総論

ニコチンアミド誘導体および3種類の配位様式を有するバナジル錯体の合成を行い、U937 細胞株に対して細胞増殖阻害能およびアポトーシス誘導活性を評価した。

第二章では、ベンゼン環に水酸基およびメトキシ基およびチロシンを有するニコチンア ミド誘導体およびニコチンアミドにドーパミンおよびノルアドレナリンを有する化合物を 合成した。ニコチンアミド誘導体は、末端のベンゼン環の2,3位に水酸基を有する化合物と 2位に水酸基と4位にメトキシ基を有する化合物のU937細胞に対する高い細胞増殖阻害活 性を示した。以前の山口の報告では、水酸基の数が細胞増殖阻害活性に影響する一つの要 因と示唆されたが、アミノ基を変換することにより、水酸基の数と置換位置が活性に重要 であることが明らかになった。活性の高かった化合物は、アネキシン V 染色および断片化 したDNA が電気泳動より観察されたために、U937 細胞株に対するアポトーシスの誘導活 性が明らかになった。

第三章では、様々な配位子を有するバナジル錯体について合成を行い、それらのアポト ーシス誘導活性を評価した。O₄配位様式、N₂O₂配位様式、S₂O₂配位様式を有するバナジル 錯体について細胞増殖阻害活性を評価すると、長鎖のアルキル鎖を有するバナジル錯体の 疎水性が活性に強い影響を与えることが明らかになった。U937細胞株に対する細胞増殖阻 害活性は、1) 置換位置および 2) 化合物の疎水性に影響を与えることが明らかになった。

化合物の疎水性と活性の関係について検討するために、より長鎖をもつピリジノンおよび キノリン錯体を合成した。合成した錯体に対してESR スペクトルの測定により、4 価のバ ナジウム錯体に特徴的な8本の超微細分裂が観測された。HPLCを用いてリテンションタイ ムから錯体の分配係数を算出した。合成した化合物において細胞増殖阻害能を評価すると、

ピリジノンが配位子の場合では、アルキル鎖の長さと活性に直線関係があることが明らか となったがみられた。このことから疎水性が活性を高める要因の一つであることが推測さ

64

れた。ピリジノン配位子にデシル基を導入したバナジル錯体のアポトーシス誘導活性は、

カスパーゼ非依存性であることは示唆された。

合成した化合物に対して IC₅₀値を評価した結果、ニコチンアミド誘導体において最も高 い細胞増殖阻害活性を示した化合物では、アポトーシス誘導活性の報告されている EGCG よりも活性が高く、バナジル錯体では、デシル基を持つピリジノン錯体が最も細胞増殖阻 害活性が高かった。

これらの研究を通して、アポトーシス誘導活性を示す抗がん剤の化合物候補を提供するこ とができた。

65

補遺 ニコチンアミド誘導体の測定データ

ClH₃N CO₂Me

R

N O

O O

N Et₃N, dry THF

N NH O

R CO₂Me H₂N

CO₂Me

R dry MeOH SOCl₂

1

2

a: R =

OH I

b: R =

OH OH

c: R =

OH I I

ClH₃N

OH OH

N O

O O

N Et₃N, dry THF

N N H O

OH OH 4

H₂N

OH OH

N O

O O

N N

NH O

OH OH

OH OH

5 THF

66

実験項

3-ヨード-L-チロシンメチルエステル塩酸塩 (1a)

乾燥メタノール (10 mL) を-10°Cに冷やし、塩化チオニル (1.6 mL) 加えた。10分間撹拌し た後、3-ヨード-L-チロシン (2.02 g, 6.6 mmol) を加え、48時間撹拌した。減圧留去後、精 製せずに次の反応を行った。

白色固体, 1.70 g (quant.)

