落射型蛍光顕微鏡

オランダのプローエム（J. S. Ploem, 1927-）は、短 波長を反射し長波長を透過するダイクロイックミラー

（dichroic mirror）を組み込んだ落射蛍光照明法を 1967 年に発表し ^27）、間もなくライツ社は 4 種の励起ユニッ トを回転により簡単に切り換えできる落射蛍光装置を PLOEMOPAK の商品名で発売した。この落射型蛍光 照明方式は、透過型に比べ多くの利点をもっていた。

1）対物レンズがコンデンサを兼ね、励起照明の NA と照明範囲が対物レンズの NA と観察範囲に一致 するため、明るく高解像の蛍光像が得られ、また退 色（励起光により蛍光の強度が徐々に落ちる現象）

も限定的となる。

2）透過型では、グリセリンのような粘度の高い浸液 を暗視野コンデンサ側にも使うため、使い勝手は良 くなかったが、落射型では対物レンズ側のみのため かなり改善される。

一方で落射型の場合、対物レンズに直接励起光が照 射されるので、対物レンズ自体の自家蛍光を小さくし ないと、蛍光像の背景が明るくなりコントラストを落 とす。このため無蛍光ガラス材料による対物レンズが 必須となる。

また蛍光の明るさを高めるためには色収差の少ない 高 NA 対物レンズが望まれる。こうした課題を乗り 越えて各社で開発された落射蛍光顕微鏡は、その後の 蛍光顕微鏡の主流となり現在に至っている。

次に図 5.31 に基づき、落射蛍光顕微鏡の構成を説 明する。落射照明装置は、鏡基と鏡筒の間に配置され る。光源から出た光は、励起波長を選択する励起フィ ルタ Exciting filter を通り、ダイクロイックミラーで 反射され対物レンズにより標本を照射（励起）する。

励起された標本から発した蛍光は、対物レンズを通り ダイクロイックミラーを透過する。この時点で励起光 の大部分はカットされるが、このあとさらに吸収フィ ルタ Barrier filter を通ることによって、蛍光のみが

図 5.31　落射蛍光顕微鏡の構成図^1）

結像光線となり、観察・記録される。励起光の波長 は、標本や蛍光色素によって選択する。光源は主に超 高圧水銀灯が使われてきたが、光学系の改良や撮像素 子感度の向上により、幅広い波長帯域をもつキセノン ランプも使われることが多くなっている。両者の分光 特性を図 5.32 に示す。主な励起法の種類としては、U

（365nm）、V（405nm）、BV（436nm）、B（490nm）、

G（546nm）などがある（カッコ内は主励起波長）。

図で点線で囲んだ励起フィルタ、ダイクロイックミ ラー、吸収フィルタの組合せはキューブ（図 5.33）と してユニットになっており、各種励起法に対応して 組み合わせと切り替えが容易にできるようになって いる。図 5.34 に U、V、B、G 各励起の励起フィルタ

（EX）、ダイクロイックミラー（DM）、吸収フィルタ

図 5.32　超高圧水銀灯とキセノンランプの分光特性^4）

図 5.33　蛍光キューブ群^4） 図 5.34　各励起法の分光特性^1）

（BA）の特性を、図 5.35 に U、B、G 各励起による蛍 光像の写真を示す。最近は干渉フィルタ技術の発達に より、それぞれの複数の波長を反射・透過させる特性 をもったものが製造できるようになり、異なる蛍光色 素に対する二重励起や三重励起と蛍光の同時観察が可 能になっている（図 5.36）。

図 5.35　蛍光顕微鏡各励起法による写真^1）

a）U 励起　b）B 励起　c）G 励起

図 5.36 a） U、B、G 励起の 3 バンド励起フィルタ（青）、

ダイクロイックミラー（緑）、吸収フィルタ

（赤）の分光特性^4）

b） U（DAPI 染色：細胞核）、B（FITC 染色：微 小管）、G（TRITC 染色：アクチンフィラメ ント）の三重励起蛍光写真^1）

a）

b）

c）

a）

b）

国産の落射蛍光装置は、1973 年にオリンパスより バノックス（AH）の付属ユニットとして発売された のが最初である（図 5.37）。対物レンズは比較的自家 蛍光の少ない種類が選別された。また油浸液は、独自 開発のシリコーンオイル（グリセリンに比べ粘度が低 く使いやすい）を採用した専用の 100 倍対物レンズも 開発された。1976 年には、日本光学より落射蛍光専 用鏡基フルオフォト（Fluophot：図 5.38）も蛍光専 用の CF UV-F 対物レンズ（図 7.22d））と共に発売さ れた。こうして、リサーチ分野を中心に蛍光顕微鏡の ウェイトが高まると、落射蛍光装置を内蔵した生物顕 微鏡がラインアップされるようになってきた。図 5.39 は、オリンパスが 2010 年に発売した BX63 である。

図 5.37　オリンパス 落射蛍光装置 AH-RFL ^4）

図 5.38　ニコン フルオフォト^17）

図 5.39　オリンパス BX63 ^4）