表面全体がHUVECで覆わ

れていることが確認された．本研究では，サンプル上のHUVECを蛍光顕微鏡で観察し，低 倍率画像を撮影した．試験開始から72時間後，micro-patterned a-C:H/bFGF/MPC polymerと

micro-patterned a-C:H/MPC polymerの両サンプル表面は，ほぼ全面がHUVECで覆われてい

た．その結果，micro-patterned a-C:H/bFGF/MPC polymer 上のHUVEC による表面被覆速度 は，micro-patterned a-C:H/MPC polymer上の被覆速度よりも速かった．

また，WST-8 assayによって生存細胞の数を解析することにより，細胞増殖速度の差を定 量的に評価した (Figure 3-12)．グラフ内の縦軸は，細胞播種後の吸光度を示しており，大き い値であるほど生存細胞が多いことを示している．12 時間後までは細胞増殖に差はなかっ たが，24時間後には，micro-patterned a-C:H/bFGF/MPC polymer上のHUVEC数は，a-C:H/MPC

polymerのa-C:Hで覆われた領域上のHUVEC数よりも有意に増加したことが示された．こ

れらの結果は，HUVECの増殖は，micro-patterned a-C:H/MPC polymerサンプルへのbFGFの 含有によって差が出たことを示す．

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Figure 3-10 Representative fluorescence microscopic images of the adherent HUVEC at 6, 12, 24, 48, and 72 hours: (A–E) micro-patterned a-C:H/MPC polymer and (F–J) micro-patterned a-C:H/bFGF/MPC polymer and the scale bars indicate 200 µm. The scale bar indicates 50 µm.

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Figure 3-11 Endothelial cell adhesion area ratio of each sample surface by the fluorescence microscopy. * indicates p values < 0.05. The error bars indicate the standard deviation (n = 3).

Figure 3-12 HUVEC proliferation was analyzed using a WST-8 assay. * indicates p values < 0.05.

The error bars indicate the standard deviation (n = 3).

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