化合物1b-cも化合物1aと同様な方法で得た。

3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩 (1b)

白色固体, 収率 定量的

3,5-ジヨード-L-チロシンメチルエステル塩酸塩 (1c)

白色固体, 収率 定量的

N-ニコチノイル-3-ヨード-L-チロシンメチルエステル (2a)

THF (100 mL) とメタノール (5 mL) に、3-ヨード-L-チロシンメチルエステル塩酸塩 (7a) (319 mg, 1.4 mmol) とニコチン酸無水物 (613 mg, 1.6 mmol) を加え、THF (10 mL) に溶かし たEt₃N (3 mL, 21.5 mmol) を0 °Cで滴下し、その溶液を室温で 24時間撹拌した。反応液を 吸引濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、水 (50 mL) を加えて酢酸エチル (100 mL) で抽出し た。有機層を飽和食塩水 (50 mL) で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去 後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒; クロロホルム/メタノ ール = 6/1) で精製し、8aを白色固体として得た (250 mg, 42%)。

mp: 194.2°C (decomp.). IR(KBr): 3276, 2917, 1742, 1649, 1598, 1506, 1298, 704 cm^-1. ¹H-NMR (DMSO) δ: 2.28-3.07 (2H, m), 3.64 (3H, s), 4.58 (1H, m), 6.76 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.10 (1H, d, J =

67

8.0 Hz), 7.51 (1H, dd, J = 4.8 and 8.0 Hz) 7.61 (1H, s), 8.12 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.71 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.93 (1H, s), 9.05 ppm (1H, s), 10.7 (1H, s). Anal. Calcd for C₁₆H₁₅IN₂O₄: C, 45.09; H, 3.55; N, 6.57. Found: C, 45.17; H, 3.29; N, 6.55.

化合物2b-cも化合物2aと同様な方法で得た。

N-ニコチノイル-3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニンメチルエステル (2b)

白いアモルファス, 収率22%. IR(KBr): 3358, 2959, 1737, 1649, 1597, 1528, 1286, 704 cm^-1.

1H-NMR (DMSO) δ: 2.28-3.00 (2H, m), 3.63 (3H, s), 4.55 (1H, m), 6.51 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.60 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.66 (1H, s, J = 8.5 Hz), 7.51 (1H, dd, J = 4.8 and 8.1 Hz), 8.13 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.71 (1H, d, J = 6.3 Hz), 8.94 (1H, s). Anal. Calcd for C₁₆H₁₆N₂O₅･0.3H₂O: C, 59.73; H, 5.20;

N, 8.71. Found: C, 59.84; H, 5.14; N, 8.76.

N-ニコチノイル-3,5-ジヨード-L-フェニルアラニンメチルエステル (2c)

白色固体, 収率 12%. mp: 172.8°C (decomp.). IR(KBr): 3306,2926, 1737, 1643, 1598, 1467, 1300, 807 cm^-1. ¹H-NMR (DMSO) δ: 2.86-3.07 (2H, m), 3.65 (3H, s), 4.59 (1H, m), 7.51 (1H, dd, J = 4.6 and 7.9 Hz), 7.66 (1H, s), 8.11 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.71 (1H, d, J = 4.6 Hz,), 8.93 (1H, s), 9.03 (1H, s). Anal. Calcd for C₁₆H₁₄I₂N₂O₄･0.8 H₂O: C, 33.92; H, 2.78; N, 4.94. Found: C, 33.62; H, 2.44; N, 4.66.

N-ニコチニル-L-チロシンメチルエステル (3)

THF (100 mL) に、L-チロシンメチルエステル塩酸塩 (2.86 g, 12 mmol) とニコチン酸無水 物 (2.55 g, 11 mmol) を加え、25 mLのTHFに溶かしたEt₃N (1.45 g, 14 mmol) を0°Cで滴下 し、その溶液を室温で2.5時間撹拌した。反応液を吸引濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、水

68

(50 mL) を加えて酢酸エチル (200 mL) で抽出した。有機層から溶媒を減圧留去し、3を白

色の固体として得た (3.10 g , 93%)。

mp 122.7-123.8°C. IR (KBr): 3343, 2947, 1742, 1641, 1596, 1524, 1368, 1321, 1223, 700 cm^-1.

1H-NMR (CDCl₃) δ: 3.13-3.26 (2H, m), 3.80 (3H, s), 5.06 (1H, dt, J = 7.8 and 5.4 Hz), 6.61 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.76 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.98 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.41 (1H, dd, J = 4.8 and 7.8 Hz), 8.10 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.76 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.89 (1H, s). Anal. Calcd for C₁₆H₁₆N₂O₄･0.1H₂O:

C, 63.61; H, 5.40; N, 9.27. Found: C, 63.42; H, 5.46; N, 9.06.

