研究2. OSCC細胞株におけるPAR1の発現と機能に関する研究 2-1. OSCC 細胞株におけるPAR1、thrombin およびΔNp63 の発現
研究 1 より、OSCC 浸潤先端部で PAR1 および thrombin の発現は強く、Δ Np63 の発現は減弱していた。そこで OSCC 細胞においても同様の傾向がある かを RT-PCR 法にて検索した。
⾼転移株 SQUU-B 細胞では、ΔNp63 の発現は低く、PAR1 と thrombin の発 現は⾼かった。⼀⽅、低転移株や SQUU-BO 細胞では、ΔNp63 の発現が⾼い ものの、PAR 1 と thrombin の発現は低かった。このように、浸潤先端部の発現 様式と同様に、OSCC 細胞株においても PAR1 および thrombin の発現は、Δ Np63 の発現と逆相関していた（図 4）。
図4. OSCC 細胞株ならびにヒト正常⾓化上⽪細胞におけるΔNp63、PAR1および thrombinの発現（RT-PCR法）
⾼転移株 SQUU-B 細胞では、ΔNp63 の発現は低く、PAR1 と thrombin の 発現は⾼い。⼀⽅、低転移株や SQUU-BO 細胞では、ΔNp63 の発現が⾼いも のの、PAR 1 と thrombin の発現は低い。
-3 2 6
1 1
2-2. ΔNp63ノックダウンがPAR1およびthrombinの発現に与える影響
2-1 の結果より、ΔNp63 の発現は PAR1 および thrombin の発現と逆相関し ていたことから、転写因⼦であるΔNp63 が PAR1 と thrombin の制御している かを検討した。SQUU-A 細胞にΔNp63 siRNA を導⼊し、real-time PCR 法にて PAR1 と thrombin の発現を検索したところ、ΔNp63 のノックダウンにより PAR1 および thrombin の発現が有意に亢進していた（図 5）。
図5. ΔNp63ノックダウンによるPAR1およびthrombinの発現（real-time PCR法）
SQUU-A細胞を使⽤し、ΔNp63をノックダウンするとPAR1、thrombinの発現は有意 に増強している。グラフは独⽴して⾏った3回のデータの平均および標準偏差を⽰す。
なお、統計処理にはMann-Whitney U 検定を⽤いている（*p<0.05）。
siCtrl: scrambled siRNA導⼊SQUU-A細胞。
siΔNp63: ΔNp63 siRNA 導⼊ SQUU-A 細胞。
1 2
4 1
1 2 1 2
3 20.
3
2-3. PAR1 ノックダウンによる EMT 関連遺伝⼦の発現変動
2-2 の結果より、ΔNp63 ノックダウンにより PAR1 の発現が増強することを
⽰したが、PAR1 と EMT との関連性については明らかになっていない。そこで SQUU-B 細胞に PAR1 siRNA を導⼊し、上⽪系マーカー、間葉系マーカーおよ び EMT 関連遺伝⼦の発現変動について real-time PCR 法にて検索した。その結 果、PAR1 のノックダウンにより、上⽪系マーカーである E-cadherin、CK5、
CK14 の発現量は増加したが、間葉系マーカー（vimentin、N-cadherin、
fibronectin）と EMT 関連遺伝⼦（ZEB1、ZEB2、snail、slug、twist）の発現量 は減少した（図 6）。
図6. PAR1ノックダウンによるEMT関連遺伝⼦の発現変動
SQUU-B細胞にPAR1 siRNAを導⼊すると、上⽪系マーカー（E-cadherin、CK5、CK14）
の発現は有意に増強しており、間葉系マーカー（vimentin、N-cadherin、fibronectin）
およびEMT関連遺伝⼦（ZEB1、ZEB2、snail、slug、twist）の発現が有意に減弱してい る。グラフは独⽴して⾏った3回のデータの平均および標準偏差を⽰しており、対照群 の相対的発現量に対する統計学的有意差を⽰す。なお、統計処理にはMann-Whitney U 検定を⽤いている（*p<0.05）。
siCtrl: emptyベクターを導⼊したSQUU-B細胞。
siPAR1: PAR1 siRNAを導⼊したSQUU-B細胞。
ECEC
- . 20 4 8
20 4 8
A8 4 8 581 42 8
08 6 B8
EC
8 8- . 8 8- . 8 8- . 8 8- .
8 8- .
8 8- .
8 8- .
8 8- .
8 8- . 8 8- . 8 8- . 8 8- .
EC EC ECECECECEC EC EC
2-4. PAR1 ノックダウンが遊⾛能および浸潤能に与える影響
2-3 の結果より、PAR1 の発現増強が EMT の誘導に関与していることが⽰唆 されたため、次に PAR1 の発現変動が OSCC 細胞の運動能に与える影響につい て検討した。PAR1 の発現が最も⾼かった SQUU-B 細胞に PAR1 siRNA を導⼊
し、wound healing assay にて解析を⾏った。間隙形成から 24 時間後に間隙を計 測したところ、コントロール群と⽐較して PAR1 をノックダウンした細胞では 遊⾛能が有意に抑制されていた（図 7）。また、MatrigelTM invasion assay にお いても、PAR1 のノックダウンにより SQUU-B 細胞の浸潤能が有意に抑制され た（図 8）。
図 7. PAR1 ノックダウンが OSCC 細胞の遊⾛能に与える影響
（a）顕微鏡像。（b）間隙縮⼩率。PAR1 siRNA 導⼊群の遊⾛能は、対照群と⽐較して 有意に低下している。グラフは、独⽴して⾏った 3 回のデータの平均値及び標準偏差を
⽰す。なお、統計処理には Mann-Whitney U検定を⽤いている（*p<0.05）。scale bars:
50 μm。
図 8. PAR1 ノックダウンが OSCC 細胞の浸潤能に与える影響
（a）浸潤細胞の顕微鏡像（HE 染⾊）。（b）浸潤細胞率。PAR1 siRNA 導⼊群の浸潤 能は、対照群と⽐較して有意に低下している。グラフは、独⽴して⾏った 3 回のデータ の平均値及び標準偏差を⽰す。なお、統計処理には Mann-Whitney U 検定を⽤いてい る（*p<0.05）。scale bars: 100 μm。