細胞壁生合成に関わる L -Fuc 転移酵素の発現

A. thaliana キシログルカンL-Fuc転移酵素 At2g03220（AtFUT1）は、30 days長日条件で 生育した野生型株のロゼッタ葉より、ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System (Promega) を 用いて調製したトータルRNAを、SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen) を用いて逆転 写し、調製したcDNAをテンプレートとし、PCRにより増幅した。PCRには、KOD-Plus-Neo (TOYOBO) を用い、AtFUT1-Nde I (5’- GGGCATATGGATCAGAATTCGTACAGGAGAAG -3’、

pGEM T-easy-AtFUT1NAを作製した。シーケンス解析を行った後、pGEM T-easy-AtFUT1NA を、Nde I及びApa Iで制限酵素処理を行い、目的バンドを精製した後、Nde I及びApa Iで 制限酵素処理した、S. pombe発現用ベクターpREP1-myc Hisに、Ligation high Ver. 2 (TOYOBO) を用いてライゲーションし、pREP1-AtFUT1-MHを作製した。pREP1-AtFUT1-MH を用い、

リチウムアセテート法[117]により、S. pombe ARC039株を形質転換した。形質転換体の選抜 は、MM-leu（+Thi）培地（MM-leu培地に、終濃度15 µMのチアミンを添加した培地。MM-leu 培地の組成については、3.2.5.参照。）で行った。得られた形質転換体を、MM-leu (+Thi) 培 地100 mL、120 rpm、30˚Cで36 hr培養した後、MM-leu培地200 mLで洗浄した。洗浄後の 菌体を、MM-leu培地 100 mLに移し、120 rpm、30˚Cで20 hr培養し、発現誘導を行った。

誘導後の菌体を 3,000 × g、5 min 遠心し集菌した後、得られた菌体を氷冷した 100 mM

HEPES-NaOH pH 7.0で洗浄した。菌体と等量のガラスビーズを用い、3 mLの菌体破砕バッ

ファー (100 mM HEPES-NaOH pH 7.0, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA, プロテアーゼインヒビタ ー EDTA free (Roche)) 中で7.5 min ボルテックスし、破砕した。破砕溶液を、4˚C、8,000 ×

g, 20 min遠心し、ガラスビーズ、未破砕細胞、細胞破砕片を除去した。破砕上清は、さらに

10,000 × g, 1 hr遠心し、ミクロソーム画分を回収した。回収したミクロソーム画分は、菌体

破砕バッファー300 µLに再度懸濁した後、終濃度0.1% (v/v) になるよう、Triton X-100を加 え、氷上で30 min静置することで、permeabilized enzyme solutionを調製した。

3.2.8. キシログルL-Fuc転移酵素AtFUT1の活性測定

C 末端側に、c-mycタグ、6 × Hisタグを融合させ、S. pombe で発現させたAtFUT1 は、

Urbanowicz et al.の手法[82]を参考に、酵素反応を行った。基本的な酵素反応溶液組成を以下

に示す。

なお、XLLG は市販されているノナサッカリド（東京化成工業、Tokyo、Japan）を用いた。

酵素反応は25˚C、任意の時間行い、100˚Cで3 minボイルし酵素反応を停止した。酵素反応 停止後のサンプルは、15,000 × g、10 min遠心した後、2.5 mL のメタノールで活性化し、

Millipore Q waterで平衡化したSep-Pak C18カートリッジ（360 mg Sorbent per Cartridge、

Waters Associates, Milford Mass, USA）に上清をアプライした。その後、1.5 mLのMillipore Q

waterで洗浄し、素通り画分を回収し、凍結乾燥した。

3.2.9. 酵素反応産物の解析

酵素反応産物は、MALDI-TOF MSもしくはHPLCで解析した。MALDI-TOF MSによる解 析は、コットンを用いたHILIC SPE[130]により粗精製を行った後、3.2.5.2.にて述べた条件で 解析を行った。HPLCによる分析は、まずDowex 50 (H⁺ form) により脱塩を行った後、2-ア ミノピリジンで標識を行った。Dowex 50 (H⁺ form) をサンプルがpH 2.0 以下になるまで懸 濁した後、5カラムボリュームのMillipore Q waterで洗浄した。素通り画分を凍結乾燥し、

Hase et al.の手法[132]を参考に、PA化試薬5 µLを用い、PA標識した。水飽和フェノール/

クロロホルム（1:1, v/v）を用い、余剰PA化試薬を除去し、HPLCにより酵素反応産物を解

AtFUT1酵素反応溶液

HEPES-NaOH pH 7.0 75 mM

GDP-L-Fuc/L-Gal 1 mM

XLLG 1 mM

Permeabilized enzyme solution 200 µL/mL

3.2.10. 単糖組成分析

単糖組成分析は、Ohashi et al.の手法[133]を参考に行った。分取した酵素反応により生成 されたピークを、100 µL 4 M HClで酸加水分解した。酸加水分解を100˚C、3 hr行い、凍結 乾燥した後、100 µLのMillipore Q water、30 pmolのD-リボースを内標準として加え、再度 凍結乾燥した。凍結乾燥を2回繰り返した後、40 µLのピリジン/メタノール（1:9, v/v）、10 µL の無水酢酸を用い、室温30 minインキュベートすることで、N-アセチル化を行った。N-ア セチル化後のサンプルは、凍結乾燥し、Hase et al.の手法[132]を参考に、PA化試薬7µLを用 い、PA標識した。PA標識したサンプルは、以下の条件でHPLC分析を行い、各単糖-PAの ピーク面積と比較することで、構成糖の比率を算出した。

【HPLC解析条件】 Hitachi LaChrom 2000

Column: TOSOH Sugar AXI (4.6 × 150 mm, TOSOH)

Solvent: アセトニトリル:0.5 M H3BO3-KOH pH 9.0 (1:9, v/v) Flow rate: 0.4 mL/min (isocratic)

Detection: Fluorescence Ex: 310 nm, Em: 380 nm Temperature: 65˚C