N-ニコチノイルドーパミンの合成 (4)

ドーパミン塩酸塩 (541 mg, 2.8 mmol) にTHF (100 mL) とニコチン酸無水物538 mg (2.7 mmol) を加え、Et₃N (304 mg, 3.0 mmol) とTHF (20 mL) を0°Cで滴下し、室温で20時間撹 拌した。反応液を吸引濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、水 (30 mL) を加えた後に酢酸エチ ル (20 mL) で抽出した。有機層を飽和食塩水 (50 mL) で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで 乾燥した。溶媒を留去後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒;

クロロホルム/メタノール = 20/1) で精製し、4 を白色の固体として得た (120 mg, 20%)。

mp 197-198 ºC. IR (KBr): 3480, 3312, 3074, 1636, 1539, 1371, 1292, 1200, 703 cm^-1. ¹H-NMR (CD₃OD) δ: 2.75 (2H, m), 3.55 (2H, m), 6.54-6.56 (1H, m), 6.67-6.68 (2H, s), 7.51 (1H, dd, J = 4.8 and 7.9 Hz), 8.18 (1H, d, J =7.9 Hz), 8,65 (1H, d, J = 4.9 Hz), 8.80 (1H, s). Anal. Calcd for C₁₄H₁₄N₂O₃: C, 65.11; H, 5.46; N, 10.85. Found: C, 65.24; H, 5.55; N, 10.83.

N-ニコチノイルドーパミンの合成 (5)

ノルアドレナリン (352 mg, 2.1 mmol) とニコチン酸無水物 (508 mg, 2.2 mmol) を、THF

(60 mL) とMeOH (20 mL) で溶解し、室温で20時間撹拌した。溶媒を留去後、エタノール

で再結晶することにより、5を白色の固体として得た (208 mg, 37%)。

69 0

20 40 60 80 100

Viability (%)

0 20 40 60 80 100

DMSO EGCG 3 7a 7b 7c

mp 194.9 °C (decomp.). IR (KBr): 3295, 1640, 1543, 1368, 1291, 704 cm^-1. ¹H-NMR (CDCl₃) δ:

3.53-3.55 (2H, m), 4.74 (1H, dd, J =5.6 and 7.3 Hz), 6.72-6.73 (2H, m), 6.85 (1H, s), 7.52 (1H, dd, J

= 4.8 and 7.8 Hz), 8.19 (1H, m), 8.66 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.82 (1H, s). Anal. Calcd for C₁₄H₁₄N₂O₄: C, 61.31; H, 5.14; N, 10.21. Found: C, 61.43; H, 5.11; N, 10.19.

培養細胞

U937細胞は、10% FBSと5%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地中で

5% CO₂、37°C条件下で培養した。

U937細胞の生存率の測定

12穴培養プレートに0.2×10⁶ cellsに調整したU937細胞を1穴につき760 L分注し、化 合物を培地中で最終濃度88 Mとして添加した。化合物添加後、5% CO₂、37°Cで48時間 培養し、トリパンブルーの染色することにより生存細胞の数を測定した。

DMSO EGCG 3 2a 2b 2c

図1. 化合物で処理したU937細胞の生存率 (%). DMSO をコントロールとし、化合 物 88M 投与後 48 時間後の生存率を示す。有意差の検定は、Student's t-test で行 い，*P <0.05 のとき有意差があるとした。グラフは、3回投与実験を行い、それぞ れ1回測定を行った。

70 0

20 40 60 80 100

Viability (%)

0 20 40 60 80 100

図2. 化合物で処理したU937細胞の生存率 (%). DMSO をコントロールとし、化合 物 88 M 投与後 48 時間後の生存率を示す。有意差の検定は、Student's t-test で行 い，*P <0.05 のとき有意差があるとした。グラフは、3回投与実験を行い、それぞ れ1回測定を行った。

DMSO EGCG 4 5

71

251.693

20 mT

271.693 291.693 311.693 331.693 351.693

32b

371.693 391.693

251.693

20 mT

271.693 291.693 311.693 331.693 351.693 371.693 391.693

32c

251.693

20 mT

271.693 291.693 311.693 331.693 351.693 371.693 391.693

32a 補遺 オキソバナジウム錯体の ESR スペクトル

図3. 1eのESRスペクトル 図2. 1dのESRスペクトル

図1. 1cのESRスペクトル

72

251.693

20 mT

271.693 291.693 311.693 331.693 351.693

28b

371.693 391.693

251.693 271.693 291.693 311.693 331.693 351.693 371.693 391.693

28 ｃ 20 mT

28c

251.693

20 mT

271.693 291.693 311.693 331.693 351.693

２９ a

371.693 391.693

図4. 3bのESRスペクトル

図5. 3cのESRスペクトル

図6. 3fのESRスペクトル

73

251.693

20 mT

271.693 291.693 311.693 331.693 351.693 371.693 391.693

251.693251.693 271.693271.693 291.693291.693 311.693311.693 331.693331.693 351.693351.693 371.693371.693 391.693391.693

20 mT 20 mT

29c

図7. 3gのESRスペクトル

図8. 3hのESRスペクトル

74

発表状況

審査付き論文

Synthesis of Nicotinamide Derivatives Having a Hydroxy-Substituted Benzene Ring and the Influence of Their Structures on the Apoptosis-Inducing Activity Against Leukemia Cells

Tomoko Yamaguchi, Yuriko Matsumura, Takuya Ishii, Yoshikazu Tokuoka, and Keisuke Kurita Drug Development Research, 72 (3), 289-297 (2011).

Synthesis of Oxovanadium Complexes and Their Apoptosis-Inducing Activity in Leukemia Cells

Tomoko Yamaguchi, Shinya Watanabe, Yuriko Matsumura, Yoshikazu Tokuoka, and Akihiro Yokoyama Chemical & Pharmaceutical Bulletin 印 刷 準 備 中

Oxovanadium complexes with quinoline and pyridinone ligands: syntheses of the complexes and effect of alkyl chains on their apoptosis-inducing activity in leukemia cells

Tomoko Yamaguchi, Shinya Watanabe, Yuriko Matsumura, Yoshikazu Tokuoka, and Akihiro Yokoyama Bioorganic & Medicinal Chemistry 投 稿 中

学会発表

Synthesis of oxovanadium(IV) complexes from hydroxyazine-type heterocycles and their apoptosis-inducing activity against leukemia cells

Tomoko Yamaguchi, Yuriko Matsumura, Takuya Ishii, Yoshikazu Tokuoka, and Keisuke Kurita The 17th International SPACC Symposium, (Kagoshima) 2010.

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Synthesis and apoptosis-inducing activities of oxovanadium(IV) complexes

Tomoko Yamaguchi, Yuriko Matsumura, Keisuke Kurita, Takuya Ishii, Yoshikazu Tokuoka Pacifichem 2010, (Honolulu, Hawaii) 2010.

Apoptosis-Inducing Activity of Oxovanadium(IV) Complexe with Pyridinone Ligands against Leukemia Cells: Synthesis and Effect of Long Alkyl Side Chain

Tomoko Yamaguchi, Yuriko Matsumura, Shinya Watanabe, Ysoshikazu Tokuoka, and Akihiro Yokoyama

The 18th International SPACC Symposium, (Whistler, Canada) 2011.

ヒドロキシアジン系複素環－オキソバナジウム錯体の合成とそれらのアポトーシス誘導活 性

山口智子・栗田恵輔・松村有里子・石井琢也・徳岡由一 日本化学会 第90春季年会 (大阪) 2010

ピリジノンとキノリン配位子を有するオキソバナジウム錯体の合成とカスパーゼ非依存型 アポトーシス誘導活性

山口智子・渡部信也・松村有里子・徳岡由一・横山明弘 第41回複素環化学討論会 (熊本) 2011

ドキュメント内 アジン系複素環の合成とそれらのアポトーシス誘導活性に関する研究 (ページ 65-78)